葛根和粉葛分别为豆科植物野葛Pueraria lobata (Willd.) Ohwi和甘葛藤Pueraria thomsonii Benth. 的干燥根，在中医用药史上二者均作为葛根Pueraria Radix药材使用，具有解肌退热、透发麻疹、生津止渴、升阳止泻的作用^[1]。葛根和粉葛作为常用中药收载于《中国药典》2015年版一部^[2]，定量指标仅葛根素一项，不能完全反映葛根药材的整体质量。现代研究显示，葛根素、大豆苷、大豆苷元是葛根药材中的主要活性成分^[3]；另外葛根素芹菜糖苷、葛根素-6″-O-木糖苷在葛根中的量很高，甚至高于大豆苷和大豆苷元^[4-5]。因此，葛根素芹菜糖苷、葛根素-6″-O-木糖苷、大豆苷元、大豆苷应同时作为检测指标。虽然有文献报道^[3]采用HPLC结合外标法同时测定葛根药材中多种异黄酮类成分的量，但由于缺乏其中的对照品及分析成本高等原因，外标法限制了葛根药材的多组分分析和质量控制的实际应用。

一测多评法（quantitative analysis of multi-compounds by single-marker）是利用中药有效成分之间内在的函数和比例关系，通过测定一个成分（对照品易于得到或供应）而实现多个成分（对照品难以得到或供应）的同步测定，是适合中药特点的多指标质量评价新模式，已广泛地用于中药的质量控制^[6-9]。相比外标法，一测多评法只需测定一个有代表性的成分（易得、廉价、有效），简化了数据处理，降低了成本。虽然有研究尝试^[10]采用一测多评法同时测定粉葛中葛根素、大豆苷、大豆苷元等成分的量，但并未同时测定在葛根中量很高且价格相对较贵的葛根素芹菜糖苷、葛根素-6″-O-木糖苷的量，也并未探讨进样体积、体积流量、柱温等对耐用性及系统适用性的影响。

本实验采用HPLC结合外标法同时测定了葛根药材中大豆苷元、大豆苷、葛根素、葛根素芹菜糖苷、葛根素-6″-O-木糖苷的量，并采用一测多评法，根据以上5种异黄酮类成分内在的函数和比例关系，以葛根素为内标成分，得出大豆苷元、大豆苷、葛根素芹菜糖苷、葛根素-6″-O-木糖苷与葛根素之间的相对校正因子^[11]，计算出这4种异黄酮类成分的量，为葛根药材多指标定量测定提供全新的分析模式。

1 仪器与试药 1.1 仪器

岛津LC-30AD高效液相色谱仪（日本岛津公司）；AB104-N万分之一天平（梅特勒-托利多）；AUW2200十万分之一天平（SHIMADZU岛津）；KQ3200超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；Mili-Q超纯水仪（美国Milipore公司）。

1.2 试药

葛根素对照品（批号3681-99-0，质量分数＞98%）、葛根素芹菜糖苷对照品（批号103654-50-8，质量分数＞98%）、葛根素-6″-O-木糖苷对照品（批号114240-18-5，质量分数＞98%）、大豆苷对照品（批号552-66-9，质量分数＞98%）、大豆苷元对照品（批号486-66-8，质量分数＞98%）均购自上海源叶生物科技有限公司。10批葛根药材均由昆明生物公司采集，经昆明植物标本馆刘恩德博士鉴定为豆科葛属植物野葛Pueraria lobata (Willd.) Ohwi或甘葛藤（粉葛）Pueraria thomsonii Benth. 的干燥根。甲醇（色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司）；Milipore 超纯水；99%甲酸（分析纯，北京百威灵科技有限公司）。

2 方法与结果 2.1 方法学考察 2.1.1 色谱条件

Waters色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇（A）-0.5%甲酸溶液（B），梯度洗脱0～20 min，20%～30% A；20～25 min，30%～40% A；25～35 min，40%～70% A；体积流量1.0 mL/min，进样体积5 μL，检测波长254 nm，柱温为25 ℃。

2.1.2 对照品溶液的制备

精密称取大豆苷元、大豆苷、葛根素、葛根素芹菜糖苷和葛根素-6″-O-木糖苷对照品适量，加甲醇溶解和稀释，配制成含葛根素20 μg/mL、葛根素-6″-O-木糖苷4 μg/mL、葛根素芹菜糖苷4 μg/mL、大豆苷4 μg/mL、大豆苷元1 μg/mL的混合对照品溶液，摇匀，置棕色瓶内，并于4 ℃冰箱中避光保存，备用。

2.1.3 供试品溶液的制备^[12]

取药材粉末（过40目筛）0.1 g，精密称定，置于50 mL具塞锥形瓶，精密加入30%甲醇50 mL，称定质量，超声处理20 min，放冷，30%甲醇补足减失质量，摇匀，经0.45 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 系统适应性及专属性试验

精密量取混合对照品溶液、供试品溶液及空白溶液各5 μL，在上述色谱条件下进样分析。结果显示，供试品溶液色谱中呈现与对照品保留时间相同的色谱峰；葛根素、葛根素-6″-O-木糖苷、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、大豆苷元与其相邻色谱峰的分离度均大于1.5，理论塔板数均大于3 000，阴性对照在相应位置处未见色谱峰，方法专属性良好。混合对照品、样品HPLC图见图 1。

2.1.5 标准曲线的绘制

分别精密吸取系列质量浓度的混合对照品溶液5 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积为纵坐标（Y），进样量为横坐标（X）绘制标准曲线，并进行线性回归。实验结果表明，各成分在各自浓度范围内呈良好的线性关系。结果见表 1。

2.1.6 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液5 μL，连续进样6次，计算葛根素、葛根素-6″-O-木糖苷、葛根素芹菜糖苷、大豆苷和大豆苷元的峰面积的RSD分别为1.3%、1.0%、1.5%、1.1%、0.4%。表明仪器精密度良好。

2.1.7 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于制备后0、4、8、12、24、36、48、72 h后进样5 μL，测定葛根素、葛根素-6″-O-木糖苷、葛根素芹菜糖苷、大豆苷和大豆苷元的峰面积积分值RSD分别为0.8%、1.8%、1.5%、1.7%、2.6%。表明供试品溶液在72 h内稳定。

2.1.8 重复性试验

取同一批药材粉末0.1 g，共6份，精密称定，按“2.1.3”项方法制备样品，测定葛根素、葛根素-6″-O-木糖苷、葛根素芹菜糖苷、大豆苷和大豆苷元的平均质量分数分别为37.679 9、11.285 7、6.505 10、8.243 8、0.895 8 mg/g，RSD值分别为0.9%、1.2%、1.1%、1.0%、2.2%。表明本实验重复性良好。

2.1.9 加样回收率试验

精密称取已测定的样品0.1 g，精密称定，平行6份，分别加入一定量的对照品，按照“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，进行回收率测定。结果表明，葛根素、葛根素-6″-O-木糖苷、葛根素芹菜糖苷、大豆苷和大豆苷元的平均回收率分别为97.78%、95.84%、96.68%、98.12%、102.23%，RSD值分别为3.1%、3.3%、2.5%、2.4%、4.2%。表明该方法的准确度良好。

2.2 相对校正因子计算^[10]

取混合对照品溶液，进样1、2、5、8、10 μL测定，以葛根素为内标，分别计算葛根素对葛根素- 6″-O-木糖苷、葛根素芹菜糖苷、大豆苷和大豆苷元的相对校正因子，相对校正因子的平均值分别为1.41、0.97、1.03、0.77，RSD值均小于5%。

2.3 相对校正因子的耐用性及系统适用性评价 2.3.1 不同色谱柱和仪器对相对校正因子的影响

分别采用Agilent（250 mm×4.6 mm，5 μm）、SUPELCOSIL（250 mm×4.6 mm，5 μm）、COSMOSIL（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Waters（250 mm×4.6 mm，5 μm）4种不同品牌的色谱柱以及岛津、Agilent和Waters 3种高效液相色谱系统进行测定时，考察仪器色谱行为的变化。实验结果表明，各条件下所测量的RSD＜3.0%，分离效果理想。结果见表 2。

2.3.2 不同体积流量对相对校正因子的影响

实验在同一实验室进行，采用岛津LC 20-A高效液相色谱系统和Waters（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱。分别考察了体积流量为1.10、1.05、1.00、0.95、0.90、0.85、0.80 mL/min时葛根素对其他成分的相对校正因子，结果各成分相对校正因子在不同体积流量下重现性良好（RSD＜3%），结果见表 3。

2.3.3 不同柱温对相对校正因子的影响

实验在同一实验室进行，采用岛津LC 20-A高效液相色谱系统和Waters（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱。分别考察了柱温为20、25、30、35、40、45、50 ℃时葛根素对其他成分的相对校正因子，结果各成分相对校正因子在不同柱温下重现性良好，RSD值分别为0.53%、0.41%、0.51%、0.70%。结果见表 4。

2.4 待测色谱峰的定位

实验分别考察了相对保留时间差和相对保留时间比在不同仪器和色谱柱条件下的稳定性。实验发现不同规格的色谱柱比较时，相对保留时间比和相对保留时间差都明显改变，RSD值较大，因此实验只在不同仪器上比较了同一规格的色谱柱。结果表明相对保留时间比值法RSD值分别为3.57、0.90、0.82、4.20，保留时间差法RSD值分别为1.26、1.05、0.56、1.00，说明二者都适宜进行色谱峰定位。

2.5 样品测定

分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液各5 μL，注入高效液相色谱仪，依法测定10批样品，采用外标法和一测多评法计算葛根中葛根素、葛根素-6″-O-木糖苷、葛根素芹菜糖苷、大豆苷和大豆苷元的量，测定结果见表 5。常规的外标法实测值与一测多评法计算的质量分数值相对误差均不大于3%，说明2种方法测得结果没有显著性差异，一测多评法在葛根药材的多组分分析和质量评价中的应用是可行的。

3 讨论

因葛根素价廉易得、性质稳定，故本实验选择葛根素为内参物质进行一测多评分析。与传统的热水回流提取法相比，超声提取省时、易于操作、提取效果好^[12]。由于超声功率、温度不同，在前人研究基础上^[12]，考察了不同提取时间（15、20、25 min）时的提取效果，发现选择超声提取20 min时提取效果最好，故选择超声提取20 min。对葛根素、葛根素-6″-O-木糖苷、葛根素芹菜糖苷、大豆苷和大豆苷元进行全波长扫描，发现其紫外吸收峰相似，均在254 nm左右有最大吸收，故选择254 nm为检测波长。

在葛根素与葛根素-6″-O-木糖苷、葛根素芹菜糖苷、大豆苷和大豆苷元的相对校正因子的评价中，实验考察了进样体积、色谱柱、液相色谱仪、体积流量、柱温的影响。结果表明，在本实验条件下相对校正因子具有较好的重现性。实验发现对色谱峰峰位进行确定时，相对保留时间差法比相对保留时间比法重现性更好，其RSD值均小于3%。为了验证一测多评法可行性，本实验选取了10批不同来源的样品进行比较，结果表明一测多评法与外标法在葛根药材5种异黄酮类成分的测定中无显著差异。

本实验所建立的一测多评测定葛根药材中异黄酮类成分的量的方法具有较高的重现性、稳定性和可信度，有利于葛根药材的质量控制，也证明了一测多评法测定同类化合物成分是可行的。