浙贝母为道地药材“浙八味”之一，具有润肺止咳的功效，用药历史悠久。贝母品种较多，除了浙贝母外，贝母主要品种还包括川贝母、湖北贝母、平贝母和伊贝母，另外流通领域还存在较多贝母伪品。不同品种的贝母药效差异显著，而且价格相差较大，需要建立一种准确、高效的鉴定方法^[1,2]。目前，较多学者利用RAPD技术对浙贝母及其他药材进行分子鉴定，但是由于RAPD实验应用的是随机引物，导致实验结果重复性差，无法推广应用^{[3,4,5,6,7,8,9]}。

本实验室在贝母RAPD实验^[10]的基础上筛选到一条浙贝母分子标记，命名为ZB1基因。ZB1基因作为浙贝母分子标记，只存在于浙贝母中，在其他品种中不存在，具有很高的特异性。本实验研究ZB1基因的克隆和测序，以及利用测序结果设计的特异性引物，实现浙贝母特异性PCR鉴定。这种方法由于使用了特异性引物，具有准确、高效的优点，兼具灵敏度和适用性，可以制备成试剂盒推广应用，具有极佳的应用前景。

贝母品种包括浙贝母Fritillaria thunbergii Miq.、川贝母F. cirrhosa D. Don、湖北贝母F. hupehensis Hsiao et K．C．Hsia、平贝母F. ussuriensis Maxim和伊贝母F. pallidiflora Schrenk，分别采自于浙江、四川、湖北、吉林和伊犁贝母主产地。其中浙贝母来自鄞州、磐安和象山3个不同产地。样品经浙江工业大学华云芬副教授鉴定为正品。

快速植物基因组提取试剂盒、UNIQ-10柱式DNA回收试剂盒、EZ-10 Spin Column Plasmid DNA Minipreps Kit及PCR相关试剂购自生工^®生物工程（上海）有限公司。RAPD引物P1和特异性引物P2/P3由生工^®生物工程（上海）有限公司合成。pMD^®18-T Vector载体试剂盒由宝生物工程（大连）有限公司生产。E. coli DH_5α为实验室保存菌种。琼脂糖、溴化乙锭、X-gal、IPTG、Amp、LB液体培养基、琼脂粉购自生工^®生物工程（上海）有限公司。实验使用的PCR扩增仪MyCycle^TM Thermal Cycler，电泳仪Power Pac^TM Basic，凝胶成像系统Molecular Imager^® Gel Doc^TM XR＋Imaging System，均为Bio-Rad公司产品。

用快速植物基因组提取试剂盒提取贝母基因组DNA。以贝母基因组DNA为模板，进行RAPD扩增，RAPD引物P1的序列为5’-CGACGAAGAA-3’。RAPD扩增体系为：2 μL 10×PCR 缓冲液，1.2 μL MgCl₂（25 mmol/L），0.5 μL dNTPs（10 mmol/L），0.3 μL Taq DNA polymerase，0.5 μL RAPD引物P1（20 μmol/L），1.2 μL贝母基因组DNA模板，补加ddH₂O至总体积为20 μL。RAPD扩增条件：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，42 ℃复性30 s，72 ℃延伸2 min，30个循环，最后72 ℃延伸5 min。RAPD扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶中进行电泳，胶板经溴化乙锭染色后在凝胶成像系统中进行观察，并照相保存。

分析RAPD扩增结果，将浙贝母分子标记用刀片小心切下，用UNIQ-10柱式DNA回收试剂盒回收纯化。将纯化产物与pMD^®18-T Vector载体进行连接，导入大肠杆菌E. coli DH_5α感受态细胞中进行增殖。用灭菌牙签随机挑取数个在含有X-gal、IPTG、Amp的LB琼脂平板培养基上长出的白色单菌落，分别接种于含AMP 0.1 mg/mL的50 mL LB液体培养基中，37 ℃、300 r/min振荡培养10～12 h。用EZ-10 Spin Column Plasmid DNA Minipreps Kit从菌体培养液中提取质粒。经过凝胶电泳鉴定后的重组质粒由南京金斯瑞生物科技有限公司用M13-47（5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’）通用引物进行序列测定。

根据测序结果，设计并合成一对特异性引物P2/P3，以贝母基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR 扩增体系：2 μL 10×PCR 缓冲液，1.2 μL MgCl₂（25 mmol/L），0.5 μL dNTPs（10 mmol/L），0.3 μL Taq DNA polymerase，0.5 μL上游引物P2（20 mmol/L），0.5 μL下游引物P3（20 μmol/L），1.2 μL贝母基因组DNA模板（50 ng/μL），补加ddH₂O至反应液总体积20 μL。PCR扩增条件：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃复性30 s，72 ℃延伸2 min，30个循环，最后72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶中进行电泳，胶板经溴化乙锭染色后在凝胶成像系统中进行观察，并照相保存。为了检测浙贝母特异性PCR鉴定方法的灵敏度和适用范围，将贝母基因组DNA模板分别进行梯度稀释和等量混合后按照上述方法进行PCR。

RAPD 扩增图谱如图 1所示，该图谱条带清晰，呈多态性分布，在750 bp处出现了只有浙贝母有，而其他贝母均无的条带，表明其所含的基因片段为浙贝母品种所特有，可以作为浙贝母分子标记，命名为ZB1基因。

图 1

Fig. 1

M-Marker 1-平贝母 2-湖北贝母 3-川贝母 4-浙贝母 M-Marker 1-F. cirrhosa 2-F. hupehensis 3-F. cirrhosa 4-F. thunbergii图 1 RAPD 扩增图谱 Fig. 1 RAPD amplification

用刀片将750 bp处的条带小心切下后用胶回收试剂盒进行回收，电泳检测结果见图 2。回收片段大小约为750 bp，条带清晰完整，没有降解弥散现象，表明回收质量佳。将回收的ZB1基因与T载体相连形成重组质粒后转化入大肠杆菌进行克隆。挑选克隆子，提取重组质粒进行测序。测序结果（图 3）显示浙贝母分子标记的序列总长度为745 bp，5’端和3’端出现了跟RAPD引物P1序列一致的回文序列，表明此序列确为ZB1基因序列。

图 2

Fig. 2

M-Marker 1-浙贝母分子标记ZB1基因 M-Marker 1-Molecular marker ZB1 from F. thunbergii图 2 浙贝母分子标记ZB1基因电泳图 Fig. 2 Electrophoresis results of ZB1 gene from F. thunbergii

图 3

Fig. 3

图 3 浙贝母分子标记ZB1基因的测序结果 Fig. 3 Sequence of ZB1 gene from F. thunbergii

根据测序结果设计并合成一对特异性引物P2/P3。引物序列为P2：5’-ACAGTACTGGGGGA-GAAGTC-3’，P3：5’-CAAATGGAGGGTATGTGTCG-3’，其分别对应于ZB1基因上的14～33位点和713～732位点。以贝母基因组DNA为模板，特异性引物P2/P3为引物进行特异性PCR扩增，实验结果见图 4。来自3个不同产地的浙贝母基因组DNA均在约750 bp处扩增出单一明亮的条带，其他贝母品种在此位点上均无条带出现。实验重复5次，实验结果均保持稳定，证明应用浙贝母特异性PCR鉴定方法，可以鉴定浙贝母，并且重复性好，明显改善了RAPD反应重复性差的缺点。

图 4

Fig. 4

M-Marker 1-鄞州产浙贝母 2-磐安产浙贝母 3-象山产浙贝母 4-川贝母 5-湖北贝母 6-平贝母 7-伊贝母 M-Marker 1-F. thunbergii from Yinzhou 2-F. thunbergii from Panan 3-F. thunbergii from Xiangshan 4-F. cirrhosa 5-F. hupehensis 6-F. ussuriensis 7-F. pallidiflora图 4 浙贝母特异性PCR扩增图谱 Fig. 4 Specific PCR amplification of F. thunbergii

浙贝母基因组DNA模板的浓度被梯度稀释后进行PCR。PCR结果见图 5，当模板浓度稀释1 000倍后，即用量为0.06 ng时，在约750 bp处依然出现浙贝母的特异性条带，经过多次重复验证，结果保持稳定，证明浙贝母特异性PCR鉴定方法的灵敏度很高，含量极微弱的浙贝母也能够被鉴定出来。将贝母基因组DNA等量混合后进行PCR。PCR结果见图 6，泳道2中为川贝母、湖北贝母、平贝母和伊贝母基因组DNA的等量混合物，没有加入浙贝母基因组DNA，结果显示无扩增条带出现。泳道1中加入的为浙贝母、川贝母、湖北贝母、平贝母和伊贝母基因组DNA的等量混合物，结果显示，750 bp处出现了明亮的条带，浙贝母在5种贝母的混合材料中被很好地鉴定了出来。经过重复验证，结果保持稳定，表明浙贝母特异性PCR鉴定方法不仅可以检测单个浙贝母样品，还可以在混合物中检测出浙贝母，适用范围较广。

图 5

Fig. 5

M-Marker 1-0.1%浙贝母基因组DNA 2-1%浙贝母基DNA 3-10%浙贝母基因组DNA M-Marker 1-0.1% DNA of F. thunbergii 2-1% DNA of F. thunbergii 3-10% DNA of F. thunbergii 图 5 浙贝母特异性PCR鉴定方法对不同浓度样品的鉴定图谱 Fig. 5 Specific PCR amplification of F. thunbergii with different concentration

图 6

Fig. 6

M-Marker 1-浙贝母、川贝母、湖北贝母、平贝母和伊贝母混合基因组DNA 2-川贝母、湖北贝母、平贝母和伊贝母混合基因组DNA M-Marker 1-mixed DNA samples of F. thunbergii,F. cirrhosa,F. hupehensis,F. ussuriensis,and F. pallidiflora 2-mixed DNA sample of F. cirrhosa,F. hupehensis,F. ussuriensis,and F. pallidiflora图 6 浙贝母特异性PCR鉴定方法对混合样品的鉴定图谱 Fig. 6 Specific PCR amplification of mixed samples

利用RAPD引物P1进行RAPD扩增后得到的浙贝母分子标记ZB1基因是本实验室在大量工作（近千条RAPD引物）基础上筛选出来的。该分子标记在RAPD多态性分布良好的情况下，显示出特异性条带清晰、明亮，是一条十分理想的分子标记。ZB1基因进行测序后，对其序列编码的蛋白质信息进行了分析，发现该片段为非编码区。目前GenBank中尚未存储浙贝母基因序列，ZB1基因序列是首个被测定的浙贝母基因组DNA序列。在建立浙贝母PCR鉴定方法时，对退火温度进行了研究，当退火温度低于60 ℃时，图谱中会出现一些非特异性扩增条带，所以浙贝母特异性PCR鉴定方法中的关键条件为退火温度。本实验建立的浙贝母特异性PCR鉴定方法可以直接对单一样品进行鉴定，不需要通过多种样品间的相互比较图谱来做出鉴定，这是该法与RAPD的最大不同之处，因此该法具有操作简单、准确、应用范围广等优点。浙贝母特异性PCR鉴定方法使用的是特异性引物，与RAPD相比，结果重复性好、灵敏度高，适合开发成检测试剂盒，具有很好的应用前景。

在检验特异性PCR鉴定方法时使用了5种贝母主要品种，浙贝母选用了3个产地。今后打算将研究内容扩展到其他贝母药用品种、贝母伪品以及百合科非中药植物，以它们的基因组DNA为模板来进一步验证该方法的准确性。还将在ZB1基因内部设计一条套嵌引物，与特异性引物P2/P3联合使用，利用套嵌引物进行浙贝母PCR鉴定，其准确性将会进一步得到提高。