中草药  2017, Vol. 48 Issue (3): 453-459
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引用本文doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2017.03.007
王鑫, 陈雪晴, 尤蓉蓉, 鞠建明, 徐金娣, 范君婷, 周洪雷. 青叶胆化学成分的UPLC-ESI-Q-TOF-MS分析[J]. 中草药, 2017, 48(3): 453-459.
WANG Xin, CHEN Xue-qing, YOU Rong-rong, JU Jian-ming, XU Jin-di, FAN Jun-ting, ZHOU Hong-lei. Analysis on chemical constituents from Swertia mileensis by UPLC-ESI-Q-TOF-MS[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2017, 48(3): 453-459 .
青叶胆化学成分的UPLC-ESI-Q-TOF-MS分析
王鑫1, 陈雪晴2, 尤蓉蓉2, 鞠建明2, 徐金娣2, 范君婷3, 周洪雷1     
1. 山东中医药大学药学院, 山东 济南 250300;
2. 江苏省中医药研究院, 江苏 南京 210028;
3. 南京医科大学药学院, 江苏 南京 211166
收稿日期: 2016-07-12
基金项目: 国家自然科学基金青年基金（31500278）；江苏省高校自然科学研究面上项目（13KJB360002）；山东省高校中医药抗病毒协同创新课题（XTCX2014C01-03）
作者简介: 王鑫(1992-), 女, 硕士研究生, 研究方向为中药及复方有效成分研究及其质量控制。E-mail:wo0318snb@163.com
通信作者: 范君婷(1983-), 女, 讲师, 研究方向为天然药物活性成分及其作用机制研究。Tel:(025)86868480, E-mail:juntingfan@njmu.edu.cn
周洪雷(1967-), 男, 教授, 研究方向为中药及天然药物有效成分及质量控制研究。E-mail:zhouhongleitcm@163.com
摘要: 目的 运用超高效液相色谱-电喷雾四级杆飞行时间质谱（UPLC-ESI-Q-TOF-MS）技术对中药青叶胆Swertia mileensis的主要化学成分进行定性分析。 方法 采用ACQUITY HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），用0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水为流动相进行梯度洗脱，体积流量为0.4 mL/min，质谱使用ESI离子源，正负离子模式下采集数据，运用Masslynx4.1软件并结合SciFinder数据库、獐牙菜属相关文献以及对照品信息进行数据分析。 结果 从青叶胆中鉴定出化学成分28个，包括7个环烯醚萜类、14个酮类、3个黄酮类、2个三萜类以及2个酚类。其中断马钱子苷半缩醛内酯、8-O-β-D-吡喃木糖（1→6）-β-D-吡喃葡萄糖-1，7-二羟基-3-甲氧基（口山）酮、3-氧去甲双（口山）酮苷和sweriyunnanlactone A为首次从该植物中发现。 结论 UPLC-ESI-Q-TOF-MS技术能够快速准确地鉴定青叶胆中的化学成分，为其质量控制和药效物质基础研究提供一种新的研究策略。
关键词: 青叶胆     UPLC-ESI-Q-TOF-MS     环烯醚萜类     (口山)酮类     黄酮类     三萜类     断马钱子苷半缩醛内酯     8-O-β-D-吡喃木糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖-1, 7-二羟基-3-甲氧基酮     3-氧去甲双酮苷     sweriyunnanlactone A    
Analysis on chemical constituents from Swertia mileensis by UPLC-ESI-Q-TOF-MS
WANG Xin1, CHEN Xue-qing2, YOU Rong-rong2, JU Jian-ming2, XU Jin-di2, FAN Jun-ting3, ZHOU Hong-lei1     
1. School of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250300, China;
2. Jiangsu Province Academy of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210028, China;
3. School of Pharmacy, Nanjing Medical University, Nanjing 211166, China
Abstract: Objective To analyze and identify the chemical constituents from Swertia mileensis by UPLC-ESI-Q-TOF-MS. Methods The analysis was performed on an Acquity HSS T3 reverse phase column (100 mm×2.1 mm, 1.8 μm). The mobile phase consisted of 0.1% formic acid acetonitrile and 0.1% formic acid, and was used for gradient elution, with the flow rate of 0.4 mL/min. Mass spectrometry was applied for the qualitative analysis under positive and negative ion modes and ESI ion source. Data was analyzed by Masslynx 4.1 software, SciFinder database, literatures, and standards. Results Twenty-eight compounds, including 7 iridoids, 14 xanthones, 3 flavonoids, 2 triterpenes, and 2 phenols were identified from S. mileensis. Among them, vogeloside, 8-O-β-D-glueopyranosyl-(l→6)-β-D-glueopyranosyl-l, 7-dihydroxy-3-ethoxyxanthone, 3-O-demethylswertipunicoside, and sweriyunnanlactone A were reported from this species for the first time. Conclusion Using UPLC-ESI-Q-TOF-MS method the main chemical constituents from S. mileensis can be rapidly and accurately identified, which provides a new strategy for its quality control as well as a reference for clarifying the material basis of its efficacy.
Key words: Swertia mileensis T. N. Ho et W. L. Shi     UPLC-ESI-Q-TOF-MS     iridoid     xanthone     flavonoids     triterpenes     vogeloside     8-O-β-D-glueopyranosyl-(l→6)-β-D-glueopyranosyl-l, 7-dihydroxy-3-ethoxyxanthone     3-O-demethylswertipunicoside     sweriyunnanlactone A    

青叶胆为龙胆科（Gentianaceae）獐牙菜属Swertia L.植物青叶胆Swertia mileensis T. N. Ho et W. L. Shi的干燥全草，其味苦、甘，性寒；有清肝利胆、清热利湿的功效。现代研究表明青叶胆中主要含有环烯醚萜类、𠮿酮类、黄酮类、三萜类等成分，有保肝、解痉、镇痛、抗病毒等作用。《中国药典》2015年版收录青叶胆全草及其制剂青叶胆片和黄疸肝炎丸作为抗肝炎药物使用[1]。

青叶胆化学成分众多，保肝活性显著，既是中药饮片的配方药，又是制药企业生产多种制剂的原料药，市场对青叶胆的需求量越来越大，需要寻求一种能够快速全面鉴定青叶胆中主要化学成分的方法，控制青叶胆药材质量，使其更好地发挥药效。目前，青叶胆的分离以常规色谱技术为主，而质量控制方法仅有HPLC法[2-4]及毛细管电泳法[5]，未见质谱分析方法的相关报道。超高效液相色谱-电喷雾四级杆飞行时间质谱（UPLC-ESI-Q-TOF-MS）技术是近几年发展起来的具有高分离度、高灵敏度、高精准度的分离技术，是快速高效鉴定天然药物中复杂庞大化合物体系的有力手段[6-7]。本研究首次采用UPLC-ESI-Q-TOF-MS技术对中药青叶胆的化学成分进行分析，鉴定出28个化合物，其中断马钱子苷半缩醛内酯、8-O-β-D-吡喃木糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖-1, 7-二羟基-3-甲氧基𠮿酮、3-氧去甲双𠮿酮苷和sweriyunnanlactone A为首次从该植物中发现。为其质量控制和药效物质基础研究提供一种快速、有效的方法。

1 仪器与试药

Waters ACQUITY UPLCTM液相色谱仪、Waters SYNAPT G2-S Q-TOF质谱仪（美国Waters公司）；ACQUITY HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；Masslynx4.1工作站（美国Waters公司）；AT201型百万分之一电子天平（瑞士METTLER公司）；KS-180AL型数控超声波清洗器（深圳市洁康洗净电器有限公司）；乙腈、甲醇（色谱纯，德国Merck公司）；甲酸（色谱纯，美国Sigma公司）；芒果苷（批号11607-201304，中国食品药品检定研究院）；龙胆苦苷（批号130408，成都普菲德生物技术有限公司）；齐墩果酸（批号11601-201302，中国食品药品检定研究院）。

青叶胆（批号121712，购自中国食品药品检定研究院）经南京医科大学陈立娜副研究员鉴定为龙胆科植物青叶胆Swertia mileensis T. N. Ho et W. L. Shi的干燥全草。

2 方法 2.1 检测条件 2.1.1 色谱条件

ACQUITY HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；体积流量0.4 mL/min；进样量5 μL；柱温35 ℃；流动相为0.1%甲酸乙腈溶液（A）-0.1%甲酸水溶液（B）；梯度洗脱：0~1 min，5% A；1~10 min，5% A~95% A；10~12 min，95% A；12~13 min，95% A~5% A；13~15 min，5% A。

2.1.2 质谱条件

离子源温度为120 ℃；毛细管电压2 500 V；锥孔电压40 V；低能量碰撞电压CE为6 V，高能量碰撞电压为30~60 V；电喷雾离子源（ESI），正、负离子模式；去溶剂温度（TEM）为250 ℃；高纯N2作为辅助喷雾电离与去溶剂气体，去溶剂气体积流量为500 L/h；锥孔气流为50 L/h；扫描范围m/z 50~1 500，检测时间15 min。

2.2 供试品溶液的制备

将青叶胆药材粉碎过40目筛，称取2.000 3 g，精密称定。加10倍量70%（体积分数）甲醇加热回流提取2次，每次2 h，合并提取液，减压回收甲醇至无醇味，-80 ℃冷冻干燥成粉末。加10 mL甲醇超声溶解转移至10 mL量瓶中，定容至刻度，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，备用。

2.3 对照品溶液的制备

取芒果苷、龙胆苦苷、齐墩果酸对照品适量，精密称定，加甲醇超声溶解、定容，制成浓度为5.00 μg/mL的对照品溶液，于4 ℃冰箱中避光保存，备用。

3 结果 3.1 青叶胆醇提物的化学成分分析

通过UPLC-Q-TOF-MS对青叶胆的化学成分进行定性分析，得到(-) ESI-MS和(+) ESI-MS的质谱总离子流图，见图 1。

图 1 青叶胆正离子(A)和负离子(B)模式的总离子流图 Fig.1 Total ion current with positive (A) and negative (B) ion mode of S. mileensis

通过SciFinder数据库对该属化合物进行检索，得到青叶胆中潜在的化学成分数据库，结合Masslynx4.1工作站给出的精确相对分子质量和质谱碎片，以及对照品，分析得到青叶胆中28个成分（表 1和图 2），其中包括7个环烯醚萜类（峰1、2、5、6、13、16、22）、14个𠮿酮类（峰3、8、9、11、12、17、18、19、20、21、23、24、25、27）、3个黄酮类（峰4、10、14）、2个三萜类（峰26、28）以及2个酚类（峰7、15）。其中有断马钱子苷半缩醛内酯、8-O-β-D-吡喃木糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖-1, 7-二羟基-3-甲氧基𠮿酮、3-氧去甲双𠮿酮苷和sweriyunnanlactone A为首次从该植物中发现。

表 1 青叶胆中化学成分的UPLC-ESI-Q-TOF-MS鉴定结果 Table 1 Identification of chemical constituents from S. mileensis by UPLC-ESI-Q-TOF-MS

图 2 UPLC-Q-TOF-MS技术鉴定出的青叶胆中部分化合物的结构 Fig.2 Chemical structures of constituents from S. mileensis identified by UPLC-Q-TOF-MS

3.2 环烯醚萜类成分鉴定

峰1（tR为2.82 min）在负离子模式下准分子离子峰为m/z 375.127 6 [M-H]-，再脱去1分子葡萄糖形成m/z 213 [M-H-Glc]-等碎片离子峰。根据元素组成分析，该化合物分子式为C16H24O10，根据文献报道[8]，推测峰1为马钱苷酸。

峰2（tR为3.16 min）在负离子模式下准分子离子峰为m/z 373.113 0 [M-H]-，加合离子峰为m/z 419 [M+HCOO]-和m/z 409 [M+Cl]-。根据元素组成分析，该化合物分子式为C16H22O10，根据文献报道[8-9]，推测峰2为獐牙菜苦苷。

峰5（3.36 min）在负离子模式下加合离子峰m/z 401.107 1 [M+HCOO]-，失去3分子H2O形成m/z 301 [M-H-3H2O]-等碎片离子峰。根据元素组成分析，该化合物分子式为C16H20O9，根据文献报道[8-9]并且结合对照品，推测峰5为龙胆苦苷。

峰6（tR为3.46 min）在负离子模式下的准分子离子峰为m/z 357 [M-H]-，加合离子峰为m/z 403.123 3 [M+HCOO]-和m/z 393 [M+Cl]-。根据元素组成分析，该化合物分子式为C16H22O9，根据文献报道[8]，推测峰6为獐牙菜苷。

峰13（tR为3.72 min）在负离子模式下加合离子峰为m/z 433.134 0 [M+HCOO]-。根据元素组成分析，该化合物分子式为C17H24O10，根据文献报道[10]，推测峰13为断马钱子苷半缩醛内酯。

峰16（tR为4.15 min）在负离子模式下准分子离子峰为m/z 477.140 3 [M-H]-，加合离子峰m/z 523 [M+HCOO]-，二聚体m/z 955 [2M-H]-，见图 3。根据元素组成分析，该化合物分子式为C23H26O11，根据文献报道[11]，推测峰16为decentapicrin。

图 3 峰16的MS2图(ESI-) Fig.3 MS2 map (ESI-) of peak 16

峰22（tR为5.15 min）在负离子模式下加合离子峰为m/z 551.190 9 [M+HCOO]-。根据元素组成分析，该化合物分子式为C29H30O8，根据文献报道[12]，推测峰22为sweriyunnanlactone A。

3.3 𠮿酮类化合物鉴定

峰3（tR为3.30 min）在负离子模式下准分子离子峰为m/z 421.077 4 [M-H]-，脱去1分子H2O形成m/z 403 [M-H-H2O]-，二聚体m/z 843 [2M-H]-等特征碎片。根据元素组成分析，该化合物分子式为C19H18O11，根据文献报道[13]并且结合对照品，推测峰3为芒果苷。

峰8（tR为3.46 min）在正离子模式下准分子离子峰为m/z 229.049 3 [M+H]+，加合离子峰m/z 251 [M+Na]+。峰9（tR为6.84 min）在负离子模式下准分子离子峰为m/z 227.035 2 [M-H]-，加合离子峰m/z 273 [M+HCOO]-。根据元素组成分析，峰8和峰9分子式均为C13H8O4，根据文献报道[14]，推测为含有2个羟基的𠮿酮，可能是1, 3-二羟基𠮿酮及其同分异构体。

峰11（tR为3.66 min）在正离子模式下准分子离子峰为m/z 261.039 1 [M+H]+。根据元素组成分析，该化合物分子式为C13H8O6，根据文献报道[15]，推测峰11为去甲基雏菊叶龙胆酮。

峰12（tR为3.66 min）在负离子模式下准分子离子峰为m/z 421.076 5 [M-H]-，脱去1分子葡萄糖得到m/z 259 [M-H-Glc]-，二聚体m/z 843 [2M-H]-等碎片离子峰。根据元素组成分析，该化合物分子式为C19H18O11，根据文献报道[13]，推测峰12为异芒果苷。

峰17（tR为4.24 min）在负离子模式下准分子离子峰为m/z 567.133 9 [M-H]-，脱掉甲基得到m/z 552 [M-H-CH3]-等碎片离子峰。根据元素组成分析，该化合物分子式为C25H28O15，根据文献报道[16]，推测峰17为8-O-(β-D-吡喃木糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖)-1, 7-二羟基-3-甲氧基𠮿酮。

峰18（tR为4.44 min）在负离子模式下准分子离子峰为m/z 435.091 7 [M-H]-，二聚体m/z 871 [2M-H]-等碎片离子峰。根据元素组成分析，该化合物分子式为C20H20O11，根据文献报道[17]，推测峰18为当药醇苷。

峰19（tR为4.46 min）在正离子模式下准分子离子峰为m/z 275.055 3 [M+H]+，脱去2分子H2O和1分子甲基，得到m/z 224 [M+H-2H2O-CH3]+等碎片离子峰。峰20（tR为7.06 min）在负离子模式下准分子离子峰为m/z 273.038 6 [M-H]-，脱掉甲基得到m/z 258 [M-H-CH3]-等碎片离子峰。根据元素组成分析，峰19和峰20的分子式均为C14H10O6，根据文献报道[18]，推测为结构中被3个羟基和1个甲氧基取代的𠮿酮。可能是1, 3, 8-三羟基-7-甲氧基𠮿酮或1, 7, 8-三羟基-3-甲氧基𠮿酮或1, 5, 8-三羟基-3-甲氧基𠮿酮或雏菊叶龙胆酮。

峰21（tR为4.75 min）在负离子模式下准分子离子峰为m/z 679.095 3 [M-H]-，脱去1分子H2O形成m/z 661 [M-H-H2O]-，脱去1分子葡萄糖得到m/z 517 [M-H-Glc]-等碎片离子峰，见图 4。根据元素组成分析，该化合物分子式为C32H24O17，根据文献报道[19]，推测峰21为3-氧去甲双𠮿酮苷。

图 4 峰21的MS2图(ESI-) Fig.4 MS2 map of peak 21 (ESI-)

峰23（tR为7.04 min）在正离子模式下准分子离子峰为m/z 289.070 4 [M+H]+，再脱去1分子H2O形成m/z 271 [M+H-H2O]+等碎片离子峰。峰24（tR为8.49 min）在正离子模式下有同样的准分子离子峰以及碎片离子峰。根据元素组成分析，峰23和峰24的分子式均为C15H12O6，根据文献报道[20]，推测为结构中被2个羟基和2个甲氧基取代的𠮿酮。可能是1, 8-二羟基-3, 7-甲氧基𠮿酮或1, 8-二羟基-3, 5-甲氧基𠮿酮或1, 7-二羟基-3, 8-甲氧基𠮿酮或1, 7-二羟基-3, 4-甲氧基𠮿酮或1, 5-二羟基-2, 3-甲氧基𠮿酮。

峰25（tR为7.16 min）在正离子模式下准分子离子峰为m/z 303.086 7 [M+H]+，再脱去2个甲基形成m/z 273 [M+H-2CH3]+等碎片离子峰。根据元素组成分析，分子式为C16H14O6，根据文献报道[21]，推测峰25为结构中被1个羟基和3个甲氧基取代的𠮿酮。可能是1-羟基-3, 7, 8-三甲氧基𠮿酮或1-羟基-3, 5, 6-三甲氧基𠮿酮或1-羟基-2, 3, 5-三甲氧基𠮿酮或1-羟基-2, 3, 8-三甲氧基𠮿酮。

峰27（tR为8.11 min）在正离子模式下准分子离子峰为m/z 333.097 1 [M+H]+。根据元素组成分析，分子式为C17H16O7，根据文献报道[18]，推测峰27为结构中被1个羟基和4个甲氧基取代的𠮿酮。可能是1-羟基-2, 3, 5, 7-四甲氧基𠮿酮或1-羟基-2, 3, 4, 6-四甲氧基𠮿酮或1-羟基-2, 3, 4, 7-四甲氧基𠮿酮或1-羟基-2, 3, 6, 8-四甲氧基𠮿酮。

3.4 黄酮类化合物的鉴定

峰4（tR为3.30 min）在负离子模式下加合离子峰m/z 331.043 9 [M+HCOO]-，脱去2分子H2O形成m/z 249 [M-H-2H2O]-等碎片离子峰。根据元素组成分析，该化合物分子式为C15H10O6，根据文献报道[22]，推测峰4为山柰酚。

峰10（tR为3.58 min）在负离子模式下，准分子离子峰为m/z 447.092 0 [M-H]-，脱去5分子H2O得到m/z 357 [M-H-5H2O]-等碎片离子峰，见图 5。根据元素组成分析，该化合物分子式为C21H20O11，根据文献报道[23]，推测峰10为异荭草素。

图 5 峰10的MS2图(ESI-) Fig.5 MS2 map of peak 10 (ESI-)

峰14（tR为3.88 min）在负离子模式下准分子离子峰为m/z 431.096 2 [M-H]-，脱去5分子H2O形成m/z 341 [M-H-5H2O]-等碎片离子峰。根据元素组成分析，该化合物分子式为C21H20O10，根据文献报道[5]，推测峰14为异牡荆素。

3.5 三萜类化合物鉴定

峰26（tR为7.93 min）在负离子模式下准分子离子峰为m/z 471.347 7 [M-H]-，再脱去3分子H2O形成m/z 417 [M-H-3H2O]-等碎片离子峰。根据元素组成分析，该化合物分子式为C30H48O4，根据文献报道[18]，推测峰26为山楂酸。

峰28（tR为10.64 min）在负离子模式下准分子离子峰为m/z 455.352 1 [M-H]-，加合离子峰m/z 501 [M+HCOO]-，见图 6。根据元素组成分析并且结合对照品，该化合物分子式为C30H48O3，根据文献报道[18]，推测峰28为齐墩果酸。

图 6 峰28的MS2图(ESI-) Fig.6 MS2 map of peak 28 (ESI-)

3.6 酚类化合物鉴定

峰7（tR为3.46 min）在正离子模式下准分子离子峰为m/z 247.059 8 [M+H]+，失去1分子H2O形成m/z 229 [M+H-H2O]+等碎片。根据元素组成分析，该化合物分子式为C13H10O5，根据文献报道[24]，推测峰7为鸢尾酚酮。

峰15（tR为4.02 min）在负离子模式下准分子离子峰为m/z 167.034 1 [M-H]-。根据元素组成分析，该化合物分子式为C8H8O4，根据文献报道[25]，推测峰15为香草酸。

4 讨论

本实验采用UPLC-ESI-Q-TOF-MS技术对青叶胆进行化学成分定性分析，从总离子图看出，青叶胆在正负离子模式下都有较好的响应。根据质谱给出的精确相对分子质量（误差＜5×10-6）、质谱碎片，结合獐牙菜属相关文献，鉴定出28个化合物，主要为环烯醚萜类和𠮿酮类。同时在总离子流图中有许多强峰，例如在负离子模式下m/z 693.110 2（5.37 min）、m/z 259.021 7（6.09 min）、m/z 295.225 8（8.69 min）、m/z 355.155 9（11.26 min）以及在正离子模式下m/z 225.196 4（6.70 min）、m/z 304.299 7（7.66 min）等，推测出的化合物未见相关文献报道，证明青叶胆中还有一些未知化合物，并且是青叶胆的主要成分，对化合物的分离和药效物质基础研究有指导意义。

本研究表明UPLC-ESI-Q-TOF-MS技术能够快速准确地鉴定分析青叶胆的化学成分，为控制青叶胆药材质量，保证用药安全，进一步阐明其药效基础提供了科学的依据，同时可以指导青叶胆化合物的分离工作。

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