仙灵骨葆胶囊（Xianling Gubao Capsule，XGC）是具有贵州特色的苗药，主要用于治疗老年骨质疏松的中药制剂，收载于《国家中成药标准汇编骨伤科》分册，由淫羊藿、续断、补骨脂、丹参、知母和地黄6味中药组成，具有滋补肝肾、接骨续筋、强筋健骨的功效，可用于肝肾不足、瘀血阻络所致骨质疏松症的治疗^[1-2]。方中以淫羊藿补肾壮阳为主药，续断补肝肾、强筋骨、调血脉、续折伤，补骨脂温阳补肾共为辅药，目前文献多以淫羊藿苷、朝藿定C等进行定量研究并控制，或以川续断皂苷VI、补骨脂素等分别进行研究^[3-10]，从传统的中医药观点来看，单一指标成分的控制难以真正体现中药的功效，尤其是复方制剂，检测任何一种指标成分均不能反映其整体疗效^[11-12]。多成分测定是发展趋势，一测多评^[13-16]、内标多控^[17-18]及多指标成分定量^[19-20]等已多有报道。因此，本实验探讨基于指纹图谱的相对保留时间定位的一测多评法在XGC中多成分检测，并对其进行科学评价，为该品种多指标质量评价提供参考。

安捷伦1200型高效液相色谱仪，美国安捷伦有限公司，包括VWD、DAD检测器；XS105Du电子天平，梅特勒-托利多公司；DS-350L超声波萃取仪，福州德森精工有限公司；DQ5超纯水制水机，密里博中国有限公司。

甲醇，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；乙腈，色谱纯，默克化工技术（上海）有限公司；超纯水自制。

对照品淫羊藿苷（批号110737-200415，质量分数按100%计）、朝藿定C（批号111780-200801，质量分数按99.1%计）、川续断皂苷VI（批号111685-200802，质量分数按92.5%计），补骨脂素（批号110739-201115，质量分数按99.3%计），异补骨脂素（批号110738-201012，质量分数按100%计），均由中国食品药品检定研究院提供。XGC，批号1505028、1406053、1504051、1505024、1407016，贵州同济堂制药有限公司。

设样品中淫羊藿苷的峰面积为A_Y，浓度为C_Y，则f_Y=A_Y/C_Y。样品中朝藿定C与淫羊藿苷的相对校正因子为f=f_Y/f_C=A_YC_C/(A_CC_Y)。由此，可得朝藿定C定量计算公式：C_C=fA_CC_Y/A_Y。式中A_C为朝藿定C峰面积，C_C为质量浓度。其他组分川续断皂苷VI、补骨脂素、异补骨脂素的校正因子以此类推计算即得。

色谱柱为月旭Ultimate^® XB-C₁₈柱（250 mm×4.5 mm，5 μm）；流动相为乙腈-水，梯度洗脱：0~30 min，5%~60%乙腈；30~35 min，60%~80%乙腈；35~40 min，80%乙腈；40~45 min，80%~5%乙腈；检测波长：0~23 min，212 nm；24~45 min，246 nm；体积流量1.0 mL；柱温25 ℃。按上述色谱条件，各指标成分分离度均大于1.5，按川续断皂苷VI峰计算理论塔板数不低于5 000。

精密称取淫羊藿苷10.25 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得A贮备液；朝藿定C 28.05 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得B贮备液；川续断皂苷VI 15.58 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得C贮备液；补骨脂素13.55 mg、异补骨脂素16.60 mg，置同一50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得D贮备液。再精密量取A贮备液1 mL、B贮备液2.5 mL、C贮备液5 mL、D贮备液1 mL，置同一25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。

取供试品内容物约1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，超声处理（功率140 W，频率42 kHz）45 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

按处方比例及制法制备不含续断及补骨脂的粉末，按“2.4”项同法提取，得阴性对照溶液，按“2.2”项色谱条件测定。结果阴性对照分别在川续断皂苷VI、补骨脂素及异补骨脂素相应的保留时间处无干扰，见图 1。

1-朝藿定C 2-淫羊藿苷3-川续断皂苷VI 4-异补骨脂素5-补骨脂素 1-epimedin C 2-isopsoralenin 3-asperosaponin VI 4-psoralen 5-icariin 图 1 混合对照品(A)、XGC样品(B)和阴性对照(C)的HPLC图 Fig.1 HPLC of mixed reference substances (A), XGC sample (B), and blank sample (C)

分别精密吸取对照品溶液0.5、1、2、5、10、20 μL，按上述色谱条件进样测定，以峰面积为纵坐标（X），以各指标成分的量为横坐标（Y）绘制标准曲线，得回归方程分别为淫羊藿苷Y=2 200.0 X-2.866（r=0.999 5）、朝藿定C Y=1 955.0 X+22.24（r=0.999 6）、川续断皂苷VI Y=209.6 X+4.250（r=0.999 6）、补骨脂素Y=8 979.6 X+13.92（r=0.998 0）、异补骨脂素Y=8 403.5 X+3.068（r=0.998 5），结果表明，各成分的进样量淫羊藿苷在8.2~328.0 ng、朝藿定C在0.055 6~2.224 0 μg、川续断皂苷VI在0.144 1~5.764 0 μg、补骨脂素在5.4~215.2 ng、异补骨脂素在6.6~265.6 ng呈良好线性关系。

精密吸取对照品溶液5 μL，连续进样6次，分别计算峰面积RSD，结果淫羊藿苷的RSD为1.36%、朝藿定C的RSD为0.71%；续断皂苷VI的RSD为0.92%、补骨脂素的RSD为1.05%、异补骨脂素的RSD为0.99%，表明其精密度良好。

取同一供试品（批号为1505028），按“2.4”项下方法制备供试品溶液，室温下放置，分别在0、2、4、8、12、16、24 h测定峰面积，结果淫羊藿苷、朝藿定C、川续断皂苷VI、补骨脂素及异补骨脂素峰面积的RSD分别为1.31%、1.05%、1.29%、1.65%、1.94%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

称取同一供试品（批号为1505028）6份，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项色谱条件测定，结果淫羊藿苷、朝藿定C、川续断皂苷VI、补骨脂素及异补骨脂素峰面积的RSD分别为2.18%、1.96%、1.87%、2.05%、2.14%，表明该方法重复性良好。

精密称取已测定的同批号供试品（批号为1505028）6份（2份1组），每份约0.5 g，分别加入A储备液1、2、3 mL，B储备液1、3、5 mL，C储备液1、3、5 mL，D储备液1、2、3 mL，再精密加入甲醇50 mL，按“2.4”项下方法制备成供试品溶液，供回收率试验用，按“2.2”项色谱条件测定，结果淫羊藿苷、朝藿定C、川续断皂苷VI、补骨脂素及异补骨脂素的平均回收率分别为97.59%、98.58%、98.11%、97.86%、98.22%，RSD分别为1.09%、1.14%、1.29%、0.93%、1.07%。

以淫羊藿苷为基准峰，按“2.1”项下公式分别计算淫羊藿苷对朝藿定C、川续断皂苷VI、补骨脂素及异补骨脂素的相对校正因子见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 相对校正因子 Table 1 Relative correction factors (RCF) 进样体积/μL 相对校正因子 淫羊藿苷 朝藿定C 川续断皂苷VI 异补骨脂素 补骨脂素 0.5 1.00 1.04 9.83 0.22 0.22 1 1.00 1.08 9.96 0.22 0.23 2 1.00 1.09 10.02 0.22 0.22 5 1.00 1.02 9.85 0.22 0.22 10 1.00 1.06 10.49 0.22 0.23 20 1.00 1.10 10.25 0.23 0.23 平均值 1.06 10.07 0.22 0.23 RSD/% 2.92 2.56 2.69 2.59

表 1 相对校正因子 Table 1 Relative correction factors (RCF)

取上述混合对照品溶液，按上述色谱条件考察在4支不同品牌色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）上的色谱行为，以淫羊藿苷为参照峰，测得朝藿定C、川续断皂苷VI、补骨脂素、异补骨脂素的相对保留时间及相对校正因子见表 2。一测多评法定位以淫羊藿苷峰保留时间为参照，计算朝藿定C、川续断皂苷VI、补骨脂素、异补骨脂素的相对保留时间，其相对保留时间应分别在0.98、1.04、1.26、1.31的±5%范围之内；各成分量以淫羊藿苷峰的峰面积为对照，分别乘以相对校正因子1.07、10.09、0.24、0.24计算朝藿定C、川续断皂苷VI、补骨脂素、异补骨脂素的量。

表 2(Table 2)

表 2 不同色谱柱测得的相对保留时间及相对校正因子 Table 2 RRT and RCF of different brands columns 色谱柱 相对保留时间 相对校正因子 朝藿定C 川续断皂苷VI 异补骨脂素 补骨脂素 朝藿定C 川续断皂苷VI 异补骨脂素 补骨脂素 月旭Ultimate® XB-C18柱 0.97 1.03 1.24 1.28 1.06 10.07 0.22 0.23 岛津Shim-pack ODS-VP C18柱 1.01 1.09 1.31 1.37 1.10 10.11 0.23 0.24 菲罗门Luna-C18柱 0.95 1.01 1.21 1.27 1.01 10.03 0.25 0.23 安捷伦Zorbax SB-C18柱 0.99 1.04 1.27 1.32 1.12 10.13 0.24 0.25 平均值 0.98 1.04 1.26 1.31 1.07 10.09 0.24 0.24 RSD/% 2.63 3.26 3.40 3.47 4.53 0.44 5.49 4.03

表 2 不同色谱柱测得的相对保留时间及相对校正因子 Table 2 RRT and RCF of different brands columns

取5批供试品按“2.4”项制备而成的供试品溶液和混合对照品溶液各5 μL，按上述色谱条件测定，分别采用一测多评法和外标法计算5种成分量，采用夹角余弦法计算相似度均大于0.999 7，表明2种方法测定量没有显著性差异，结果见表 3。

表 3(Table 3)

表 3 样品定量测定结果 Table 3 Content determination of sample 样品批号 淫羊藿苷/ (mg·g-1) 朝藿定C/(mg·g-1) 川续断皂苷VI/(mg·g-1) 补骨脂素/(mg·g-1) 异补骨脂素/(mg·g-1) 外标法 一测多评法 外标法 一测多评法 外标法 一测多评法 外标法 一测多评法 1505028 1.43 7.22 7.17 8.62 8.57 0.63 0.61 0.69 0.66 1406053 1.01 6.79 6.83 7.16 7.21 0.89 0.85 0.93 0.90 1504051 1.37 7.88 7.81 9.31 9.25 0.76 0.73 0.78 0.74 1505024 1.10 7.38 7.47 8.26 8.29 0.81 0.79 0.93 0.98 1407016 0.91 6.07 6.17 8.94 9.01 0.79 0.76 0.86 0.90

表 3 样品定量测定结果 Table 3 Content determination of sample

续断、补骨脂为温阳补肾、强筋健骨的要药，在XGC处方中起到滋补肝肾、接骨续筋、强筋健骨的作用，谢琴等^[10]采用多指标成分2个系统分别控制续断及补骨脂的检测方法，为提倡效率、节约能源，本研究用1个系统对多指标成分进行测定，即能显著地提高效率，又可节约有机溶剂，并进一步研究了一测多评法的应用，即节约了对照品，更好地节约能源，又能发挥中药质量控制多指标质量评价等技术来体现中药整体性的作用，更好地控制其质量。

本实验通过不同色谱柱的考察计算确定了朝藿定C、川续断皂苷VI、补骨脂素、异补骨脂素与淫羊藿苷的相对保留时间及相对校正因子，借鉴中药色谱指纹图谱进行相似度评价常用的夹角余弦算法评价一测多评法计算的量与外标法测定的量之间的差异性，结果表明无显著性差异，表明本方法具有很好的可行性和准确性。一测多评法确定的朝藿定C、川续断皂苷VI、补骨脂素、异补骨脂素的相对保留时间分别在0.98、1.04、1.26、1.31的±5%范围之内，相对校正因子分别为1.07、10.09、0.24、0.24，可为XGC一测多评法同时计算5组成的量提供参考。