胶艾汤出自东汉张仲景《金匮要略》^[1]，全方由阿胶、艾叶、甘草、当归、川芎、白芍、生地黄7味中药组成，临床主要用于治疗妇人月水过多或妊娠下血、腹中疼痛，为传统经方，产科要方。实验研究^[2]发现胶艾汤具有补血作用，且本实验室前期研究也已经证实了胶艾汤的补血作用^[3]，但胶艾汤补血作用的物质基础尚不明确，因此，本研究采用血虚模型大鼠筛选胶艾汤补血作用的有效部位，为深入研究胶艾汤补血作用的物质基础提供依据。

当归、川芎、白芍、生地黄、艾叶、甘草饮片均购于安徽丰源铜陵中药饮片有限公司，批号分别为121203、121203、121106、120908、121106、120908；阿胶购于山东福胶集团东阿镇阿胶有限公司，批号为120612；上述各饮片均经南京中医药大学段金廒教授鉴定，分别为伞形科植物当归Angelica sinensis (Oliv.) Diels. 的干燥根、伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort. 的干燥根茎、毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall. 的干燥根、玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch. 的干燥块根、菊科植物艾Artemisia argyi Lévl. et Vant. 的干燥叶、豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch. 的干燥根茎和马科动物驴Equus asinus L. 的鲜皮经加工而成。

血液细胞分析仪（ABX Pentra XL80），Anke-LXJ-11B离心机（上海安寿科学仪器厂），Waters I Class超高效液相色谱仪（美国沃特世公司），SHANGPING YP601N型1/10电子天平（上海精密科学仪器有限公司），分析天平（Sartoriusag；BP211D，d＝0.01 mg），紫外/可见分光光度计（PerkinElmer），超声波清洗机（南京以马内利仪器设备有限公司，功率500 W，频率50 Hz）。

复方阿胶浆（山东东阿阿胶股份有限公司，批号1408002）。乙二胺四乙酸二钠（EDTA，国药集团化学试剂有限公司）；肝素（中国惠兴生化试剂有限公司）；水合氯醛、NaCl（国药集团化学试剂有限公司）；超微量Na⁺,K⁺-ATP酶和Ca²⁺,Mg²⁺-ATP酶试剂盒（南京建成生物工程研究所）；白细胞介素2（IL-2）、促红细胞生成素（EPO）ELISA检测试剂盒（南京森贝伽生物科技有限公司）；乙腈为色谱纯（Merck），超纯水自制，甲酸为色谱纯（ACS）。芍药苷、甘草酸铵、甘草苷、磷酸川芎嗪、绿原酸、香草酸对照品均购自中国食品药品检定研究院，批号分别为110736-201136、110731-201116、111610-201106、100845-201002、110753-200413、110776-200402，各对照品质量分数均在98%以上；苯甲酰芍药苷对照品购自MUST公司，批号为MUST-13030401，质量分数在98%以上；原儿茶酸、阿魏酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷、没食子酸对照品均购自中国食品药品检定研究院，批号分别为110809-200604、0773-9910、110885-200102、111530-200505、110831-200302，各对照品质量分数均在99%以上。

清洁级雌性SD大鼠80只，体质量180～220 g，由浙江省实验动物中心提供，许可证号SCXK（浙）2014-0001。

称取胶艾汤组方各药材饮片共2880 g，依文献方法进行煎煮^[4]，水煎液减压浓缩得到胶艾汤浸膏1 637.1 g（得率56.84%），取胶艾汤浸膏适量减压真空干燥，得胶艾汤干燥粉末，保存备用。剩余浸膏趁热用硅藻土拌样（硅藻土-浸膏 1∶1.5）后置减压真空干燥箱55 ℃烘干。再采用系统溶剂提取法对胶艾汤干燥药粉进行提取，各溶剂提取物减压真空干燥至干，分别得石油醚部位浸膏6.5 g（得率0.23%）、醋酸乙酯部位浸膏40.2 g（得率1.40%）、正丁醇部位浸膏268.8 g（得率9.30%）、水部位浸膏492.0 g（得率17.08%）。分别称取适量的胶艾汤及4个提取部位浸膏，加0.5% CMC-Na溶液适量，制得质量浓度（按生药量计算）均为1.20 g/mL的各供试品溶液，各供试品溶液置4 ℃冰箱内保存备用。

按照随机数字表法将实验动物随机分为8组，每组10只，分别为对照组，模型组，复方阿胶浆（0.15 g/kg）组，胶艾汤组，胶艾汤石油醚、醋酸乙酯、正丁醇、水部位组。各给药组均按照临床给药剂量2倍折算成动物给药剂量，即胶艾汤组和胶艾汤石油醚、醋酸乙酯、正丁醇、水部位组给药剂量均为12 g/kg（按生药量计算），按10 mL/kg给药量ig给予相应药物，复方阿胶浆组按12 mL/kg剂量ig给予复方阿胶浆（相当于临床给药量的2倍），对照组与模型组按10 mL/kg体积ig 0.5% CMC-Na溶液，各组均每天给药1次，连续给药12 d。造模与给药同步进行。

参照文献方法复制大鼠血虚模型^[4]。取SD大鼠，按5.0 mL/kg放血量连续放血12 d，复制大鼠血虚模型。

造模期间，每天记录大鼠体质量变化，观察其反应敏捷度、毛色等的变化。各组大鼠均于造模第12天眼底静脉丛采血1 mL，以15 mg/mL EDTA（1∶9）抗凝，采用ABX Pentra XL80五分类26项血液细胞分析仪进行血常规检测，主要指标包括红细胞计数（RBC）、血小板计数（PLT）、血红蛋白（HGB）、红细胞压积（HCT）4项指标；静脉丛采血后的大鼠以10%水合氯醛麻醉，颈总动脉取血，以5 mg/mL肝素抗凝（1∶9），全血按照超微量Na⁺,K⁺-ATP酶和Ca²⁺,Mg²⁺-ATP酶试剂盒说明书测定Na⁺,K⁺-ATP酶和Ca²⁺,Mg²⁺-ATP酶活性；另取全血2 mL（不加抗凝剂）静置30 min后以3 000 r/min离心10 min，取上层血清用96T按照ELISA试剂盒说明书测定血清中IL-2和EPO水平。大鼠处死后，迅速摘取脾脏、胸腺称质量，计算各脏器指数（脾脏指数＝脾脏质量/体质量，胸腺指数＝胸腺质量/体质量）。

T3色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相为0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱程序：0～2 min，0～8% B；2～4 min，8%～15% B；4～9 min，15%～35% B；9～12 min，35%～100% B；12～13 min，100% B；13～15 min，100%～1% B；15～16 min，1% B；柱温30 ℃；体积流量0.4 mL/min，进样量2 μL；检测波长254 nm。

分别取胶艾汤浸膏782.0 mg、石油醚部位浸膏4.3 mg、醋酸乙酯部位浸膏20.8 mg、正丁醇部位浸膏138.9 mg、水部位浸膏240.9 mg置25 mL量瓶中，加30%乙腈20 mL超声溶解，定容至刻度，13 000 r/min离心10 min，取上清液，以0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

分别取甘草苷21.33 mg、原儿茶酸12.65 mg、苯甲酰芍药苷6 58 mg、甘草酸铵17.05 mg、磷酸川芎嗪59.23 mg、绿原酸29.27 mg、阿魏酸31.64 mg、毛蕊花糖苷5.54 mg、芍药苷19.70 mg、咖啡酸21.95 mg、没食子酸48.83 mg、香草酸33.50 mg，置25 mL量瓶中，加30%乙腈20 mL溶解，定容至刻度，即得。

采用SPSS 17.0统计软件对数据进行双样本t检验及方差分析，所有实验数据均采用x±s表示。

对照组大鼠体质量呈平稳上升趋势，皮毛光泽而密，精神饱满，反应敏捷；血虚模型大鼠，随放血次数增多，体质量呈下降趋势，反应迟钝，精神萎靡，毛发蓬松无光泽。

与对照组比较，模型组大鼠RBC、HGB、HCT、PLT均明显降低（P＜0.05、0.01）。与模型组比较，胶艾汤组和正丁醇部位组可明显升高大鼠HCT、RBC、HGB、PLT（P＜0.05、0.01）；复方阿胶浆组、石油醚组、水部位组可明显升高PLT（P＜0.05、0.01）；复方阿胶浆组可明显升高RBC（P＜0.01）。结果见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 胶艾汤及其各提取部位对血虚模型大鼠外周血象的影响 (x±s,n = 10) Table 1 Effects of JAD and different extraction parts on peripheral hemogram in blood deficiency model rats (x±s,n = 10) 组别 剂量/(g·kg-1) RBC/(×1012∙L-1) HGB/(g∙L-1) HCT/(L∙L-1) PLT/(×109∙L-1) 对照 — 7.65±1.05 140.55± 8.32 40.15±5.43 1 315.20±278.51 模型 — 4.00±0.48## 87.29±11.27## 25.32±3.35## 1 089.30±124.82# 复方阿胶浆 0.15 4.58±0.30** 92.11± 6.36 27.50±2.02 1 352.50± 93.58** 胶艾汤 12 4.59±0.36** 96.72± 5.29 28.99±1.70** 1 209.44± 91.94 石油醚部位 12 4.29±0.50 88.63±11.58 27.06±3.15 1 295.89±173.01** 醋酸乙酯部位 12 4.27±0.31 88.73± 7.62 26.98±2.11 1 263.00±251.82 正丁醇部位 12 4.59±0.65 98.29± 9.53 29.52±3.04** 1 309.60±225.15 水部位 12 4.26±0.46 91.62± 9.51 27.74±2.67 1 283.00±183.46 与对照组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01，下同 #P < 0.05 ##P < 0.01 vs control group; P < 0.05 **P < 0.01 vs model group,same as below

表 1 胶艾汤及其各提取部位对血虚模型大鼠外周血象的影响 (x±s,n = 10) Table 1 Effects of JAD and different extraction parts on peripheral hemogram in blood deficiency model rats (x±s,n = 10)

与对照组比较，模型组大鼠脾脏指数明显升高（P＜0.01）、胸腺指数明显降低（P＜0.01）。与模型组比较，正丁醇组、复方阿胶浆组、胶艾汤组可明显降低脾脏指数、升高胸腺指数（P＜0.05、0.01）；醋酸乙酯组、石油醚组可明显降低脾脏指数（P＜0.05、0.01）。结果见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 胶艾汤及其各提取部位对血虚模型大鼠脾脏和胸腺指数的影响(x±s,n = 10) Table 2 Effects of JAD and different extraction parts on indexes of spleen and thymus in blood deficiency model rats (x±s,n = 10) 组别 剂量/ (g·kg-1) 脾脏指数/ (mg∙g-1) 胸腺指数/ (mg∙g-1) 对照 — 2.69±0.59 2.08±0.28 模型 — 5.04±0.61## 1.74±0.21## 复方阿胶浆 0.15 3.66±0.43** 1.96±0.24 胶艾汤 12 4.38±0.62 1.98±0.28 石油醚部位 12 4.17±0.77 1.91±0.39 醋酸乙酯部位 12 4.13±0.70** 1.75±0.36 正丁醇部位 12 4.05±0.78** 2.11±0.33** 水部位 12 4.63±0.97 1.96±0.39

表 2 胶艾汤及其各提取部位对血虚模型大鼠脾脏和胸腺指数的影响(x±s,n = 10) Table 2 Effects of JAD and different extraction parts on indexes of spleen and thymus in blood deficiency model rats (x±s,n = 10)

与对照组比较，模型组大鼠血清IL-2明显降低（P＜0.01）、EPO明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，正丁醇组、石油醚组、胶艾汤组可明显升高大鼠血清IL-2（P＜0.05、0.01）；胶艾汤组、石油醚组、醋酸乙酯组、水部位组、正丁醇组可明显降低大鼠血清EPO（P＜0.01，P＜0.05）。结果见表 3。

表 3(Table 3)

表 3 胶艾汤及其各提取部位对血虚模型大鼠血清IL-2、EPO水平和红细胞膜能量代谢酶活性的影响 (x±s,n = 10) Table 3 Effects of JAD and different extraction parts on levels of IL-2 and EPO and energy metabolism enzyme of red cell membrane in blood deficiency model rats (x±s,n = 10) 组别 剂量/(g·kg-1) IL-2/(ng·L-1) EPO/(U·L-1) Na+,K+-ATP酶/U (1×107个RBC) Ca2+,Mg2+-ATP酶/U (1×107个RBC) 对照 — 1 292.94±43.53 13.22±1.03 9.52±1.78 5.98±1.67 模型 — 1 022.66±37.11## 19.71±0.84## 6.48±1.74## 4.43±1.14# 复方阿胶浆 0.15 1 028.11±80.61 19.17±1.74 9.19±1.35** 5.58±0.60 胶艾汤 12 1 077.83±49.55 17.81±1.02** 9.04±0.52** 6.02±1.09 石油醚部位 12 1 114.65±46.18** 16.98±0.78** 6.76±0.71 5.42±0.87 醋酸乙酯部位 12 1 028.43±41.63 17.20±0.66** 6.81±1.93 5.81±0.68 正丁醇部位 12 1 088.30±52.76** 18.84±0.64 9.24±1.97 6.60±1.10** 水部位 12 1 057.10±49.49 13.38±1.04** 7.31±1.41 4.91±1.26

表 3 胶艾汤及其各提取部位对血虚模型大鼠血清IL-2、EPO水平和红细胞膜能量代谢酶活性的影响 (x±s,n = 10) Table 3 Effects of JAD and different extraction parts on levels of IL-2 and EPO and energy metabolism enzyme of red cell membrane in blood deficiency model rats (x±s,n = 10)

与对照组比较，模型组大鼠全血红细胞膜Na⁺,K⁺-ATP酶和Ca²⁺,Mg²⁺-ATP酶活性明显降低（P＜0.05、0.01）。与模型组比较，胶艾汤组、复方阿胶浆组可明显升高Na⁺,K⁺-ATP酶和Ca²⁺,Mg²⁺-ATP酶活性（P＜0.05、0.01）；正丁醇组可明显升高Na⁺,K⁺-ATP酶和Ca²⁺,Mg²⁺-ATP酶活性（P＜0.05、0.01）；醋酸乙酯组可明显升高Ca²⁺,Mg²⁺-ATP酶活性（P＜0.05）。结果见表 3。

对胶艾汤不同提取部位进行UPLC定性分析，由图 1和2可知，胶艾汤醋酸乙酯、正丁醇部位含有共性成分没食子酸、磷酸川芎嗪、绿原酸。此外，胶艾汤正丁醇、水部位还含有原儿茶酸、甘草苷。胶艾汤正丁醇部位中还可以检测到其他提取部位中不含有的咖啡酸、苯甲酰芍药苷以及甘草酸铵。

1-甘草苷 2-原儿茶酸 3-苯甲酰芍药苷 4-甘草酸铵 5-磷酸川芎嗪 6-绿原酸 7-阿魏酸 8-毛蕊花糖苷 9-芍药苷 10-咖啡酸 11-没食子酸 12-香草酸，图 2同 1-liquiritin 2-protocatechuic acid 3-benzoyl paeoniflorin 4-ammonium glycyrrhizinate 5-ligustrazine phosphate 6-chlorogenic acid 7-ferulic acid 8-acteoside 9-paeoniflorin 10-coffee acid 11-gallic acid 12-vanillic acid,same as Fig. 2图 1 各对照品的UPLC色谱图Fig. 1 UPLC of each reference sbustance

图 2 胶艾汤及各提取部位UPLC色谱图Fig. 2 UPLC of JAD and its each extraction part

中医理论认为血虚证即血液亏虚，多因先天禀赋薄弱，后天又失及时调养而致精血不足，气血来源不足而导致^[5]。血虚证涵盖了现代医学以贫血特征为主要表现的多种疾病^[6]，如再生障碍性贫血^[7]、失血性贫血、溶血性贫血等。文献研究表明，目前有关血虚证动物模型的造模方法主要有环磷酰胺（CTX）化学损伤法、⁶⁰Co辐射法、乙酰苯肼（APH）溶血法、乙酰苯肼-环磷酰胺复合法和放血法等。环磷酰胺（CTX）化学损伤法虽操作简单易行，但此法对红细胞的损伤作用不甚明显，且模型动物的血象易自然恢复。APH溶血法通过对红细胞进行缓慢性氧化损伤作用造成血液中红细胞数明显减少，但该方法仅仅能改变模型动物的外周血象，对模型动物的造血系统基本无影响。⁶⁰Co辐射法对设备要求较高，且辐射程度不宜控制。放血法通过使实验动物失血而造成动物血虚模型，与中医上血液亏虚所致的血虚理论相一致，是最接近中医血虚证本质的造模方法，故本实验采用放血法复制动物血虚模型。

复方阿胶浆是在中医“损者益之”“劳者温之”以及“形不足者温之以气，精不足者补之以味”的指导原则下遣药组方而成^[8]，全方由阿胶、红参、熟地黄、党参、山楂5味中药组成^[9]。以往研究^[10]选择复方阿胶浆作为血虚模型实验的阳性药，取得较好的实验效果，故本实验选择复方阿胶浆作为阳性药。

血虚证最直接的病理表现为红细胞数量减少，由于红细胞的主要生理功能为运输氧气，红细胞数量减少导致机体新陈代谢减慢，从而导致红细胞膜上重要的酶蛋白Na⁺,K⁺-ATP酶和Ca²⁺,Mg²⁺-ATP酶活性随机体新陈代谢作用减弱而降低。血虚状态下血液不足或血液的濡养功能减弱导致机体免疫功能低下，免疫器官萎缩而引起免疫器官脏器指数下降。研究表明，脾脏在胎儿期是重要的造血器官，出生后通常不参与造血，但当机体发生贫血时脾脏可恢复造血作用，产生髓外造血，从而导致脾脏肿大^[11]。IL-2和EPO是机体重要的体液因子，研究表明，在缺血缺氧状态下，EPO的量随缺血缺氧时间的延长呈现升高的趋势，且两者具有一定的正相关性，提示EPO的量可以反映贫血程度的轻重^[12]。IL-2是机体重要的免疫增强剂，与机体免疫力呈正相关，故IL-2量也可反映机体免疫力的强弱。本实验研究表明，与对照组比较，模型组大鼠RBC、HGB、HCT、PLT、胸腺指数以及IL-2水平明显降低，Na⁺,K⁺-ATP酶和Ca²⁺,Mg²⁺-ATP酶活性明显减弱，脾脏指数及EPO水平明显升高，表明血虚模型复制成功。与模型组比较，胶艾汤正丁醇组可明显升高大鼠RBC、HGB、PLT、HCT，从而改善外周血象，升高大鼠胸腺指数及血清IL-2水平，增强Na⁺,K⁺-ATP酶和Ca²⁺,Mg²⁺-ATP酶活性，降低脾脏指数及EPO水平。石油醚组可明显升高PLT及IL-2水平，降低脾脏指数及EPO水平。醋酸乙酯组可明显降低脾脏指数及EPO水平，升高Ca²⁺,Mg²⁺-ATP酶活性。水部位组可明显升高PLT，降低EPO的量。UPLC法定性分析胶艾汤各提取部位化学成分结果显示，胶艾汤正丁醇部位检测到其他提取部位中所不含有的咖啡酸，研究表明，咖啡酸具有升血小板、升白细胞数及止血等作用^[13]，推测咖啡酸可能为胶艾汤正丁醇部位发挥补血作用的有效成分之一，且胶艾汤正丁醇部位中含有的没食子酸、原儿茶酸、磷酸川芎嗪以及绿原酸的量均高于胶艾汤其他3个提取部位，结合药理实验数据可初步推测，化学成分种类及量的差异可能是导致胶艾汤不同提取部位补血作用差异的主要原因。综上所述，正丁醇部位是胶艾汤补血作用的最强有效部位，但胶艾汤发挥补血作用的活性成分群以及化学成分与药理作用之间的关联性还需进一步深入研究。