黄芪为《中国药典》2010年版^[1]收载品种，为豆科（Leguminosae）植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var. monghoicus (Bge.) Hisao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. 的干燥根。其主要含皂苷、黄酮、多糖、氨基酸等成分。《中国药典》2010年版、《中药成方制剂》^[2]、《新药转正标准》^[3]共收载含黄芪制剂140个，涉及黄芪中皂苷、黄酮类成分的测定及薄层鉴别项。分析140个药材及成药标准发现，黄芪皂苷均以黄芪皂苷IV为指标成分，方法均采取碱化处理，促使黄芪中黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ转化为黄芪皂苷IV，而后进行测定；黄酮类成分除黄芪药材测定毛蕊异黄酮葡萄糖苷量外，成药多采用薄层方法进行鉴别。上述2类方法很难全面真实反映黄芪药材质量。经实验发现^[4]，不同来源的黄芪药材不经碱化处理时黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ量相差悬殊。各成药处方组成中，黄芪药材君、臣、佐、使作用各不相同，复杂的化学成分体系发挥了不同的药理作用，仅以单一指标成分作为评价手段很难真实地反映药材或产品质量，为此，本实验收集不同产地、不同品种（野生、栽培）的膜荚黄芪、蒙古黄芪共20批，建立皂苷、黄酮类成分的特征图谱，并采用化学计量学分析方法进行深入研究，揭示影响黄芪药材质量的活性成分，从而为质量评价工作以及物质基础研究提供实验依据。

1 仪器与材料

Waters 2695-2996高效液相色谱仪，DAD-ELSD检测器；对照品黄芪甲苷即黄芪皂苷IV（批号110781-200613）、芒柄花素（批号 111703-200602）、毛蕊异黄酮-7-O-葡萄糖苷（批号111920-201001）均购自中国食品药品检定研究院；黄芪皂苷Ⅰ（E-0129）、Ⅱ（E-0130）、Ⅲ（E-0131）质量分数均大于98%，毛蕊异黄酮（E-0156）、芒柄花素-7-O-葡萄糖苷（E-0573）质量分数均大于98%，均购自上海同田生物科技有限公司；试剂均为分析纯、色谱纯，药材由中国食品药品检定研究院中药所张继鉴定为膜荚黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.、野生和日本、甘肃栽培蒙古黄芪 Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao、市售黄芪（未鉴定种），具体样品信息见表 1。

2 方法与结果 2.1 色谱条件 2.1.1 皂苷测定条件^[5]

色谱柱：Agilent SB C₁₈柱（250 mm×4.5 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-水（B），梯度洗脱：0～30 min，32%～45% A；30～35 min，45% A；35～40 min，45%～80% A；40～45 min，80% A；ELSD检测，柱温30 ℃；进样量10 μL。

2.1.2 黄酮测定条件^[6]

色谱柱：Agilent SB C₁₈柱（250 mm×4.5 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.2%甲酸（B），梯度洗脱，0～30 min，16%～40% A；30～35 min，40% A；35～45 min，40%～80% A；检测波长260 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。

2.2 对照品溶液的制备 取黄芪皂苷Ⅰ 10.85 mg、Ⅱ 13.35 mg、Ⅲ 10.60 mg、Ⅳ 12.15 mg至50 mL量瓶；另取毛蕊异黄酮-7-O-葡萄糖苷（13.15 mg）、芒柄花素（12.6 mg）、芒柄花素-7-O-葡萄糖苷13.20 mg、毛蕊异黄酮15.10 mg至25 mL量瓶中，分别加甲醇定容至刻度，配得皂苷、黄酮混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 2.3.1 皂苷类成分供试品溶液的制备^[5]

取药材粉末约4 g，加甲醇40 mL，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加水10 mL，微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇萃取4次，每次40 mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加水5 mL使溶解，放冷，通过大孔吸附树脂，以水50 mL洗脱，弃去水液，再用40%乙醇30 mL洗脱，弃去洗脱液，继用70%乙醇80 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇定容于5 mL量瓶，即得供试品。

2.3.2 黄酮类成分供试品溶液的制备^[6]

取药材粉末（过四号筛）约1 g，置圆底烧瓶中，加入甲醇50 mL，加热回流4 h，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇10 mL，即得供试品。

2.4 方法学考察 2.4.1 指纹图谱的精密度试验 精密吸取“2.3.1”中的皂苷类成分供试品溶液和“2.3.2”项中的黄酮类成分供试品溶液各10 μL，连续进样6次，测得黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷，芒柄花素-7-O-β-D-葡萄糖苷，芒柄花素，毛蕊异黄酮峰面积的RSD分别为1.5%、2.1%、0.9%、1.1%、0.8%、1.1%、1.0%、1.1%。

2.4.2 指纹图谱的稳定性试验

取“2.3.1”中的皂苷类成分供试品溶液和“2.3.2”中的黄酮类成分供试品溶液，在室温下放置，分别在0、2、4、6、12、24 h进样10 μL，测得黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷，芒柄花素-7-O-β-D-葡萄糖苷，芒柄花素，毛蕊异黄酮峰面积的RSD分别为1.9%、2.2%、1.3%、1.7%、1.0%、1.2%、1.5%、1.2%。

2.4.3 指纹图谱的重复性试验

取同一份黄芪样品，按“2.3.1”及“2.3.2”项下方法各制备3份供试品溶液，测得指纹图谱，结果各主要共有峰相对峰面积的RSD在0.10%～0.42%，相对保留时间的RSD在0.08%～0.21%。表明方法重复性较好。

2.5 特征图谱共有模式识别

采用ChemPattern软件，对20批黄芪药材样品色谱图进行比较，20批样品色谱图见图 1。以图 1为基础，对数据进行标准化处理，共有峰筛选选取所有变量，最终形成黄酮、皂苷的共有模式图，并标记相应色谱峰，见图 2、图 3。略去峰面积小于5%的色谱峰，黄酮色谱图选取4、7、8、13、17、19号峰；皂苷色谱图选取3、5、6、7、8、9、11、13、15、16、19号峰，并将黄酮类成分的峰和皂苷类成分的峰号前加“h”和“z”，分别代表黄酮色谱图和皂苷色谱图中峰号对应的化合物，形成黄酮-皂苷的共有模式柱状图，结果见图 4。

2.6 化学计量学分析^{[7, 8, 9, 10, 11]}

采用科迈恩科技有限公司ChemPattern软件对黄芪皂苷、黄酮数据进行化学计量学分析。

2.6.1 主成分分析

主成分分析是一种无监督多变量数据分析法，将原始变量（黄芪皂苷、黄酮各峰峰面积）转换成不相关变量（主成分）。PC1代表最显著数据差异，PC2代表剩余变量中最大数据差异，以此类推。将黄芪皂苷、黄酮共17个特征峰峰面积作为输入变量（20×17）用于主成分分析，结果见图 5。由图 5-A可知，PC1和PC2的总方差贡献率为91.83%（其中，PC1＝70.6%，PC3＝21.23%）。PC1图显示，野生蒙古黄芪和日本栽培蒙古黄芪为 正值，其他品种为负，且载荷得分较高的峰为h13和z19，因此仅根据芒柄花素和黄芪皂苷I量的差异可先将5组样品分为2类。PC2图显示野生蒙古黄芪为正值，日本栽培蒙古黄芪为负，载荷得分高的峰除h13外还有z9、z6。因此，通过h8、z9以及z6的量差异可以再对二者进行区分；膜荚黄芪、甘肃栽培蒙古黄芪、樟树药市购买黄芪在PC1-PC2图中相对集中，不能进行有效区分，需通过PC1-PC3图进行分类识别。由图 5-B显示，PC3上，甘肃栽培蒙古黄芪为正值，膜荚黄芪为负，樟树药市收集黄芪分别接近这2个品种，由载荷得分较高的成分z7、z19、h13可以对样品进行有效识别。综上所述可以发现，z19、h8、z9、z6、z7即黄芪皂苷Ⅰ、芒柄花素、黄芪皂苷IV和2个未知皂苷成分（z7和z6）为影响黄芪药材质量评价的主要成分，其他成分方差贡献总和小于10%，不具代表性。

2.6.2 聚类分析

采用多元统计分析中的聚类分析法，分析参数选取欧氏距离，对20批黄芪药材中皂苷、黄酮类成分进行比较，同时验证主成分分析结果。结果见图 6。由图 6-A可以看出野生蒙古黄芪和日本栽培蒙古黄芪相似度较高可聚为一类，而膜荚黄芪与蒙古黄芪（甘肃栽培品种）可聚为一类，未见明显差别，樟树药市购买黄芪可分别与膜荚黄芪、甘肃栽培蒙古黄芪聚为一类。图 6-B为二维系统聚类图，颜色越接近红色，化学成分聚类程度越高。由图 6-B可知，影响最大的变量参数的峰依次为z19、z7、h13、z6、z9，与主成分分析结果基本一致。上述分析表明，不同品种的黄芪（蒙古黄芪、膜荚黄芪）在化学成分构成上可能相似，不同地域反而导致了化学成分的差异，因此只有制定合理的标准，控制关键性变量才能有效控制药材质量

3 讨论

中药区别于化学合成药，其依靠所含多种成分协同发挥综合药效，仅以1种或2种化学指标很难评价中药的真伪优劣。《中国药典》2010年版规定，黄芪为蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，2个品种可等同入药。统计涉及黄芪药材的相关标准发现，各标准中，多采用碱化处理样品，仅以转化后的黄芪甲苷为指标进行测定。在实际应用中，植物药来源的种属不同，其自身代谢需要从土壤摄取和形成的化学物质也不同，许多随机因素影响了化学成分的组成。本实验同时建立了黄芪中皂苷、黄酮2类成分的特征图谱，并采用化学计量分析法对2类成分的数据进行综合统计分析。结果表明，不同产地、不同品种的黄芪，化学成分存在差异，17个特征成分中，黄芪皂苷Ⅰ、芒柄花素、黄芪皂苷IV、z6（未知皂苷成分）、z7（未知皂苷成分）5个成分的量差异较大，直接影响黄芪药材的质量评价。目前，由于前期收集样品总量有限，制备出的2个未知皂苷类成分不能同时满足核磁、质谱、红外光谱等结构鉴定用量，对于结构的准确确认还需进一步样品收集。同时本研究确定的5种成分是否在药效、毒理方面有明显区别，还需进一步研究，如有明显差异建议有目的地针对这5种成分建立测定标准，从而有效规范黄芪药材及成药的产品质量。