醋延胡索配方颗粒为罂粟科紫堇属植物延胡索Corydalis yanhusuo W. T. Wang的干燥块茎经醋炮制后加工而成的颗粒剂，作为醋延胡索饮片的免煎形式，供临床配方使用。药理及化学成分研究表明，延胡索中主要有效成分是生物碱类成分，具有镇痛、镇静、降压、抗心律失常等作用；其中绝多数属于异喹啉类生物碱，根据母核类型的不同又可以分为原小檗碱类，如延胡索甲素、延胡索乙素、脱氢紫堇碱等；阿朴菲类，如海罂粟碱、去氢海罂粟碱等；普托品类，如原阿片碱等^{[1, 2]}。目前，醋延胡索配方颗粒暂无国家标准，其有效成分定量测定方法的研究^[3]与大多数延胡索药材、饮片以及含延胡索的其他中成药制剂质量标准类似，以延胡索乙素作为定量测定的指标成分，质控指标单一，专属性不强^{[4, 5, 6]}。研究表明，配方颗粒的质控标准与原药材应有所差异^{[7, 8]}。因此，本实验从多种有效成分同时监控的角度出发，建立一种RP-HPLC法同时测定醋延胡索配方颗粒中原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、脱氢紫堇碱、延胡索乙素、四氢小檗碱和延胡索甲素7种生物碱的方法，为醋延胡索配方颗粒国家标准的制定提供参考。

Agilent 1260高效液相色谱仪，包括DAD检测器，四元泵，自动进样器、化学工作站等，美国Agilent公司；XS204电子天平和XP26电子天平，瑞士梅特勒-托利多公司。

对照品原阿片碱（批号110853-201003，质量分数为99.9%）、盐酸巴马汀（批号110732-201108，质量分数为86.2%）、盐酸小檗碱（批号110713- 200911，质量分数为86.8%）、延胡索乙素（批号110726-201213，质量分数为99.8%），中国食品药品检定研究院提供；对照品脱氢紫堇碱（批号13060621，质量分数为98.0%）、四氢小檗碱（批号13061823，质量分数为98.0%），上海同田生物技术股份有限公司；对照品延胡索甲素（批号130429，质量分数为98.0%）购自四川省维克奇生物科技有限公司。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂为分析纯。

12批醋延胡索配方颗粒分别由华润三九医药股份有限公司（批号130706-1、130706-2）、四川新绿色药业科技发展股份有限公司（批号03096、03108）、广东一方制药有限公司（批号130710-1、130710-2）、江阴天江药业有限公司（批号130516-1、130516-2）、培力（南宁）药业有限公司（批号130615-1、130615-2）和北京康仁堂药业有限公司（批号131202、140114）提供。

色谱柱Ultimate AQ-C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温35 ℃；流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液（三乙胺调pH值至6.0），梯度洗脱：0～26 min，10%～25%乙腈；26～40 min，25%～28%乙腈；40～55 min，28%～65%乙腈；55～70 min，65%～80%乙腈；70～75 min，80%乙腈；体积流量为1.0 mL/min；检测波长为280 nm；进样量为10 μL。理论板数按脱氢紫堇碱峰计算应不低于5 000。色谱图见图 1。

图 1

Fig. 1

图 1 混合对照品溶液 (A) 和醋延胡索配方颗粒供试品溶液 (B) HPLC图 Fig. 1 HPLC of mixed reference solution (A) and sample solution of Cuyanhusuo Granule (B)

精密称取原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、脱氢紫堇碱、延胡索乙素、四氢小檗碱和延胡索甲素对照品适量，加甲醇制成含原阿片碱4 μg/mL、盐酸巴马汀16 μg/mL、盐酸小檗碱4 μg/mL、脱氢紫堇碱40 μg/mL、延胡索乙素20 μg/mL、四氢小檗碱4 μg/mL和延胡索甲素12 μg/mL的混合对照品溶液，摇匀，即得。

取装量差异项下的本品，混匀，研细，取约0.2 g，精密称定，置平底烧瓶中，精密加入甲醇20 mL，称定质量，加热回流40 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

分别精密吸取“2.2”项下制备的混合对照品贮备溶液2、5、10、15、20、25、30、35 μL，按“2.1”项下色谱条件测定峰面积。以对照品的进样量为横坐标（X），相应色谱峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归，得到7个生物碱成分的标准曲线方程、相关系数（r）和线性范围，结果分别为原阿片碱Y＝6 658.3 X＋9.829 2，r＝0.999 9，6.8～119.0 ng；盐酸巴马汀Y＝24 916 X－98.63，r＝0.999 9，24.38～426.65 ng；盐酸小檗碱Y＝20 634 X－37.041，r＝0.999 9，8.88～155.40 ng；脱氢紫堇碱Y＝20 290 X－58.336，r＝0.999 9， 77.66～1 359.05 ng；延胡索乙素Y＝5 442.4 X＋39.163，r＝0.999 9，41.4～724.5 ng；四氢小檗碱Y＝5 138 X－1.387 4，r＝0.999 7，6.7～117.25 ng；延胡索甲素Y＝4 960.1 X＋69.149，r＝0.999 9，25.50～446.25 ng。

精密吸取同一对照品溶液10 μL，重复进样6次，记录峰面积。结果显示，原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、脱氢紫堇碱、延胡索乙素、四氢小檗碱和延胡索甲素的峰面积RSD值分别为1.5%、1.8%、2.0%、0.9%、1.2%、1.5%、1.5%，表明仪器精密度良好。

取同一批醋延胡索配方颗粒（批号G1307001）6份，按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，结果显示，原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、脱氢紫堇碱、延胡索乙素、四氢小檗碱和延胡索甲素的平均质量分数分别为0.93、1.04、0.24、5.87、1.38、0.19、1.13 mg/g，RSD分别为2.5%、2.4%、2.7%、2.7%、1.8%、2.3%、2.3%，表明方法的重复性良好。

精密吸取同一供试品溶液各10 μL，按“2.1”项下色谱条件分别于0、2、4、8、12、24 h进样测定，结果显示原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、脱氢紫堇碱、延胡索乙素、四氢小檗碱和延胡索甲素的平均质量分数分别为0.93、1.05、0.25、5.96、1.40、0.19、1.13 mg/g，RSD分别为2.4%、1.7%、1.6%、2.9%、2.7%、2.7%、1.8%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

精密称取已测定的供试品（批号G1307001）6份，每份约0.1 g，分别置平底烧瓶中，精密加入混合对照品（原阿片碱4.967 53 μg/mL、盐酸巴马汀4.922 02 μg/mL、盐酸小檗碱0.982 14 μg/mL、脱氢紫堇碱28.478 8 μg/mL、延胡索乙素6.793 9 μg/mL、四氢小檗碱0.951 58 μg/mL、延胡索甲素5.338 55 μg/mL）甲醇溶液20 mL，按“2.3”项下方法制备，依法测定，计算回收率。原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、脱氢紫堇碱、延胡索乙素、四氢小檗碱和延胡索甲素的平均回收率分别为98.2%、99.6%、100.2%、99.0%、100.8%、98.7%、97.7%，RSD分别为2.0%、2.8%、1.3%、2.2%、2.6%、2.5%、2.2%。

取收集到的12批样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，依法测定，用外标法计算样品中原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、脱氢紫堇碱、延胡索乙素、四氢小檗碱和延胡索甲素的量，结果见表 1。

表 1 (Table 1)

表 1 样品测定结果 (n= 2) Table 1 Determination results of samples (n = 2) 批号 质量分数/(mg∙g−1) 原阿片碱 盐酸巴马汀 盐酸小檗碱 脱氢紫堇碱 延胡索乙素 四氢小檗碱 延胡索甲素 130706-1 0.84 0.76 0.20 4.29 1.79 0.32 1.69 130706-2 0.77 0.52 0.13 2.81 1.36 0.23 1.11 03096 0.67 0.64 0.18 4.39 1.35 0.22 0.90 03108 0.66 0.64 0.17 4.35 1.33 0.22 0.89 130710-1 0.93 1.04 0.24 5.87 1.38 0.19 1.13 130710-2 0.85 0.96 0.25 5.59 1.30 0.18 1.03 130516-1 0.70 0.63 0.20 3.53 1.36 0.25 1.35 130516-2 1.09 0.90 0.31 4.31 1.71 0.30 1.33 130615-1 0.93 0.48 0.19 3.01 2.11 0.45 2.69 130615-2 0.91 0.47 0.19 2.98 2.16 0.46 2.92 131202 0.72 0.75 0.19 4.27 1.26 0.19 1.05 140114 0.81 1.02 0.30 5.71 1.40 0.20 1.14

表 1 样品测定结果 (n= 2) Table 1 Determination results of samples (n = 2)

醋延胡索配方颗粒由醋延胡索经水煎煮制成。目前《中国药典》2010年版一部^[9]中与延胡索相关的定量测定方法研究主要以延胡索乙素作为定量测定的指标成分^[10]，但延胡索乙素的专属性不强，在同科属药材夏天无中的量也较高。

鉴于醋延胡索配方颗粒已经失去了药材饮片原来的外观特征，无法在性状鉴别中辨别真伪，若单以延胡索乙素作为质控目标，明显不合理，前期的研究表明延胡索乙素只是延胡索其中一种生物碱，其量也不算最高。因此，本研究首次建立一种RP-HPLC法同时测定醋延胡索配方颗粒中原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、脱氢紫堇碱、延胡索乙素、四氢小檗碱和延胡索甲素7种生物碱的量，方法简便，准确，重现性好，可实现对醋延胡索配方颗粒有效成分更全面、更专属的质量控制，为其国家标准的制定提供参考。

在检测波长的选择上，在波长210～400 nm对7种生物碱对照品溶液进行全扫描，结果表明，7种生物碱在在（280±2）nm波长处均有较大吸收，因此选择280 nm作为检测波长。

实验中比较了不同提取溶剂（甲醇、甲醇-浓氨试液、50%甲醇和水）以及不同提取方法（超声提取和加热回流提取）的提取效果，结果显示，甲醇加热回流提取的效果最理想；另外，对加热回流的时间（20、40、60、120 min）进行了考察，结果表明加热回流提取40 min即可。因此，最终确定供试品溶液的制备方法为甲醇加热回流提取40 min。

由样品的测定结果可见，不同企业生产的醋延胡索配方颗粒中盐酸巴马汀、脱氢紫堇碱、延胡索甲素等成分的量差异较大，这可能与投料醋延胡索饮片的质量、企业的工艺条件等因素有关。其次，所测定7种生物碱质量分数之间的差别也很大（0.18～5.87 mg/g），因此可以考虑以质量分数较高的几个生物碱（如脱氢紫堇碱、延胡索乙素、延胡索甲素等）的总量作为质量评价指标。

7种生物碱可根据母核类型的不同进行区分，每种类型的生物碱也可以考虑采用一测多评方法测定同类型生物碱的量，以减少对照品的使用。