三拗汤原名“还魂汤”，出自《金匮要略》，由麻黄、苦杏仁、甘草3味药物组成，麻黄为君，杏仁为臣，甘草为佐使，系由《伤寒论》麻黄汤去桂枝而成，主治感冒风邪、鼻塞声重、咳嗽痰多、头痛目眩等外感风寒咳嗽证^[1]。由于传统的汤剂口服剂量大，服用不方便，故拟改成新剂型缓释片，经原方提取后的药液浸膏得率大，制剂成型困难，故采用大孔树脂对提取液进行分离纯化^{[2, 3, 4, 5, 6, 7]}，以盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷和甘草酸的吸附率和解析率为考察指标，运用多指标综合分析，构建中药复方多指标成分评价体系方法，为进一步的制剂成型打下基础。

1 仪器与材料

Waters e2695高效液相色谱仪，包括在线脱气机、自动进样器、柱温箱、2998紫外检测器；十万分之一电子分析天平，Mettler Toledo公司；Anke TGL-16G型离心机，上海安亭科学仪器厂。

盐酸麻黄碱对照品（批号171241-201007，质量分数99.8%）、盐酸伪麻黄碱对照品（批号171238- 201207，质量分数99.8%）、苦杏仁苷对照品（批号820-200002，质量分数93.4%）、甘草酸铵对照品（批号110731-200511，质量分数93.1%），均由中国食品药品检定研究院提供；乙腈、甲醇为色谱纯，水为超纯水，磷酸为分析纯。麻黄、苦杏仁、甘草均由亳州市京皖中药饮片厂提供，经南京中医药大学刘圣金教授鉴定，麻黄为麻黄科麻黄属植物草麻黄Ephedra sinica Stapf. 的草质茎；苦杏仁为蔷薇科杏属植物山杏Prunus armeniaca L. var. ansu Maxim. 的干燥成熟种子；甘草为豆科甘草属植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch. 的干燥根和根茎；大孔树脂（D-101、HPD100、HPD300、AB-8、XAD-7、ADS-17、HPD500、HPD600）均由沧州宝恩吸附材料科技有限公司提供。

2 方法与结果 2.1 HPLC同时测定盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷和甘草酸铵 2.1.1 色谱条件

色谱柱为Kromasil 100-5-C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱，体积流量1.0 mL/min，进样量10 μL，柱温30 ℃，盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷在208 nm波长下检测，甘草酸铵在250 nm波长下检测，色谱图见图 1。

2.1.2 标准曲线绘制

取盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷和甘草酸铵对照品适量，精密称定，加甲醇制成含盐酸麻黄碱43.7 μg/mL、盐酸伪麻黄碱42.9 μg/mL、苦杏仁苷202.1 μg/mL和甘草酸铵203 μg/mL的混合对照品溶液，以进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归；得盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷和甘草酸铵回归方程分别为Y＝2.4×10⁶ X－9 575，r＝0.999 5，线性范围87.4～874.0 ng；Y＝2.5×10⁶ X－21 735，r＝0.999 5，线性范围85.8～858.0 ng；Y＝4.7×10⁶ X＋45 295，r＝0.999 6，线性范围404.2～4 042.0 ng；Y＝7.6×10⁵ X＋10 028，r＝0.999 8，线性范围0.406～4.060 μg。

2.1.3 精密度试验

取混合对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，连续进样6次，检测盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷和甘草酸铵峰面积，计算得盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷和甘草酸铵的RSD分别为0.61%、0.49%、0.44%、0.22 %，表明精密度良好。

2.1.4 稳定性试验

取“2.2”项下上样溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，在0、2、4、6、8、10、12 h进样，检测盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷和甘草酸铵峰面积，计算得盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷和甘草酸铵的RSD分别为1.48%、0.81%、1.24%、0.96%，表明供试品在12 h内稳定，可供检测。

2.1.5 重复性试验

平行制备5份上样溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，检测盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷和甘草酸铵峰面积，计算得盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷和甘草酸铵的RSD分别为1.57%、0.59%、2.04%、1.89%，表明重复性良好。

2.1.6 加样回收率试验

精密移取已测定的上样溶液0.5 mL，平行6份，各精密加入对照品适量，按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，计算得盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷和甘草酸铵的平均加样回收率分别为96.89%、97.67%、98.52%、96.95%，RSD分别为1.42%、2.39%、0.78%、1.48%。

2.2 上样溶液的制备

称取74倍处方量（处方：麻黄9 g、苦杏仁9 g、甘草9 g），加水煎煮回流提取3次，每次1 h，浓缩药液至质量浓度为生药1.0 g/mL，离心药液，取上清液作为上样液；经HPLC检测，上样液中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷和甘草酸铵的质量浓度分别为2 542.45、1 357.41、4 863.42、3 767.55 μg/mL，质量分数分别为0.76%、0.41%、1.46%、1.13%，总质量分数为3.76%，浸膏得率为24.19%。

2.3 大孔树脂型号筛选 2.3.1 大孔树脂预处理

取适量大孔树脂用95%乙醇浸泡24 h充分溶胀，湿法装柱，再用95%乙醇洗脱至流出液与水（1∶5）不产生白色混浊为止，最后再用蒸馏水洗至无醇味即可，备用。

2.3.2 大孔树脂静态吸附与解吸 取预处理过的8种型号大孔树脂（D-101、HPD 100、HPD 300、AB-8、XAD-7、ADS-17、HPD 500、HPD 600）各5 g，置100 mL具塞锥形瓶中，分别精密加入上样液20 mL，常温下静置24 h，测定溶液中4种有效成分的质量浓度，计算4种有效成分的静态吸附量和吸附率及其综合评分（综合评分＝0.3×盐酸麻黄碱＋0.3×盐酸伪麻黄碱＋0.2×苦杏仁苷＋0.2×甘草酸铵，因麻黄为君药，苦杏仁与甘草为臣药，故给予盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱权重系数为0.3，苦杏仁苷和甘草酸铵权重系数为0.2）；将上述大孔树脂抽滤至干，放入100 mL锥形瓶中，加70%乙醇50 mL，静置24 h，测定溶液中4种有效成分的质量浓度，计算4种有效成分的静态解吸量和解吸率及其综合评分，结果见表 1。

静态吸附量＝(C₀－C₁)V₁/m

静态吸附率＝(C₀－C₁)V₁/C₀V₁

静态解吸量＝C₂V₂/m

静态解吸率＝C₂V₂/(C₀－C₁)V₁

C₀为原液质量浓度（μg/mL），C₁为残液质量浓度（μg/mL），V₁为原液体积（mL），C₂为洗脱液质量浓度（μg/mL），V₂为洗脱液体积（mL），m为树脂质量（g）

结果表明，D-101、HPD 100、HPD 300、AB-8、XAD-7对4种有效成分的吸附率与解吸率均有较好的效果，但是其中XAD-7为离子型交换树脂，其成本是其他4种树脂成本的3～4倍，在保证纯化效果相差不显著的情况下，尽可能节约生产成本，故对D-101、HPD 100、HPD 300、AB-8 4种型号的大孔树脂进行进一步考察。

2.3.3 大孔树脂静态吸附动力学考察

精密称取D-101、HPD 100、HPD 300、AB-8 4种型号大孔树脂各5 g，置于100 mL锥形瓶中，分别精密加入上样液40 mL，常温下静置24 h，分别于1、2、3、4、5、6、12、24 h测定溶液中4种有效成分的质量浓度，计算树脂在不同时间内对4种有效成分的吸附量，以吸附量对吸附时间作图，得到各树脂的吸附动力学曲线，结果见图 2。

将上述4种静态吸附完的大孔树脂抽干，精密加入70%乙醇50 mL进行解吸附，常温下静置24 h，分别于1、2、3、4、5、6、12、24 h测定溶液中4种有效成分的质量浓度，计算树脂在不同时间对4种有效成分的解吸量，以解吸量对解吸时间作图，得到各树脂的解吸附动力学曲线，结果见图 3。

结果表明，D-101、HPD 100、HPD 300、AB-8对4种有效成分的吸附均为快速平衡吸附，在1 h左右达到吸附平衡，在4 h左右解析达到完全，且HPD 300对4种有效成分的解吸优于其他3种大孔树脂，综合考虑，选择HPD 300为最佳大孔树脂。

2.4 HPD 300大孔树脂泄漏曲线的绘制及上样量的确定

取预处理好的HPD 300大孔吸附树脂30 mL，湿法装入玻璃柱（内径为1.8 cm、高30 cm，径高比1∶7）中，上样，上样体积流量为1.0 BV/h，每10 mL收集1份，共收集15份，测定每份泄漏液中4种有效成分的质量浓度；以4种有效成分的质量浓度为纵坐标，上样液体积为横坐标绘制泄漏曲线，结果见图 4。苦杏仁苷在上样量为60 mL时开始出现泄漏，100 mL时吸附达到饱和；盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱在90 mL时开始出现泄漏，120 mL时吸附达到饱和；甘草酸铵在100 mL时开始出现泄漏，130 mL时吸附达到饱和；综合以上分析，上样量为50 mL时4种有效成分不会出现泄漏，故50 mL为最大上样量，此时上样量为50 g，相当于每毫升树脂吸附生药1.67 g。

2.5 径高比考察

取预处理好的HPD 300大孔树脂按径高比为1∶3、1∶5、1∶7、1∶9湿法装入4根型号相同的玻璃柱（内径1.8 cm、高30 cm）中，分别精密加入提取液（生药1.0 g/mL）30 mL上样，上样体积流量均为1.0 BV/h，待充分吸附后，分别用2 BV去离子水洗涤，将残留液与水洗液合并，测定4种有效成分的质量浓度，计算4种有效成分的吸附率，结果见表 2。结果表明：随着径高比的增大，4种有效成分的吸附率不断增加，当增加至径高比为1∶9时，大孔树脂对4种有效成分的吸附率都为100%，但是径高比1∶7对4种有效成分的吸附率与径高比1∶9相近，没有显著性差异，考虑到生产成本以及后续工业生产的条件，故选择最佳径高比为1∶7。

2.6 上样液质量浓度考察

取预处理好的HPD 300 大孔树脂30 mL，按径高比1∶7湿法装入玻璃柱（内径1.8 cm、高30 cm）中，平行5份，取提取液（生药1.0 g/mL）10、20、30、40、50 mL，加水稀释至50 mL，使药液质量浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/mL，上样体积流量1.0 BV/h，待充分吸附后，用2 BV去离子水洗涤，将残留液与水洗液合并，测定4种有效成分的质量浓度，计算吸附率，结果见表 3。

结果表明，随着上样液质量浓度的增大，4种有效成分的吸附率不断下降，可能是因为药液质量浓度高导致有效成分不能完全被大孔树脂吸附，此时大孔树脂的吸附逐渐达到饱和状态，无法再吸附更多的有效成分，致使部分有效成分流出；上样质量浓度为0.2 g/mL时4种有效成分的吸附率最大，但是浓度太稀导致上样工作量大，费力耗时，故选择上样液最佳质量浓度为0.6 g/mL。

2.7 上样体积流量考察

取预处理好的HPD 300大孔树脂30 mL，按径高比1∶7湿法装入玻璃柱（内径1.8 cm、高30 cm）中，平行5份，分别精密加入提取液（生药0.6 g/mL）83 mL上样，上样体积流量分别为0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 BV/h，待充分吸附后，用2 BV去离子水洗涤，将残留液与水洗液合并，测定4种有效成分的质量浓度，计算吸附率，结果见表 4。结果表明，随着上样体积流量的不断加快，4种有效成分的吸附率在下降，但是下降幅度不明显，可能是因为大孔树脂对4种有效成分的吸附为快速吸附，所以体积流量对其吸附率影响不显著；为了提高工作效率，同时能够使有效成分被高效吸附，故选择最佳上样体积流量为4.0 BV/h。

2.8 水洗用量考察

取预处理好的HPD 300大孔树脂30 mL，按径高比1∶7湿法装入玻璃柱（内径1.8 cm、高30 cm）中，加入提取液（生药0.6 g/mL）83 mL，上样体积流量4.0 BV/h，待充分吸附后，用去离子水洗涤，每10 mL收集1份，共收集13份，测定洗涤液中4种有效成分的质量浓度，以洗脱量为横坐标，4种有效成分的质量浓度为纵坐标，绘制水洗用量洗脱曲线，结果见图 5。结果表明，随着水洗用量的增加，盐酸麻黄碱与盐酸伪麻黄碱从70 mL开始会随着水洗液被逐步洗脱下来，为了能够有效地去除杂质又能保证减少有效成分的损失，故选择60 mL（2 BV）水洗量。

2.9 洗脱剂考察

取预处理好的HPD 300大孔树脂30 mL，按径高比1∶7湿法装入玻璃柱（内径1.8 cm、高30 cm）中，平行4份，分别精密加入提取液（生药0.6 g/mL）83 mL，上样体积流量4.0 BV/h，待充分吸附后，用2 BV去离子水洗涤，将残留液与水洗液合并，再分别用7 BV的30%、50%、70%、95%乙醇以4.0 BV/h流速洗脱，收集洗脱液，测定4种有效成分的质量浓度，计算解析率，结果见表 5。结果表明，30%乙醇对4种有效成分的解吸效果最差，70%乙醇对4种有效成分的解吸效果比较好，故选择洗脱剂为70%乙醇。

2.10 洗脱体积流量考察

取预处理好的HPD 300大孔树脂30 mL，按径高比1∶7湿法装入玻璃柱（内径1.8 cm、高30 cm）中，平行5份，分别精密加入提取液（生药0.6 g/mL）83 mL，上样体积流量4.0 BV/h，待充分吸附后，用2 BV去离子水洗涤，将残留液与水洗液合并，再加入7 BV的70%乙醇分别以2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 BV/h体积流量洗脱，收集洗脱液，测定4种有效成分的质量浓度，计算解吸率，结果见表 6。结果表明，随着洗脱体积流量的不断加大，大孔树脂对4种有效成分的解吸率在不断减小，因2 BV/h与3 BV/h对洗脱效果相差不显著，为了提高洗脱效率节约时间，故选择最佳洗脱体积流量为3.0 BV/h。

2.11 洗脱剂用量考察

取预处理好的HPD 300大孔树脂30 mL，按径高比1∶7湿法装入玻璃柱（内径1.8 cm、高30 cm）中，加入提取液（生药0.6 g/mL）83 mL，上样体积流量4.0 BV/h，待充分吸附后，用2 BV去离子水洗涤，将残留液与水洗液合并，再加入70%乙醇，以3.0 BV/h体积流量洗脱，每1 BV收集1份，共收集20份，测定4种有效成分的质量浓度，以洗脱量为横坐标，4种有效成分的质量浓度为纵坐标，绘制洗脱曲线，结果见图 6。结果表明，洗脱量达到5 BV时，4种有效成分已被洗脱完全，故选择最佳洗脱量为5 BV。

2.12 大孔吸附树脂纯化工艺验证

取83 mL质量浓度为生药量0.6 g/mL的提取液，通过已处理好的HPD 300大孔树脂，树脂柱径高比1∶7，上样体积流量4.0 BV/h，水洗用量2 BV，70%乙醇溶液洗脱，洗脱体积流量3.0 BV/h，洗脱量5 BV；平行3份，测定4种有效成分的转移率（转移率＝吸附率×解析率），结果见表 7。结果表明，HPD 300大孔树脂能够有效纯化指标性成分且转移率高、稳定性好，说明该工艺条件合理可行。

3 讨论

中药复方成分复杂，药效物质不仅仅是某个单一的成分，而是一类或者几类成分群的共同作用，故本实验同时考察了盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷和甘草酸铵4种有效成分，经过大孔树脂静态吸附与解析试验从8种型号大孔树脂中筛选出4种型号的树脂，继而对这4种型号的树脂进行静态吸附动力学实验，最终筛选出HPD 300为最佳大孔树脂。

HPD 300大孔树脂对指标性成分具有较好的吸附率与解析率，并用多指标综合评分法对其吸附解吸过程进行了考察，并结合单因素考察最终确定最佳纯化条件为每毫升树脂吸附1.67 g生药，树脂柱径高比1∶7，上样药液质量浓度为生药0.6 g/mL，上样体积流量4.0 BV/h，2 BV去离子水洗涤，70%乙醇溶液洗脱，洗脱体积流量3.0 BV/h，洗脱量5 BV；三拗缓释片提取液经大孔树脂纯化后，盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷和甘草酸铵的总质量分数从3.76%提高到了22.62%，是纯化前的6倍；浸膏得率从原来的24.19%降到了5.10%，浸膏得率降低，但是有效成分未损失，工艺条件基本可行。