中药鉴定技术由浅入深可以分为4个主要的发展阶段：感官评价、显微鉴定、理化鉴定、分子鉴定。近些年来，分子鉴定技术正逐步成为中药鉴定的主要手段^[1]。分子鉴定技术是指通过直接分析遗传物质DNA的多态性来推断物种内在的遗传变异而实现药材鉴定的方法。分子鉴定技术主要包括随机引物PCR（RP-PCR）、随机扩增多态性DNA（RAPD）、扩增性简单序列重复（ISSR）、限制性内切酶切片段长度多态性（RFLP）、扩增限制性内切酶片段长度多态性（AFLP）、单核苷酸多态性（SNP）、DNA条形码序列分析。《中国药典》2010年版已将蕲蛇和乌梢蛇的分子鉴定作为评价指标^[2]。本文对分子鉴定的主要技术进行了分析与总结，对其优缺点与主要用途进行了系统归纳，分别从中药材真伪鉴定、中药材正品与替代品鉴定、中药材多基原鉴定和遗传多样性、中药材产地鉴别、中药材年限鉴别5个方面对分子鉴定技术在中药中的应用进行了归纳总结，阐述了分子鉴定技术存在的一些问题及其未来的发展方向。

1 分子鉴定技术的分类

分子鉴定技术的发展可以分为基于传统的Southern杂交技术的分子标记、以PCR为基础的分子标记技术、以重复序列为基础的分子标记技术、以mDNA为基础的分子标记技术、DNA序列分析、DNA条形码技术。主要分子鉴定技术的特点及用途见表 1。

1.1 基于传统的Southern杂交技术的分子标记

主要有RFLP、单链构象多态性RFLP（SSCR-RFLP）、变性梯度凝胶电泳-RFLP（DGGE-RFLP）^[1]。

1.2 以PCR为基础的分子标记技术

主要包括RAPD、标记位点测序（STS）、特征扩增区段测序（SCAR）、RP-PCR、寡核苷酸引物PCR（OP-PCR）、单链构象多态性（SSCR-PCR）、小寡核苷酸DNA分析（SODA）、DNA扩增产物指纹分析（DAF）、AFLP，其中AFLP的应用比较广泛。AFLP是基于PCR技术扩增基因组DNA限制性片段，基因组DNA先用限制性内切酶切割，然后将双链接头连接到DNA片段的末端，接头序列和相邻的限制性位点序列，作为引物结合位点。限制性片段用2种酶切割产生，一种是罕见切割酶，一种是常用切割酶。它结合了RFLP和PCR技术特点，具有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性。由于AFLP扩增可使某一品种出现特定的DNA谱带，而在另一品种中可能无此谱带产生，因此，这种通过引物诱导及DNA扩增后得到的DNA多态性可作为一种分子标记^[3]。

1.3 以重复序列为基础的分子标记技术

主要有卫星DNA（重复单位为几百至几千碱基对）、小卫星DNA（重复单位为大于5 bp）、微卫星DNA（重复单位为2～5 bp）、串珠式重复序列。其中广泛应用的ISSR技术就属于微卫星DNA的一种。ISSR是Zietkeiwitcz等^[4]于1994年发展起来的一种微卫星基础上的分子标记。其基本原理是用锚定的微卫星DNA为引物，即在SSR序列的3’端或5’端加上2～4个随机核苷酸，在PCR反应中，锚定引物可引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增。所扩增的inter SSR区域的多个条带通过聚丙烯酞胺凝胶电泳得以分辨，扩增谱带多为显性表现。

1.4 以mDNA为基础的分子标记技术

主要有差异显示、逆转录PCR（RT-PCR）、差异显示逆转录PCR（DDRT-PCR）、特征性差异分析（RDA）等，其中RT-PCR技术应用比较广泛。RT-PCR或者称反转录PCR，是PCR的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增^[5]。

1.5 DNA序列分析

主要包括线粒体DNA序列分析、叶绿体DNA序列分析、核基因序列分析等。

1.6 DNA条形码技术

DNA条形码技术是利用标准的一段或几段短的基因组DNA片段对生物物种进行快速和准确鉴定的技术^[6]。DNA条形码技术具有高效、准确、易于实现自动化和标准化的优点，克服了对专家及经验的依赖，可以简易化、准确化地对中药进行分析鉴定。目前采用DNA条形码对植物类中药进行分子鉴定，多以ITS2序列为主，以psbA-trnH序列为辅；动物类中药鉴定多以COI序列为主，ITS2为辅助序列。

2 分子鉴定技术在中药中鉴定的应用

分子鉴定技术在中药中的应用主要表现为真伪鉴定、正品与替代品鉴定、多基原鉴定和遗传多样性、产地鉴别、年限鉴别5个方面。

2.1 在中药材真伪鉴定中的应用

采用显微鉴定中药材真伪方法简便，但是对鉴定人的技术水平要求较高，科学依据也不强，化学计量法鉴别中药真伪又比较费时费力。近些年来越来越多的研究者发现，采用分子鉴定技术鉴定中药材真伪方法准确性高，而且比较省时。如蕲蛇^[2]、乌梢蛇^[2]、重楼^[7]、人参^[8]、西洋参^[9]、三七^[10]、紫苏^[11]等都有采用分子鉴定技术进行真伪品的鉴定的报道。

李雪等^[12]以辽藁本Ligusticum jeholense Nakai et Kitag、新疆藁本Conioselinum vaginatium (Spreng.)Thedllung及藁本混伪品白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoofm.)Benth.et Hook.F.ex.Franch.et Savat、石防风Peucedanum terebinthaceum(Fisch.)Fisch.ex Turcz.、当归Angelica sinensis(Oliv.)Diels为鉴定材料，提取总DNA，利用4对候选序列（Nr ITS、ITS2、acc D和trn H-psb A）分别进行PCR扩增，产物进行双向测序。得到的序列采用Codon Code Aligner V2.06进行拼接，Clustal X2.1进行多序列比对，MEGA 5.0计算K-2-P距离，构建系统发育树。结果表明，Nr ITS和ITS2序列能够鉴别辽藁本与新疆藁本及其他混伪品。

罗沛宜等^[13]对25份当归及其混伪品材料的trnL-F和rpoC1序列进行扩增、测序。对序列进行比对、分析，计算材料间的遗传距离并构建系统进化树。结果表明，trnL-F序列在长度变化范围，变异位点和信息位点个数及遗传距离变异幅度上均大于rpoC1序列。trnL-F序列数据显示，当归及其混伪品材料碱基具有显著差别，具有1个特异鉴别SNP位点和1个A碱基重复的特异鉴别区域。当归与混伪品间遗传距离在0.002～0.231。通过trnL-F序列重建的系统发育树能将当归与混伪品有效地区分开。rpoC1序列比对结果无法找出当归及其混伪品间的差异位点，同时其构建系统进化树也无法区别当归及其混伪品。rpoC1序列对当归及其混伪品间的鉴别作用不佳，而trnL-F序列能成功鉴定当归及其混伪品，可作为当归及混伪品的分子鉴定方法。

张春等^[14]利用ISSR-PCR方法对采集和购买的26份当归及其混伪品进行基因组多态性分析，从100条内部简单重复系列引物中筛选出10条多态性好、稳定性高的引物对所有材料进行扩增，共获得96条带，扩增片段大小介于200～2 100 bp，多态性条带85条，占总扩增片段的88.54%。引物UBC848能扩增出1条当归的特异性条带，引物组合UBC848和UBC834可以将正品当归与其混伪品材料区分开来。市售3个未鉴别品种均为当归伪品。根据内部简单重复序列技术分析找到了当归及其混伪品间的特异鉴别引物，4条引物能反映不同来源当归间存在遗传多样性。

2.2 在中药材正品与替代品鉴定中的应用

正品是指药典正式收载的药材，替代品是指与正品亲缘关系较近且药效相似而药典没有收录的药材。分子鉴定技术也可将二者区分开来。康信聪^[15]采用SRAP、ISSR、SCoT分子标记及ITS序列4种分子鉴定技术对冬虫夏草及其替代品北冬虫夏草进行鉴定，比较发现SRAP标记、ISSR标记多态性高达100%，所有菌株都能有效区分，且总体状况一致，可作为北冬虫夏草菌株种内、种间鉴定。而ITS序列则不能够有效区分二者。

彭禄等^[16]通过对17个种共26个独活样本的ITS序列进行PCR扩增和测序。26个样本聚集为5大类群，综合分析后将17种独活归为4大类；重齿毛当归Angelica pubescens Msxim.的ITS序列具有特征碱基片段，可明显区别于其他样本；除牛尾独活类中3个样本不能通过ITS序列鉴定到种以外，其他样本均可以通过ITS序列鉴定到种。ITS序列可为药用独活的鉴定和分类提供有力证据，四带芹类可以作为独活的首选替补品，牛尾独活类其次，九眼独活为最优之选。

王景等^[17]在利用SNP分子标记建立多重PCR体系，实现人参品种大马牙的分子鉴定中，只有大马牙产生了410 bp的特异性条带。将条带切胶回收并经克隆测序验证，该条带确实由大马牙特异性引物Da F和Coxl R扩增得出。建立的多重PCR体系可有效地实现大马牙的快速鉴定，并有望作为大马牙鉴定和田间纯化的一种有效的技术手段。

2.3 在中药材多基原鉴定和遗传多样性中的应用

采用分子鉴定技术鉴定中药基原的研究比较多，如采用ISSR技术考察黄芩^[18]、贝母^[19]、枇杷^[20]、太子参^[21]等药材的遗传多样性，采用RAPD技术对溪黄草^[22]及基原植物进行分类鉴定。

高晓霞等^[23]以白木香、商品沉香及人工诱导沉香为材料，对其进行醇溶性浸出物测定、性状及显微鉴别，提取总DNA、扩增rDNA ITS2片段并直接测定序列，MEGA 5.0软件计算种内、种间Kimura 2-parameter（K2P）遗传距离，并进行系统发育分析，构建邻接树和最大简约树。结果表明，人工沉香、商品沉香醇溶性浸出物量均高于10%，性状和显微鉴别均符合《中国药典》2010年版一部有关规定。沉香种内平均K2P遗传距离为0～0.003，种间平均K2P遗传距离为0.005～0.023。白木香、人工沉香和商品沉香在系统发育树上聚为一支。在沉香性状、显微和理化鉴别、浸出物量分析的基础上，基于ITS2条形码序列可以准确鉴别沉香基原植物，为商品沉香的鉴定提供分子生物学依据。

徐红等^[24]对产于我国甘肃省的中药秦艽的3种基原植物秦艽、麻花秦艽与小秦艽进行RAPD分析，建立具有鉴别意义的DNA指纹图谱。从80条RAPD引物中筛选出4条具有鉴别意义的多态性引物，在3种秦艽中共得到39个DNA条带，其中共有条带2条，多态条带37条。据此获得了能有效区别3种秦艽的多态性RAPD指纹谱。

李华等^[25]采用ISSR分子标记技术对来自全国12个省市不同生态环境的48份绞股蓝种质材料进行遗传多样性及亲缘关系分析。结果100条ISSR引物中共筛选出15条扩增条带清晰、稳定性好且多态性明显的引物，48份材料DNA扩增共获得214个位点，其中多态位点206个，多态性比率96.26%，平均每条引物扩增位点为14.27个；平均观察等位基因数、有效等位基因数、Shannon多样性信息指数和Nei’s基因多样性指数分别为1.962 6、1.335 8、0.221 1和0.359 8；种质材料间的遗传相似系数变幅为0.57～0.96，平均为0.72。利用UPGMA聚类分析，以遗传相似系数0.71为界，48份材料聚为4大类。结论绞股蓝种质材料间的遗传多样性较高，种质间的亲缘关系与其地理分布和生态环境并不完全一致。

王梦亮等^[26]用CTAB法提取基因组DNA，然后通过筛选得到的11个RAPD及11个ISSR引物对不同采集地的4种野生红景天进行遗传多样性分析。结果表明，11条RAPD引物共扩增出96条条带，多态性百分比为90.62%；11条ISSR引物共扩增出102条条带，多态性百分比为100%。ISSR多态性的检测能力优于RAPD；聚类分析结果表明，ISSR、RAPD和ISSR联用法均将17个样品聚为3大类；RAPD将样品聚为4大类。2种标记均可用于红景天属植物种间亲缘关系与种内遗传多样性研究；4种红景天种内存在一定的遗传差异，种间基因流较小。

马艳芝等^[27]以取自不同省份的11份柴胡干品为材料，提取其基因组DNA，进行ISSR分析，利用DPS（V7.5）软件计算遗传距离，利用UPGMA方法进行聚类分析，构建11份柴胡样品的系统进化树。同时，利用ITS引物对柴胡样品进行PCR扩增和测序，利用DNAMAN软件分析11份柴胡种质的ITS序列，对其遗传相似性进行鉴定。11份柴胡样品间遗传距离为0.458 8～0.782 2，表明这11份柴胡样品间遗传基础较狭窄；聚类结果将11份柴胡样品分成2大类，大部分来源相同或相近的柴胡样品聚在一起。ITS序列分析结果表明，11份柴胡样品的ITS序列均长321 bp，也可以分为2类，部分柴胡样品存在同质异名现象。利用ITS技术或将其与ISSR标记相结合对柴胡种质资源进行鉴定和分析，可以提高柴胡种质资源鉴定的准确性和效率。

卢家仕等^[28]采用ISSR分子标记技术和非加权平均距离法（UPGMA）对24份石斛属样品进行遗传多样性和聚类分析。从100条ISSR引物中共筛选出6条多态性稳定、清晰的引物，24份石斛样品共扩增出847个DNA片段，平均每个引物扩增出141个DNA片段，其多态性为100%。结果表明，24份不同产地石斛样品被划分为6个类群，遗传多样性非常丰富。

2.4 在中药材产地鉴别中的应用

中药的产地即中药道地性对中药的质量影响很大，所以对中药材的产地鉴定尤其重要。近年来，人们采用分子鉴定技术对中药进行产地鉴定的研究非常多。徐红等^[29]采用ISSR技术对不同产地丹参药材进行道地鉴别；宋雯舒等^[30]采用DNA分子标记技术结合HPLC法对不同产地金银花进行了鉴定；孙稚颖等^[31]采用ISSR-PCR分子标记技术研究对不同产地的菘蓝进行鉴定。

朱田田等^[32]应用ISSR分子标记技术对甘肃省不同产区41个居群的栽培当归样本进行分析，利用Popgene 32软件分析Nei’s基因多样性指数等遗传信息参数，应用Ntsys软件构建亲缘关系UPGMA聚类图。结果表明，8条引物共检测到154个位点，其中多态性位点119个，多态位点百分率为77.27%。栽培当归居群间的多样性指数为0.222 9，Shannon’s多样性信息指数为0.337 4，种群间基因分化系数为0.683 9，基因流为0.231 1，遗传距离变化范围0.042 9～0.327 8。这说明，甘肃栽培当归遗传多样性在物种水平上较高；居群间遗传多样性水平明显高于居群内；居群间遗传分化程度大，且基本无基因交流。

魏晓雨等^[33]采用RAPD和ISSR分子标记技术对我国10个产地的西洋参Panax quinquefolium L.的遗传多样性进行分析，13条RAPD引物共扩增出97条清晰条带，多态性条带81，多态性百分率为85.51%；12条ISSR引物共扩增出99条清晰条带，多态性条带64，多态性百分率为64.65%；通过聚类分析，RAPD及RAPD＋ISSR综合将样品聚为4大类；ISSR将样品聚为2大类。结果表明，RAPD和ISSR标记构建的样品聚类树状图在分类上稍有差异，但总体趋势一致。在ISSR上，人参与西洋参被明显区分开来，吉林兴参镇与北岗镇西洋参与人参聚为一大类；在生长环境及种植条件影响下，东北部分产地西洋参与加拿大西洋参相比在遗传多样性上有所改变。

2.5 在中药材年限鉴别中的应用

Dai等^[34]提取人参细胞中的DNA，利用端粒长度和端粒酶活性对人参生长年限进行鉴别，通过染色体末端限制片段（TRFs）分析人参平均端粒长度发现，自第2年起，人参端粒长度随其年限的延长而增长，并在此基础上建立了人参年限与端粒长度相关的数学模型。

吴文如等^[35]采集不同生长年限、不同品种和产地的人参样品，提取RNA，逆转录为cDNA。采用巢式PCR进行扩增，根据人参达玛烯二醇合成酶基因cDNA保守序列设计1组引物用于第1轮PCR，2组DS基因上下游分段引物用于第2轮PCR，扩增产物直接测序。57份人参样本共获得111个符合测序要求的DS基因上下游分段PCR产物，其中测序成功103个，序列经BLAST判定为人参DS基因，经多重比对，发现6个样品存在7个SNP位点。建立了巢式PCR-直接测序法发掘人参DS基因cDNA序列的SNP，方法具有特异性好、操作简单、结果准确等优点，可用于检测人参样品的DS基因是否含有SNP及其类型，这可为人参及其相关药材和产品的质量评价新方法研究提供有价值的遗传研究工具和分子标记资源。

杨星宇等^[36]通过对水杉不同年限及不同部位的木材DNA提取及片段扩增实验，结果显示改良后的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法、SDS法及高盐低pH法均可以用于水杉木材DNA的提取，经过纯化后的木材DNA可以进行片段扩增。在提取木材DNA过程中，边材比心材更适合，所提取的DNA数量和质量更有保障；实验显示水杉木材DNA分子大多为23 kb。运用DNA条形码筛选分析、序列特征分析、遗传距离秩和检验、barcoding gap检验，进行木材DNA分子系列物种鉴定，结果表明序列ITS2、trnL-F比较适合其DNA条形码技术要求，可以作为水杉木材鉴定序列。

3 分子鉴定技术在中药中应用的问题与前景 3.1 分子鉴定技术在中药中应用的问题

近些年来，中药分子鉴定技术被广泛应用，得到了快速的发展。但发展同时，也遇到了一些需要解决的问题。肖小河等^[37]在关于道地药材分子鉴定时指出，目前DNA分子遗传标记技术在道地药材鉴定中受到2个方面的局限：一是来自技术本身的，如目标基因的真实性与DNA同源性，DNA分子标记结果的重现性和稳定性；二是来自研究对象的，不是所有的道地药材形成都会留下DNA差异“烙印”，同时这种DNA差异也不见得与道地性的形成有直接或间接的相关。随着分子系统学研究的深入和DNA条形码技术的广泛应用，第一个问题已经得到了解决，陈士林团队^[38]发现的ITS2序列能真实反映所鉴定中药的遗传本质，并且具有良好的稳定性和重现性。但是，第2个问题仍然困扰着中药的分子鉴定。Meyer等^[39]认为，准确的物种分子鉴定，是利用已知物种的分子序列与未知样品序列进行比较从而判断其归属的过程，这就要求首先构建一个充分体现种内变异和种间分化的完整的参考序列数据库，用以进行系统进化分析和准确的物种界定。

3.2 分子鉴定技术在中药中应用的前景

黄璐琦^[40]将分子生物学与中药资源研究有机结合，应用Cytb序列对蕲蛇和乌梢蛇进行PCR扩增鉴别，有效地将二者区分，此方法已经被《中国药典》2010年版收录。陈士林等^[38]研究ITS2序列已经被广泛应用于中药鉴定研究中，大量的ISSR、RAPD、AFLP技术在中药材遗传多样性方面也已经成熟，这说明中药的分子鉴定时代的到来。虽然目前分子鉴定技术还属于起步和发展阶段，但随着科学的进步和广大研究者的不断努力，相信分子鉴定技术将成为中药材鉴定的主流技术，为中国中医药走向世界提供有力的支持与保障。