戊己丸始载于《太平惠民和剂局方》，现收载于《中国药典》2015年版一部，由黄连、制吴茱萸和炒白芍按6∶1∶6比例组成，方中黄连为君药；吴茱萸为佐药；白芍臣药；3药配伍具有辛开苦降、泻肝和胃、降逆止呕止泻之功^[1-4]。UPLC-MS/MS联用技术已开始应用于中药的研究，能够高灵敏度、高效确定中药化学成分^[5-8]。本实验将首次采用UPLC- MS/MS联用技术对戊己丸指纹图谱进行研究，确定了38个共有峰，并根据对照品和参考文献定性指认了9个共有峰，推断出4个共有峰，运用相似度评价对数据进行分析，挖掘了指纹图谱中的有效信息，建立了指纹图谱，可用于戊己丸的质量控制。

Acquity UPLC，Waters-Xevo TQ质谱检测器，MassLynx TM质谱工作站软件，美国Waters公司。

对照品盐酸小檗碱（批号110713-201212，质量分数86.7%）、盐酸巴马汀（批号110732-201309，质量分数87.4%）、盐酸药根碱（批号110733- 201108，质量分数90.3%）、黄连碱（批号GZDD- 0426，质量分数98.9%）、表小檗碱（批号GZDD- 0833，质量分数98.9%）、吴茱萸碱（批号110802- 201409，质量分数99.4%）、吴茱萸次碱（批号110801-201207，质量分数99.4%）、吴茱萸内酯（批号110800-201205，质量分数88.5%）、芍药苷（批号110736-20143，质量分数96.4%），购自中国食品药品检定研究院。乙腈，色谱纯，德国Merck公司；甲酸，色谱纯，CNW公司；屈臣氏蒸馏水，广州屈臣氏食品饮料有限公司。其他试剂均为分析纯。

不同产地及品种黄连为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch.（味连）、三角叶黄连Coptis deltoidea C. Y. Cheng et Hsiao（雅连）或云连Coptis teeta Wall.（云连）的干燥根茎；吴茱萸为芸香科植物吴茱萸Euodia rutaecarpa (Juss.) Benth.、石虎Euodia rutaecarpa (Juss.) Benth. var. officinalis (Dode) Huang或疏毛吴茱萸Euodia rutaecarpa (Juss.) Benth. var. bodinieri (Dode) Huang的干燥近成熟果实；白芍为毛莨科植物芍药Paeonia lactiflora Pall. 的干燥根，药材来自不同药材市场或药店，经贵阳中医学院周汉华教授鉴定均为正品，具体信息见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 11批戊己丸复方的单味药材来源 Table 1 Sources of medicinal materials in 11 batches of Wuji Pill 复方批次 黄连 吴茱萸 白芍 150301（S1） 湖南（批号140401，味连） 贵州A（批号140501，吴茱萸） 安徽A（批号140701，白芍） 150302（S2） 湖北（批号140501，味连） 贵州B（批号140502，吴茱萸） 安徽B（批号141001，白芍） 150303（S3） 西藏（批号140901，云连） 贵州C（批号140503，吴茱萸） 吉林（批号140701，白芍） 150304（S4） 陕西（批号140601，味连） 贵州D（批号140601，疏毛吴茱萸） 浙江（批号140501，白芍） 150305（S5） 重庆（批号140701，雅连） 贵州E（批号140601，吴茱萸） 黑龙江（批号140601，白芍） 150306（S6） 云南A（批号140401，云连） 贵州F（批号140701，疏毛吴茱萸） 河北（批号140701，白芍） 150307（S7） 云南B（批号140501，云连） 贵州G（批号140801，石虎） 河南（批号140802，白芍） 150308（S8） 四川A（批号20140901，雅连） 云南A（批号140602，吴茱萸） 陕西（批号140901，白芍） 150309（S9） 四川B（批号20140902，雅连） 云南B（批号140801，疏毛吴茱萸） 内蒙古（批号140701，白芍） 150310（S10） 四川C（批号20141001，雅连） 云南C（批号140701，吴茱萸） 山西（批号140601，白芍） 150311（S11） 贵州（批号140601，雅连） 广西（批号140801，吴茱萸） 山东（批号140901，白芍）

表 1 11批戊己丸复方的单味药材来源 Table 1 Sources of medicinal materials in 11 batches of Wuji Pill

精密称取盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸药根碱、黄连碱、表小檗碱、吴茱萸内酯、吴茱萸碱、吴茱萸次碱和芍药苷对照品适量，置50 mL量瓶中，加入甲醇定容至刻度，配制成质量浓度为0.120、0.115、0.114、0.108、0.110、0.662、0.512、0.204、0.200 g/L的对照品溶液。

按《中国药典》2015年版将处方中3种药材按不同产地进行排列组合，投药制备得到11批复方。精密称取戊己丸样品粉末（过3号筛）约0.2 g，精密称定，置锥形瓶中，加入纯甲醇50 mL，超声处理30 min，放冷，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜滤过，备用。

色谱柱为Acquity UPLC BEH C₁₈色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温40 ℃；样品温度10 ℃；体积流量0.4 mL/min；进样量2 μL；以0.05%甲酸水溶液-乙腈为流动相，梯度洗脱：0～5 min，8%～15%乙腈；5～10 min，15%～18%乙腈；10～12 min，18%～20%乙腈；12～14 min，20%～35%乙腈；14～24 min，35%～40%乙腈；24～30 min，40%～50%乙腈；30～43 min，50%～55%乙腈；43～50 min，55%～59%乙腈；50～52 min，59%～20%乙腈；52～55 min，20%～8%乙腈。

离子源为ESI源，正离子扫描模式，毛细管电压3.0 kV，取样锥孔电压30 V；脱溶剂气温度350 ℃；脱溶剂气体积流量600 L/h；锥孔气体积流量50 L/h。

取S1样品粉末1份，按“2.1.2”项制备样品溶液一份，连续进样6次，测得各共有峰相对保留时间RSD＜1.65%，各共有峰相对峰面积RSD＜3.48%，表明进样和仪器精密度良好，符合指纹图谱的技术要求。

取S1样品粉末6份，按“2.1.2”项方法制备样品溶液6份，再按“2.2”项和“2.3”项下条件测定，共有峰相对保留时间RSD＜1.09%，共有峰相对峰面积RSD＜3.85%，表明方法重复性良好，符合指纹图谱的技术要求。

取S1样品粉末1份，按“2.1.2”项制备样品溶液1份，按“2.2”项和“2.3”项下条件测定，分别在0、2、4、8、12、24 h进样，测得各共有峰相对保留时间RSD＜1.34%，各共有峰相对峰面积RSD＜3.27%，表明样品溶液在24 h内稳定性良好，符合指纹图谱的技术要求。

取11批戊己丸复方（S1～S11）按“2.1.2”项下方法制备样品溶液，按照“2.2”和“2.3”项下的条件进行测定，记录色谱图。

在UPLC-MS/MS图谱中，13 min左右的色谱峰的峰面积最大且稳定，经与对照品对照鉴定为盐酸药根碱，故选择其为参照峰。

取“2.1.2”项制备的11批样品溶液各2 μL，按“2.2”项和“2.3”项下条件进行测定，得到11批不同产地药材的戊己丸UPLC-MS/MS指纹图谱（图 1），根据色谱峰中各色谱峰的相对保留时间，确定共有峰，并选取其中38个共有峰作为特征指纹峰，建立了戊己丸的对照指纹图谱（R），见图 2。

图 1 戊己丸11批样品的指纹图谱 Fig.1 Fingerprint of 11 batches of Wuji Pill

图 2 戊己丸样品对照指纹图谱 (R) Fig.2 Reference fingerprint of Wuji Pill (R)

分别取戊己丸全方、组成戊己丸的各单味药，同法分别制成戊己丸、单味药供试品，按照相同的UPLC条件进行测定，比较三者间的指纹图谱。通过图谱比较，结果发现黄连对戊己丸指纹图谱共有峰的贡献最大，吴茱萸和白芍次之。其中，1、2、3、7、10、11、12、14、15、16、17、18、20、34、37号峰来源于黄连；13、19、21、22、23、24、25、29、32、33、35、36、38号峰来源于吴茱萸；4、5、6、8、9、26、27、28、30、31号峰来源于白芍；黄连、白芍、吴茱萸对共有峰均有贡献。

采用UPLC-MS/MS鉴定戊己丸样品中的化学成分，戊己丸样品在正离子模式下获得准分子离子峰 [M＋H]⁺，在该模式下进行二级离子的质谱裂解。通过比较样品和对照品的保留时间和质谱的裂解规律来鉴定化学成分，如表 2所示。经过质谱图与色谱图保留时间的比较以及对质谱裂解规律的分析，推断了其中的主要成分化学结构式及其对应的峰编号。

表 2(Table 2)

表 2 戊己丸样品的质谱数据和相关化学成分的鉴定 Table 2 MS data of Wuji Pill and identification of related chemical constituents 峰号 tR/min 成分鉴定 电喷雾质谱 [M＋H]+(m/z) MSn特征离子 3 3.54 木兰花碱 342.18 297.02,177.34 4 4.30 芍药内酯苷 480.03 197.65 5 4.79 芍药苷 480.01 179.03 7 8.43 格陵兰黄连碱 322.05 279.38,149.54 10 11.87 黄连碱 320.06 305.10 11 12.77 表小檗碱 336.11 323.01 12 13.43 盐酸药根碱 338.11 323.14,308.58 15 17.75 盐酸小檗碱 336.09 321.07 16 19.75 盐酸巴马汀 352.12 337.21 21 31.69 吴茱萸内酯 471.03 425.31,318.11,242.02 24 34.01 吴茱萸碱 304.10 134.00,171.00 25 34.50 吴茱萸次碱 288.10 274.31,149.24 26 48.30 1-甲基-2-壬基- 286.07 209.12,149.54 4(1H)-喹诺酮

表 2 戊己丸样品的质谱数据和相关化学成分的鉴定 Table 2 MS data of Wuji Pill and identification of related chemical constituents

3 号色谱峰的准分子离子峰m/z 342.18 [M＋H]⁺，相对分子质量为342，分析表明，准分子离子峰m/z 342.18 [M＋H]⁺能够碎裂为二级离子m/z 297.02,177.34，通过分析上述的质谱裂解规律和相关的文献报道^[9-10]，鉴定3号色谱峰为木兰花碱。

4 号色谱峰的准分子离子峰m/z 480.03 [M＋H]⁺，相对分子质量为480，分析表明，准分子离子峰m/z 481.01 [M＋H]⁺能够碎裂为二级离子m/z 179.03，通过分析上述的质谱裂解规律和相关的文献报道^[11]，鉴定4号色谱峰为芍药内酯苷。

5号色谱峰的准分子离子峰m/z 480.01 [M＋H]⁺，相对分子质量为480，分析表明，准分子离子峰m/z 480.03 [M＋H]⁺能够碎裂为二级离子m/z 197.34，通过分析上述的质谱裂解规律和相关的文献报道^[11]，鉴定5号色谱峰为芍药苷。

7 号色谱峰的准分子离子峰m/z 322.05 [M＋H]⁺，相对分子质量为322，分析表明，准分子离子峰m/z 322.05 [M＋H]⁺能够碎裂为二级离子m/z 279.38,149.54，通过分析上述的质谱裂解规律和相关的文献报道^[9-10]，鉴定7号色谱峰为格陵兰黄连碱。

10 号色谱峰的准分子离子峰m/z 320.06 [M＋H]⁺，相对分子质量为320，分析表明，准分子离子峰m/z 320.06 [M＋H]⁺能够碎裂为二级离子m/z 305.01，通过分析上述的质谱裂解规律和相关的文献报道^[9-10]，鉴定10号色谱峰为黄连碱。

11 号色谱峰的准分子离子峰m/z 336.01 [M＋H]⁺，相对分子质量为336，分析表明，准分子离子峰m/z 336.01 [M＋H]⁺能够碎裂为二级离子m/z 323.01，通过分析上述的质谱裂解规律和相关的文献报道^[9-10]，鉴定11号色谱峰为表小檗碱。

12 号色谱峰的准分子离子峰m/z 338.11 [M＋H]⁺，相对分子质量为338，分析表明，准分子离子峰m/z 338.11 [M＋H]⁺能够碎裂为二级离子m/z 323.14,308.58，通过分析上述的质谱裂解规律和相关的文献报道^[9-10]，鉴定12号色谱峰为盐酸药根碱。

15 号色谱峰的准分子离子峰m/z 336.09 [M＋H]⁺，相对分子质量为336，分析表明，准分子离子峰m/z 336.09 [M＋H]⁺能够碎裂为二级离子m/z 321.07，通过分析上述的质谱裂解规律和相关的文献报道^[9-10]，鉴定15号色谱峰为盐酸小檗碱。

16 号色谱峰的准分子离子峰m/z 352.12 [M＋H]⁺，相对分子质量为352，分析表明，准分子离子峰m/z 352.12 [M＋H]⁺能够碎裂为二级离子m/z 337.21，通过分析上述的质谱裂解规律和相关的文献报道^[9-10]，鉴定16号色谱峰为盐酸巴马汀。

21 号色谱峰的准分子离子峰m/z 471.03 [M＋H]⁺，相对分子质量为470，分析表明，准分子离子峰m/z 471.03 [M＋H]⁺能够碎裂为二级离子m/z 425.31,318.11,242.02，通过分析上述的质谱裂解规律和相关的文献报道^[12-13]，鉴定21号色谱峰为吴茱萸内酯。

24 号色谱峰的准分子离子峰m/z 304.01 [M＋H]⁺，相对分子质量为303，分析表明，准分子离子峰m/z 304.01 [M＋H]⁺能够碎裂为二级离子m/z 134.00,171.09，通过分析上述的质谱裂解规律和相关的文献报道^[12-13]，鉴定24号色谱峰为吴茱萸碱。

25 号色谱峰的准分子离子峰m/z 288.10 [M＋H]⁺，相对分子质量为287，分析表明，准分子离子峰m/z 288.10 [M＋H]⁺能够碎裂为二级离子m/z 274.31,149.24，通过分析上述的质谱裂解规律和相关的文献报道^[12-13]，鉴定25号色谱峰为吴茱萸次碱。

26 号色谱峰的准分子离子峰m/z 286.07 [M＋H]⁺，相对分子质量为286，分析表明，准分子离子峰m/z 286.07 [M＋H]⁺能够碎裂为二级离子m/z 209.12,149.54，通过分析上述的质谱裂解规律和相关的文献报道^[12-13]，鉴定26号色谱峰为1-甲基-2-壬基-4(1H)-喹诺酮。

比较11批戊己丸样品的色谱图，确定了38个共有峰，选择保留时间适中且与相邻色谱峰分离良好，峰面积比较稳定的12号峰作为参照峰，计算各指纹峰保留时间和峰面积与同一图谱中参照峰的保留时间和峰面积比值，得到相对保留时间和相对峰面积。

运用国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004 A版）”，将所得11批戊己丸的UPLC-MS/MS图谱数据依次导入，产生对照图谱，经多点校正及色谱峰匹配，得出11批戊己丸的相似度，见表 3。由相似度结果可知，以上样品与对照谱相比较，其绝大部分戊己丸相似度达到0.9以上，只有S5与S1这一组的相似度不足0.9（0.893），说明戊己丸来源药材总体质量稳定，但存在区域差异。

表 3(Table 3)

表 3 不同批次戊己丸样品相似度 Table 3 Similarity of different batches of Wuji Pill 样品 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 对照 S1 1.000 0.906 0.917 0.906 0.893 0.912 0.955 0.911 0.960 0.965 0.902 0.909 S2 0.906 1.000 0.943 0.951 0.939 0.988 0.976 0.912 0.961 0.933 0.974 0.993 S3 0.917 0.943 1.000 0.952 0.916 0.933 0.955 0.941 0.937 0.947 0.962 0.995 S4 0.906 0.951 0.952 1.000 0.914 0.969 0.976 0.950 0.958 0.945 0.911 0.968 S5 0.893 0.939 0.916 0.914 1.000 0.999 0.968 0.963 0.947 0.989 0.932 0.919 S6 0.912 0.988 0.933 0.969 0.999 1.000 0.979 0.925 0.945 0.944 0.976 0.955 S7 0.955 0.976 0.955 0.976 0.968 0.979 1.000 0.922 0.914 0.978 0.995 0.966 S8 0.911 0.912 0.941 0.950 0.963 0.925 0.922 1.000 0.991 0.958 0.986 0.958 S9 0.960 0.961 0.937 0.958 0.947 0.945 0.914 0.991 1.000 0.922 0.954 0.910 S10 0.965 0.933 0.947 0.945 0.989 0.944 0.978 0.958 0.922 1.000 0.905 0.967 S11 0.902 0.974 0.962 0.911 0.932 0.976 0.995 0.986 0.954 0.905 1.000 0.907 对照 0.909 0.993 0.995 0.968 0.919 0.955 0.966 0.958 0.910 0.967 0.907 1.000

表 3 不同批次戊己丸样品相似度 Table 3 Similarity of different batches of Wuji Pill

分别比较25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇、90%甲醇、甲醇、乙醇、水作为提取溶剂，微波提取、加热回流提取、超声提取作为提取方法进行考察，30、45、60、90、120 min作为提取时间的条件，经UPLC-MS/MS检测，把色谱峰数、峰面积、分离度、基线、峰形等因素作为指标，最终选择甲醇作为提取溶剂，超声提取作为提取方法，30 min作为提取时间的最佳方案。

本实验尝试了水-乙腈、0.05%甲酸水溶液-乙腈、0.10%甲酸水溶液-乙腈、0.20%甲酸水溶液-乙腈、0.50%甲酸水溶液-乙腈、1.00%甲酸水溶液-乙腈、0.10%甲酸水溶液-0.10%甲酸乙腈溶液、水-甲醇、0.10%甲酸水溶液-甲醇、0.10%甲酸水溶液-0.10%甲酸甲醇等流动相系统进行考察，结果以0.05%甲酸水溶液-乙腈系统得到的色谱峰峰形较好且稳定；体积流量考察了0.35、0.40、0.45、0.50 mL/min，最终选择0.40 mL/min；进样量考察了0.5、1.0、2.0、5.0 μL，最终2.0 μL作为进样量色谱峰峰形较好，各成分分离较好；质荷比选择了m/z 100～1 000和m/z 200～800进行比较，结果m/z 100～1 000色谱峰数相对较多，信息量丰富，响应值高。

本实验首次建立了戊己丸UPLC-MS/MS指纹图谱，信息量丰富、出峰数目多、分离效果好，全面反映了戊己丸化学成分的信息，符合中药指纹图谱的技术要求，结合相似度对指纹图谱进行综合评价，使得结果科学、可靠、准确、全面，为中药的质量评价提供了参考。