哮喘方为国医大师晁恩祥教授临床经验方，处方由防风、紫苏叶、苦杏仁等药味组成。该方能疏风缓急利窍、肃肺平喘，主要针对哮喘之“风邪伤肺，肃降失常，气道挛急”之突发或反复发作者。

该方从2个方面针对过敏性哮喘的治疗，一是以疏风宣降肺气为主，即从舒缓气道方面改善气道挛急，对气道高反应以舒缓作用；二是通窍降气平喘，针对鼻塞、气急、喘促，改善肺之肃降功能。方中以防风、紫苏叶为君药，其意在于疏风，防风中的升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷则有一定的解热、镇痛、抗炎、抗过敏作用^[1-2]；方中苦杏仁为臣药可以宣肃肺之气、润肺下气，针对哮喘憋气喘急而用，其中的苦杏仁苷则具有免疫抑制、免疫调节、抗炎等方面的药理作用^[3]。

为了优化该方的水提取工艺，提高临床疗效，本实验以哮喘方中升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、苦杏仁苷3个指标性成分以及固含物的提取率作为综合评价指标，采用正交试验设计法及信息熵理论^[4-6]分析法全面优化哮喘方水提取工艺，筛选该方的最佳提取工艺参数，为该方的中试放大及产业化生产提供数据支持。

1 仪器与材料

UltiMate3000高效液相色谱仪，美国戴安公司，包括二元泵，自动进样器，RS Variable Wavelength检测器；Satorius BP 211D电子分析天平，德国Sartorius公司，0.01 mg；美国纯净水发生器。

对照品升麻素苷（批号111522-201310，供定量测定用，质量分数以95.0%计）、5-O-甲基维斯阿米醇苷（批号111523-201208，供定量测定用，质量分数以96.4%计）、苦杏仁苷（批号110820- 201305，供定量测定用，质量分数以85.8%计）均购于中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯，上海星可生化有限公司；水为超纯水。

药材饮片均由连云港康济大药房有限公司吴舟执业药师鉴定，防风（批号Y141001，产地：河北）为伞形科植物防风Saposhnikovia divaricata (Turcz.) Schischk. 的干燥根；紫苏叶（批号Y140812，产地：江苏）为唇形科植物紫苏Perilla frutescens (L.) Britt. 的干燥叶或带嫩枝；辛夷（批号Y141030，产地：河南）为木兰科植物望春花Magnolia biondii Pamp. 的干燥花蕾；苦杏仁（批号Y141020，产地：河北）为杏Prunus armeniaca L. 的干燥成熟种子；炙麻黄（批号Y141023，产地：内蒙古）为麻黄科植物草麻黄Ephedra sinica Stapf的干燥草质茎蜜炙而得。

2 方法与结果 2.1 提取方法

取紫苏叶、辛夷，加入8倍量水提取挥发油，收集挥发油备用。药渣与防风、炙麻黄、苦杏仁（沸水投料）合并水提取。检测提取液中升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、苦杏仁苷的量，并计算提取率。

2.2 升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、苦杏仁苷定量测定方法的建立 2.2.1 色谱条件^[7-9]

色谱柱Phenomenex Luna 5u C₁₈(2)，规格为250 mm×4.6 mm，5 μm；流动相为甲醇-水，梯度洗脱：0～10 min，10%～30%甲醇；10～30 min，30%～80%甲醇；体积流量1.0 mL/min；进样量10 μL；柱温30 ℃；检测波长：254 nm测定升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷，210 nm测定苦杏仁苷。

2.2.2 混合对照品溶液制备

分别精密称取升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、苦杏仁苷对照品6.80、8.79、15.60 mg，置于20 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为340.00、439.50、780.00 μg/mL的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液制备

按照各实验参数设计对药材进行提取。取提取液，0.22 μm微孔滤膜（水膜）滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.4 系统适应性试验

取混合对照品溶液、供试品溶液进样分析，结果见图 1。升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、苦杏仁苷与其相邻色谱峰的分离度均大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05，理论塔板数以各色谱峰计均在10 000以上。

2.2.5 线性关系考察

精密量取混合对照品溶液0.1、0.2、0.4、1.0、2.0、4.0、10.0 mL，分别置10 mL量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，摇匀，分别按照“2.2.1”项下色谱条件依次进样，记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标（Y），对照品质量浓度为横坐标（X），绘制标准曲线。回归方程和线性范围分别为升麻素苷Y＝13.555 X-1.789，r＝0.999 9，0.034～3.400 μg；5-O-甲基维斯阿米醇苷Y＝14.286 X＋4.355 8，r＝0.999 9，0.044～4.395 μg；苦杏仁苷Y＝14.32 X-4.775 4，r＝0.999 9，0.078～7.800 μg。

2.2.6 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液，分别在“2.2.1”项色谱条件下重复进样6次，进样体积为10 μL，以对照品峰面积进行计算，升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、苦杏仁苷峰面积的RSD分别为0.17%、0.21%、0.15%，表明仪器精密度良好。

2.2.7 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于制备后0、2、4、6、8、12、24 h注入液相色谱仪，记录各成分峰面积。结果升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、苦杏仁苷峰面积的RSD分别为1.2%、1.4%、1.3%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.8 重复性试验

取待测提取液，照“2.2.3”项下方法制备6份供试品溶液，进行样品分析，计算升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、苦杏仁苷平均质量分数分别为0.049、0.058、0.266 mg/g，RSD分别为0.81%、0.73%、0.95%。

2.2.9 加样回收率试验

取已测定的待测溶液6份，分别精密加入升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、苦杏仁苷的混合对照品溶液适量，照“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，其平均回收率分别为98.31%、98.26%、98.55%，RSD分别为0.76%、0.91%、1.24%。试验结果表明，本方法具有良好的回收率。

2.3 浸膏得率测定

精密量取供试品V₁（mL），置于已恒定质量的蒸发皿（M₁）中，在水浴锅上蒸至近干，转移至烘箱内，105 ℃干燥至恒定质量，取出，置干燥器中冷却至室温，迅速精密称定质量（M₂），计算固含物提取率。

2.4 哮喘方提取工艺单因素试验研究 2.4.1 直接提取与浸泡提取考察

取紫苏叶70 g、辛夷56 g，平行2份，分别加入8倍量水提取挥发油，药渣与防风70 g、炙麻黄42 g、苦杏仁56 g水提取2次，每次1.5 h，其中1份加水后直接提取，另1份浸泡2 h（由于苦杏仁的特殊性，均水沸后投料）。取提取液采用“2.2.3”项方法制备供试品溶液进样检测，比较直接提取与药材浸泡后提取的效果，结果升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、苦杏仁苷各成分的提取率无显著性差异，浸泡后浸膏得率较直接提取高出4.8%。哮喘方水提取过程药材可以直接提取。

2.4.2 提取加水量初步考察

取紫苏叶70 g、辛夷56 g，平行4份，分别加入8倍量水提取挥发油，药渣与防风70 g、炙麻黄42 g、加水量依次为8、10、12、14倍，待水沸后加入苦杏仁56 g，提取2次，每次1.5 h。测定提取液中升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、苦杏仁苷的量，随着加水倍量的增加，各成分的提取率稍有升高的趋势，但在加水量12倍以后几乎无变化，浸膏得率变化不大。故确定正交试验加水量为8、10、12倍。

2.4.3 提取时间初步考察

取紫苏叶70 g、辛夷56 g，平行6份，分别加入8倍量水提取挥发油，药渣与防风70 g、炙麻黄42 g，加入10倍量水，待水沸后加入苦杏仁56 g。提取时间依次为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，提取2次。测定提取液中升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、苦杏仁苷的量。随着提取时间的延长，升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷提取率在0.5～2.0 h呈上升趋势，2.0～3.0 h呈下降趋势；苦杏仁苷提取率在0.5～2.5 h呈上升趋势，2.5～3.0 h呈下降趋势。浸膏得率则在2.0 h后不再升高。故确定正交试验提取时间为0.5、1.5、2.5 h。

2.5 基于信息熵理论的哮喘方水提取工艺评价 2.5.1 哮喘方水提取工艺正交试验

在查阅相关文献^[10-14]并结合单因素试验的基础上，选取加水量（A）、提取时间（B）、提取次数（C）为考察因素，因素水平见表 1。称取紫苏叶70 g、辛夷56 g，平行9份，分别置5 000 mL圆底烧瓶中，加入8倍量水提取挥发油，药渣分别与防风70 g、炙麻黄42 g，加水，待水沸后加入苦杏仁56 g。以升麻苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、苦杏仁苷的提取率（提取率即转移率，提取率＝提取液中该成分的量/药材中该成分的总量）以及固含物得率，采用熵权法对以上指标进行权重系数分配，计算综合评价指标，按照L₉(3⁴) 进行提取。试验结果见表 1。

2.5.2 哮喘方水提取工艺研究数据处理

根据文献给出的步骤^[4-6]，建立原始评价指标矩阵（X）如下。计算各项指标的信息熵（H_i），得到评价指标的H_i。

计算P_ij，将原始矩阵转换为“概率”矩阵（P）。

计算第i项指标的系数（W_i）。

对于1个m行n列的概率矩阵，综合评价指标M_m＝P_1m×W₁＋P_2m×W₂＋P_3m×W₃＋…P_nm×W_n。即升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、苦杏仁苷的提取率及浸膏得率各指标的权重系数依次为0.333 7、0.186 5、0.267 1、0.212 7。

将概率矩阵的数据进行加权处理，得到综合评价指标（M），再进行方差分析，确定最优实验方案。正交试验结果见表 1，方差分析结果见表 2。

在所选因素水平范围内，按照熵权法对试验结果进行评价，影响该方水提取工艺的因素大小依次为C＞A＞B，即提取次数＞加水量＞提取时间，提取次数为提取过程中的显著影响因素（P＜0.05）；由方差分析结果可知，因素A、B对实验结果没有显著性影响。因此选择A₂B₂C₃为最佳提取条件，即加入10倍量水，提取3次，每次1.5 h。

2.5.3 工艺验证试验

根据正交试验结果优选的工艺条件进行3批验证试验，各指标成分的提取率及综合评分结果见表 3，以最佳工艺参数进行提取，哮喘方水提液中各主要成分的提取率均较高，正交试验得出的结论与实际提取结果相符且较稳定，说明该提取工艺稳定可行。

3 讨论

本研究选取哮喘方中药味防风、苦杏仁中的已知有效成分升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、苦杏仁苷的提取率以及水提物浸膏得率作为评价指标，用于优先工艺参数，可较全面地评价所选工艺参数的优劣。

在正交试验前，首先进行单因素考察，对哮喘方水提取工艺的因素与水平进行了初步筛选。首先考察了药材浸泡一定时间与直接提取之间的差别，结果仅浸膏得率有变化，所选取成分的提取率无明显变化。故在正交试验中药材不经浸泡直接提取。提取时间选取0.5～3.0 h的6个时间点，由单因素数据来看，提取时间对各成分的提取率有影响，为了看出提取时间对实验结果影响的程度，故在正交试验中将提取时间的跨度变大。加水倍量对各成分的提取率影响较小，这与正交试验得出的结果一致。

在正交试验数据处理过程中利用信息熵理论进行客观赋权，权重系数完全来自与对实验数据的分析，清晰地反映了指标成分在不同提取条件下变化的客观规律^[6]，同时也避免了各指标数据间的相互影响，也在一定程度上减少了主观因素对实验结果的干扰，提升了本实验研究的科学性与严谨性。本实验所优选的工艺，经过验证稳定可行，为该方的进一步开发提供了数据支持。