菊苣Cichorii Herba为菊科（Compositae）植物毛菊苣Cichorium glandulosum Boiss. et Huet. 或菊苣C. intybus L. 的干燥地上部分或根，具有清肝利胆、健胃消食、利尿消肿的作用^[1]。菊苣中主要含有酚酸、香豆素、倍半萜、三萜、多糖、生物碱类等成分^{[2, 3]}。研究发现菊苣中香豆素类中的秦皮甲素、秦皮乙素具有保肝作用^{[4, 5]}；酚酸类中的绿原酸具有抗菌、抗病毒、抗诱变、抗过敏作用^[6]；异绿原酸B和异绿原酸A具有潜在的降尿酸作用^[7]。目前《中国药典》2010年版中对菊苣相应成分测定中还未制定标准，而上述成分在菊苣荷药材中的量较高且活性较好，具有代表性，有必要将其纳入菊苣药材质量控制和评价体系。

中药的多成分、多功效的作用特点，决定着单一成分难以表达中药的内在质量，因此，应选择多成分、多指标的测定，对与功效相关的化学成分进行全面综合的评价。但多指标质量控制面临着对照品短缺及相应的检测成本费用高等问题，为解决这一问题，中医药领域提出了一种新的评价中药内在质量模式，即一测多评法（quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS）。QAMS以样品中某一成分为内参物，建立该成分与其他成分间的相对校正因子，通过相对校正因子计算其他成分量^[7]。该方法具有快速、简便并能同时实现多成分同步测定等优点^{[8, 9, 10]}，已被《中国药典》2010年版收录^[1]。因此本实验采用QAMS技术，以秦皮乙素为内参物，计算绿原酸、异绿原酸B和异绿原酸A的相对校正因子，建立菊苣药材的QAMS方法，为菊苣质量控制提供新的评价模式。

Shimadzu LC-2010AHT高效液相色谱系统（日本岛津公司），Agilent 1100 series液相色谱仪系统（美国Agilent 公司），Waters 1525型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；色谱柱：Agilent Zorbax SB-C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm），Agilent Eclipse XOB-C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm），日本资生堂CAPCELL PAK-C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）；Sartorious BT 125D 1/10万分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）；KQ-500DE型数控超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；DFT-100中药粉碎机（温岭市大德中药机械有限公司）。

绿原酸（批号MFCD00003862，质量分数≥95%）购自Sigma公司；异绿原酸A、异绿原酸B、秦皮乙素（质量分数均≥99.0%）购于成都普瑞科技有限公司。

菊苣药材采收或购自新疆、辽宁、山东等地。经北京中医药大学中药学院中药鉴定教研室闫永红教授鉴定为菊科植物菊苣Cichorium intybus L. 的干燥地上部分。甲醇为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。

Agilent Zorbax SB-C18，检测波长254 nm，柱温30℃，体积流量1 mL/min，进样量10 μL。流动相为0.1%甲酸水（A）-甲醇（B），梯度洗脱：0～2 min，23% B；2～15 min，23%～33% B；15～20 min，33%～40% B；20～27 min，40%～42% B；27～40 min，42%～60% B。在上述色谱条件下，各组分分离度良好，色谱图见图 1。

图 1

Fig. 1

图 1 混合对照品 (A) 和菊苣样品 (B) 的HPLC图 Fig. 1 HPLC of mixed reference substances (A) and chicory sample (B)

分别取绿原酸、秦皮乙素、异绿原酸B和异绿原酸A对照品适量，精密称定，置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，配制成质量浓度为绿原酸25.5 ng/μL、秦皮乙素32.3 ng/μL、异绿原酸B 26.8 ng/μL、异绿原酸A 26.8 ng/μL的混合对照品溶液。

精密称定菊苣药材粉末（过40目筛）1 g，置25 mL量瓶中，加入100%甲醇25 mL，密塞，超声提取30 min，100%甲醇补足减失的质量，取上清液过0.45 μm滤膜，即得。

取混合对照品溶液，精密吸取上述混合对照品溶液1、2、5、10、15、20 μL分别进样，以进样量对峰面积积分值进行回归处理，得到绿原酸、秦皮乙素、异绿原酸B和异绿原酸A的标准曲线，结果见表 1。

表 1 (Table 1)

表 1 绿原酸、秦皮乙素、异绿原酸B和异绿原酸A的标准曲线 Table 1 Standard curves of chlorogenic acid,aesculetin,isochlorogenic acid B,and isochlorogenic acid A in chicory 化合物 标准曲线 R2 线性范围/μg 绿原酸 Y＝1 076 497 X－1 017.76 0.999 7 0.025 5～0.510 0 秦皮乙素 Y＝1 442 089 X－2 147.73 0.999 8 0.032 3～0.645 0 异绿原酸B Y＝1 654 120 X－2 359.08 0.999 8 0.026 8～0.535 0 异绿原酸A Y＝1 896 033 X－4 229.39 0.999 9 0.026 8～0.535 0

表 1 绿原酸、秦皮乙素、异绿原酸B和异绿原酸A的标准曲线 Table 1 Standard curves of chlorogenic acid,aesculetin,isochlorogenic acid B,and isochlorogenic acid A in chicory

在“2.1”项确定的HPLC 色谱分析条件下，精密吸取“2.2.1”项混合对照品溶液10 μL，测定各成分的峰面积。以秦皮乙素为内参物，根据相对校正因子计算公式，分别计算绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A的相对校正因子，结果见表 2。

表 2 (Table 2)

表 2 绿原酸、异绿原酸B和异绿原酸A的相对校正因子 Table 2 RCF of chlorogenic acid,isochlorogenic acid B,and isochlorogenic acid A 编号 相对校正因子 绿原酸/秦皮乙素 异绿原酸B/秦皮乙素 异绿原酸A/秦皮乙素 1 1.327 2 0.869 6 0.763 8 2 1.335 9 0.873 2 0.766 7 3 1.334 6 0.874 2 0.768 3 4 1.335 3 0.871 3 0.764 1 5 1.336 3 0.872 0 0.766 1 平均值 1.333 9 0.872 1 0.765 8 RSD/% 0.25 0.18 0.22

表 2 绿原酸、异绿原酸B和异绿原酸A的相对校正因子 Table 2 RCF of chlorogenic acid,isochlorogenic acid B,and isochlorogenic acid A

精密吸取同一供试品溶液10 μL分别于配制后的0、2、8、12、24、36 h记录峰面积，绿原酸、秦皮乙素、异绿原酸B、异绿原酸A的RSD分别为1.25%、1.34%、1.43%和1.32%。表明处理后的供试品溶液在36 h内稳定。

精密称取同一菊苣药材粉末1 g，共6份，制备供试品溶液，依法测定，计算绿原酸、秦皮乙素、异绿原酸B、异绿原酸A质量分数的RSD分别为0.27%、4.24%、2.53%、3.10%，表明该方法的重复性良好。

精密吸取上述混合对照品溶液10 μL，在上述色谱条件下，重复进样7次，测得峰面积，计算峰面积的RSD，绿原酸、秦皮乙素、异绿原酸B、异绿原酸A的RSD分别为0.74%、0.96%、0.51%、0.33%，均小于2.0%。

取同一批已测定的菊苣药材粉末约0.5 g，6份，精密称定，分别精密加入一定量的绿原酸、秦皮乙素、异绿原酸B、异绿原酸A混合对照品溶液，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取上述供试品溶液10 μL。依法测定，计算回收率，绿原酸、秦皮乙素、异绿原酸B、异绿原酸A的平均加样回收率分别为102.04%、96.77%、96.78%、95.94%，RSD 分别为0.88%、0.51%、1.42%、1.49%，表明该方法的准确度良好。

在“2.1”项确定的HPLC色谱分析条件下，精密吸取“2.2.1”项混合对照品溶液10 μL，采用Shimadzu高效液相色谱仪，分别考察3种不同品牌的色谱柱对菊苣酸相对校正因子的影响，结果见表 3，表明不同色谱柱所得到的相对校正因子基本一致。

表 3 (Table 3)

表 3 不同色谱柱对相对校正因子的影响 Table 3 Effect of different columns on RCF 色谱柱 相对校正因子 绿原酸/秦皮乙素素 异绿原酸B/秦皮乙素素 异绿原酸A/秦皮乙素素 ZORBAX SB-C18 1.327 2 0.869 6 0.763 8 Eclipse XOB-C18 1.331 2 0.877 2 0.731 1 CAPCELL PAK-C18 1.371 4 0.898 5 0.750 6 平均值 1.343 3 0.881 8 0.748 5 RSD/% 1.82 1.70 2.20

表 3 不同色谱柱对相对校正因子的影响 Table 3 Effect of different columns on RCF

在“2.1”项确定的HPLC色谱分析条件下，精密吸取“2.2.1”项混合对照品溶液10 μL，考察Shimadzu、Waters 1525和Agilent 1100 3种高效液相色谱仪对相对校正因子的影响，结果见表 4。表明在不同的液相色谱系统下所得到的相对校正因子基本一致。

表 4 (Table 4)

表 4 不同高效液相色谱的相对校正因子 Table 4 RCF for different HPLC instruments 仪器 相对校正因子 绿原酸/秦皮乙素 异绿原酸B/秦皮乙素 异绿原酸A/秦皮乙素 Shimadzu 1.332 1 0.875 4 0.767 2 Waters1525 1.309 2 0.900 4 0.781 4 Agilent 1100 1.263 0 0.825 0 0.714 0 平均值 1.301 4 0.866 9 0.754 2 RSD/% 4.65 4.43 4.71

表 4 不同高效液相色谱的相对校正因子 Table 4 RCF for different HPLC instruments

在“2.1”项下确定的HPLC色谱分析条件下，精密吸取“2.2.1”项混合对照品溶液10 μL，测定内参物秦皮乙素的相对保留时间，根据相对保留时间即可正确判断出目标峰绿原酸、异绿原酸B和异绿原酸A的准确峰位置，结果见表 5。由表 5可知，RSD≤5%，表明利用相对保留时间进行色谱峰的定位是可行的。

表 5 (Table 5)

表 5 不同仪器和色谱柱测得的相对保留时间 Table 5 Relative retention values measured by different instruments and columns 仪器型号 色谱柱型号 相对保留时间 绿原酸/秦皮乙素 异绿原酸B/秦皮乙素 异绿原酸A/秦皮乙素 Shimadzu ZORBAX SB-C18 0.772 9 2.123 1 2.179 5 Shimadzu Eclipse XOB-C18 0.724 0 2.119 7 2.166 5 Shimadzu CAPCELL PAK-C18 0.812 0 2.095 6 2.147 0 Waters 1525 ZORBAX SB-C18 0.784 3 2.042 4 2.097 9 Agilent 1100 ZORBAX SB-C18 0.788 1 1.989 9 2.046 8 平均值 0.776 3 2.074 1 2.127 5 RSD/% 4.19 2.75 2.57

表 5 不同仪器和色谱柱测得的相对保留时间 Table 5 Relative retention values measured by different instruments and columns

分别取各产地药材制备供试品溶液。分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液各10 μL注入高效液相色谱仪，测定。分别采用外标法和QAMS法计算菊苣中绿原酸、秦皮乙素、异绿原酸B和异绿原酸A的量，结果见表 6。采用QAMS法及外标法所测得的菊苣药材中绿原酸、异绿原酸B和异绿原酸A的量基本一致，表明QAMS在菊苣的多指标成分质量评价中应用是可行的。

表 6 (Table 6)

表 6 菊苣药材中绿原酸、秦皮乙素、异绿原酸B和异绿原酸A的测定 Table 6 Contents of chlorogenic acid,isochlorogenic acid B,and isochlorogenic acid A in chicory 批号 秦皮乙素/% 绿原酸/% 异绿原酸B/% 异绿原酸A/% QAMS 外标法 QAMS 外标法 QAMS 外标法 辽宁大连 0.323 8 0.336 6 0.336 5 0.229 5 0.229 2 0.068 8 0.070 0 辽宁灯塔 0.297 6 0.432 5 0.432 1 0.234 1 0.233 7 0.051 5 0.053 0 新疆墨玉 0.262 6 0.213 1 0.213 3 0.126 5 0.126 9 0.108 1 0.108 8 内蒙古 0.226 3 0.354 6 0.354 3 0.074 9 0.075 7 0.010 2 0.012 3 河北平山 0.232 0 0.240 7 0.240 9 0.085 2 0.085 9 0.019 1 0.021 1 山东寿光 0.215 5 0.127 0 0.127 5 0.059 4 0.060 4 0.028 2 0.030 0 新疆昌吉 0.511 4 0.973 1 0.970 8 0.317 7 0.316 6 0.074 2 0.075 3 江西南昌 0.064 0 0.487 0 0.486 4 0.046 9 0.048 0 0.139 3 0.139 6

表 6 菊苣药材中绿原酸、秦皮乙素、异绿原酸B和异绿原酸A的测定 Table 6 Contents of chlorogenic acid,isochlorogenic acid B,and isochlorogenic acid A in chicory

绿原酸、秦皮乙素、异绿原酸B和异绿原酸A在菊苣药材中相对量较大，且生物活性较高，因此将它们选为能够反映菊苣内部质量评价的指标。其中秦皮乙素化学性质稳定且廉价易得，在菊苣和毛菊苣中量较高，且对照品分离工艺比较成熟，故选其为内参物，以降低检测成本。

本实验对流动相做了初步对比，采用甲醇-甲酸和甲醇-乙酸作为流动相系统进行分析，发现甲醇-甲酸流动相，分离效果明显改善，且峰形较好。对于检测波长的选择，本实验对200～400 nm 进行全波长扫描，结合4种对照品的峰形及菊苣药材的整体峰形，发现254 nm条件下的4种对照品的色谱峰型较好，菊苣药材的整体色谱峰数目较多，峰型较好且分离度好，故本研究选择254 nm作为测定波长。此外，本实验还考察了不同色谱柱、不同色谱仪下对相对校正因子及相对保留时间的影响，并以RSD值作为指标，实验结果表明，在上述条件下相对校正因子及相对保留时间重现性良好。

本实验采用HPLC外标法测定了菊苣药材中秦皮乙素的量，同时测定并计算了绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A的相对校正因子，用相对校正因子计算得到了绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A的量，实现了QAMS。同时，采用外标法测定了菊苣药材中绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A的量，比较了其与相对校正因子计算值之间的差异，结果表明，二者之间无显著差异。

综上所述，本实验所建立的QAMS法在测定菊苣中绿原酸、秦皮乙素、异绿原酸B、异绿原酸A的量时具有较高的重现性、稳定性及可信度，丰富了菊苣药材的质量评价方法，并为QAMS技术在中药质量控制中的推广和应用提供了更充分的参考和依据。