中草药  2017, Vol. 48 Issue (4): 648-652
0
  PDF    
引用本文doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2017.04.006
王丹, 赵余庆. 人参茎叶皂苷的Fusarium sacchari转化产物成分研究[J]. 中草药, 2017, 48(4): 648-652.
WANG Dan, ZHAO Yu-qing. Chemical constituents in transformation product of Fusarium sacchari from leaves saponin of Panax ginseng[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2017, 48(4): 648-652 .
人参茎叶皂苷的Fusarium sacchari转化产物成分研究
王丹1, 赵余庆2     
1. 沈阳市第二中医医院, 辽宁 沈阳 110101;
2. 沈阳药科大学, 辽宁 沈阳 110016
收稿日期: 2016-08-01
作者简介: 王丹(1982-),女,主管中药师,从事新药研发、中药制剂研究。Tel:13889319482,E-mail:3516588@qq.com
摘要: 目的 利用甘蔗镰孢Fusarium sacchari对人参茎叶皂苷进行生物转化。 方法 转化产物通过硅胶柱色谱进行分离，经理化常数和光谱分析鉴定化合物的结构。 结果 从人参茎叶皂苷的Fusarium sacchari转化产物中分离鉴定了10个化合物，分别为20（S）-人参二醇（1）、20（S）-原人参二醇（2）、20（R）-原人参二醇（3）、20（S）-人参三醇（4）、20（S）-原人参三醇（5）、20（R）-原人参三醇（6）、20（S）-原人参二醇-20-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（CK）（7）、人参皂苷F1（8）、人参皂苷Rh1（9）和人参皂苷Rg1（10）。 结论 化合物1～10为首次从人参茎叶皂苷的Fusarium sacchari生物转化产物中分离得到，且Fusarium sacchari可转化人参茎叶皂苷生成稀有抗肿瘤皂苷，是一种具有开发价值的稀有活性菌株。
关键词: 甘蔗镰孢     生物转化     人参茎叶皂苷     20(S)-人参二醇     20(S)-原人参二醇     人参皂苷F1    
Chemical constituents in transformation product of Fusarium sacchari from leaves saponin of Panax ginseng
WANG Dan1, ZHAO Yu-qing2     
1. Shenyang Second Hospital of Chinese Medicine, Shenyang 110101, China;
2. Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China
Abstract: Objective To study the chemical constituents of transformed products by Fusarium sacchari from the leaves saponin of Panax ginseng. Methods Transformation products separated by the process of silica gel column, compounds were identified and elucidated by spectral and chemical methods. Results Ten compounds were isolated from transformed products of Fusarium sacchari from the leaves saponin of P. ginseng and identified as 20 (S)-panaxadiol (1), 20 (S)-protopanoxa-diol (2), 20 (R)-protopanoxa-diol (3), 20 (S)-panaxatriol (4), 20 (S)-protopanaxatriol (5), 20 (R)-protopanaxatriol (6), 20 (S)-protopanoxadiol-20-O-β-D-glucopyranose (7), ginsenoside-F1 (8), ginsenoside Rh1(9), and ginsenoside Rg1 (10). Conclusion Compounds 1-10 are the compounds of ginsenosides, isolated from transformed products of F. sacchari from the leaves saponin of P. ginseng for the first time. F. sacchari could transform leaves saponin of P. ginseng to rare antitumor saponin, which is a rare active microbial strain with exploitation value.
Key words: Fusarium sacchari     biotransformation     leaves saponin of Panax ginseng     20(S)-panaxadiol     20(S)-protopanoxa-diol     ginsenoside F1    

人参皂苷是人参属植物的主要有效成分[1]。近代研究发现人参属植物中抗癌活性与低极性、稀有或微量人参皂苷直接相关，并探讨了高效的提取方法[2-4]。国内外学者研究证明可以通过水解、酶解等方式得到抗癌活性更强的次级皂苷或苷元，如Rh2[5]、CK[6]、人参二醇（PD）和人参三醇[7-8]、原人参二醇（PPD）[9]。利用生物转化技术对人参皂苷的结构进行转化，既可以保持原有皂苷母核的结构不变，又可以获得活性更高的次生苷。本课题组从种植人参的土壤中分离、筛选出一种活性菌株，经鉴定为甘蔗镰孢Fusarium sacchari，其对人参茎叶皂苷具有较强的转化作用[10]。本实验将转化后的产物通过硅胶柱色谱进行分离，得到10个单体化合物，通过理化常数测定和光谱数据分析，分别鉴定为20(S)-人参二醇 [20(S)-panaxadiol，1]、20(S)-原人参二醇 [20(S)- protopanoxa-diol，2]、20(R)-原人参二醇 [20(R)-protopanoxa-diol，3]、20(S)-人参三醇 [20(S)-panaxatriol，4]、20(S)-原人参三醇 [20(S)- protopanaxatriol，5]、20(R)-原人参三醇 [20(R)- protopanaxatriol，6]、20(S)-原人参二醇-20-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（CK）[20(S)-protopanoxadiol-20-O-β- D-glucopyranose，7]、人参皂苷F1（ginsenoside F1，8）、人参皂苷Rh1（ginsenoside Rh1，9）和人参皂苷Rg1（ginsenoside Rg1，10），均为达玛烷型稀有抗肿瘤皂苷[11-12]。化合物1～10为首次从人参茎叶总皂苷的Fusarium sacchari生物转化产物中分离得到。

1 材料与方法 1.1 菌株

实验菌株从辽宁省抚顺市新宾县人参栽培基地种植人参的土壤中分离获得，经中国科学院微生物研究所鉴定为甘蔗镰孢Fusarium sacchari。

1.2 药品及试剂

人参茎叶皂苷（质量分数大于80%），由抚顺鑫泰人参保健品有限公司提供；薄层色谱硅胶G和柱色谱色谱硅胶（青岛海洋化工厂）；Pharmadex LH-20（Amersham Pharmacia Biotech公司，中国）；5415-R高速冷冻离心机（Eppendorf公司，德国）；ZP-96旋转摇瓶机（四川省长征制药厂）；SCS-24恒温振荡培养箱（上海离心机械研究所）；其他所用试剂均为分析纯。

1.3 转化产物的制备

250 mL三角瓶中加入100 mL PDB培养基，121 ℃×30 min条件下灭菌后加入10% Fusarium sacchari种子液（Fusarium sacchari接入PDB培养基中，在160 r/min、28～30 ℃气浴振荡器培养1 d），在同样条件下继续培养3 d后再加入5 mL 150 mg/mL无菌人参茎叶皂苷水溶液，同样条件下再继续培养，7 d后取出培养液。培养液用高速冷冻离心机离心，上清液用水饱和的正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取部分，浓缩得转化产物A。菌丝体用正丁醇浸泡24 h，回收正丁醇得到转化产物B，合并A、B两部分转化产物，得到总转化产物10 g。

1.4 转化产物的分离

在产物分离过程中，用薄层色谱法（TLC）进行检测。将样品点于薄层板上在展开剂中展开后，挥干溶剂，喷10% H2SO4-乙醇溶液于105 ℃显色。

人参茎叶皂苷转化产物10 g用硅胶柱色谱法分离，石油醚-丙酮（8∶1→1∶2）梯度洗脱，共得到130个流分，经TLC检查合并得到11个流分Fr. 1～11。Fr. 2、4、6经丙酮反复重结晶分别得到化合物1（210mg）、2（15 mg）、4（80 mg）；Fr. 5经硅胶柱色谱法再次分离，石油醚-丙酮（3∶1），经TLC检查合并得到4个流分Fr.5-1～5-4，其中Fr. 5-3经丙酮反复重结晶，得到化合物3（10 mg）；Fr. 8经制备液相分离，乙腈-水（50∶50）洗脱，分别得到化合物5（96 mg）、6（54 mg）。Fr. 10经硅胶柱色谱法分离，氯仿-甲醇（10∶1→3∶1）梯度洗脱，经TLC检查合并得到8个流分Fr. 10-1～10-8，流分Fr. 10-2、10-7经反复重结晶得到化合物7（120 mg）、10（20 mg）；流分Fr. 10-5经制备液相进行分离，乙腈-水（40∶60）洗脱，得到化合物8（60mg）、9（32mg）。

2 结构鉴定

化合物1：白色针晶（丙酮），mp 257～259℃，Liebermann-Burchard反应呈阳性，Molish反应呈阴性。13C-NMR (75 MHz,C5D5N)给出30个碳信号，无烯碳信号；δ 56.2、18.7分别为C-5、C-6的碳信号，提示母核为人参二醇型皂苷元。δ 77.9 (C-3)、70.1 (C-12) 为连氧碳信号；δ 76.8 (C-20)、72.9 (C-25) 提示为人参二醇型六元含氧环的特征连氧碳信号。根据δ 54.9 (C-17)、19.5 (C-21)、35.7 (C-22)，提示C-20的构型为S型。与文献报道[13]数据基本一致，其余数据见表 1。故鉴定化合物1为20 (S)-人参二醇。

表 1 化合物1～10的13C-NMR数据 Table 1 13C-NMR data of compounds 1—10 for aglycone moietyes

化合物2：白色针晶（醋酸乙酯），mp 197～198℃，醋酐-硫酸反应呈红色。13C-NMR (150 MHz,C5D5N)表明有30个碳，包括8个甲基、9个亚甲基、7个次甲基和6个季碳，并可确定C-3、C-12和C-20的3个连化合物羟基碳信号分别为δ 78.0、71.0和72.9，由此推断该化合物为20 (R)-或20 (S)-原人参二醇。其碳谱数据与文献报道[14]一致，其余数据见表 1。故鉴定化合物2为20 (S)-原人参二醇。

化合物3：无色针晶（丙酮），mp 245～247℃，Liebermann-Burchard反应阳性，Molish反应呈阴性。13C-NMR (150 MHz,C5D5N) 给出30个碳信号，δ 126.0 (C-24)、130.8 (C-25) 为2个烯碳信号；δ 77.9 (C-3)、70.8 (C-12)、72.9 (C-20) 为3个连氧碳信号，提示为原人参二醇型皂苷元。根据C-17、C-21、C-22的化学位移值分别δ 50.6、22.5、43.2，可确定C-20的构型为R型。13C-NMR数据与文献报道[15]基本一致，与已知对照品共薄层，二者Rf值一致，故鉴定化合物2为20(R)-原人参二醇。其余数据见表 1。

化合物4：白色针晶（丙酮），Liebermann- Burchard反应阳性，Molish反应呈阴性。13C-NMR (75 MHz,C5D5N) 给出30个碳信号，无烯碳信号；δ 78.0 (C-3)、67.3 (C-6)、69.8 (C-12) 分别为3个连氧碳信号，提示母核为人参三醇型皂苷元；δ 72.6 (C-20)、76.4 (C-25) 为六元含氧环的特征连氧碳信号；由δ 19.1 (C-21)、35.1 (C-22)、16.1 (C-23)、36.1 (C-24)，可进一步确定为六元含氧环。根据C-17、C-21、C-22的化学位移值分别为δ 54.5、19.1、35.1，提示C-20的构型为S型。与文献报道[16]的数据基本一致，其余数据见表 1。故鉴定化合物4为20(S)-人参三醇。

化合物5：白色针晶（甲醇），mp 261～263℃，Liebermann-Burchard反应呈阳性，Molish反应呈阴性，提示为三萜皂苷元化合物。13C-NMR (150 MHz,C5D5N) 谱中无糖端基碳信号存在，有2个烯碳信号δ 126.3、130.8；δ 78.4 (C-3)、67.7 (C-6)、1.0 (C-12)、73.0 (C-20)，4个连氧碳信号以及C-5位信号δ 61.8，结合其他碳信号，推测其为原人参三醇；根据C-17、C-21和C-22位的化学位移值δ 54.8、27.1、35.9推测C-20为S构型。与文献报道[17]的数据基本一致，其余数据见表 1。故鉴定化合物5为20(S)-原人参三醇。

化合物6：白色针晶（甲醇），mp 261～263℃，Liebermann-Burchard反应呈阳性，Molish反应呈阴性，提示为三萜皂苷元化合物。13C-NMR (150 MHz,C5D5N) 谱中无糖端基碳信号存在，有2个烯碳信号δ 125.9、130.7；4个连氧碳信号δ 78.2 (C-3)、67.6 (C-6)、70.8 (C-12)、72.9 (C-20)，以及C-5位信号δ 61.6，结合其他碳信号，推测其为原人参三醇；根据C-17、C-21和C-22位的化学位移值δ 50.5、22.4、43.1推测C-20为R构型。化合物6的13C-NMR谱与20(R)-原人参三醇的碳谱数据[18]比较，二者基本一致，与已知对照品共薄层，Rf值对照，二者基本一致，故鉴定该化合物6为20 (R)-原人参三醇。其余数据见表 1。

化合物7：白色粉末状结晶（乙醇-水），mp177～178 ℃，易溶于甲醇、乙醇、正丁醇、吡啶等，难溶于水。醋酐-硫酸反应呈红色。13C-NMR (75 MHz,C5D5N) 谱中在δ 98.3处观察到葡萄糖的C-1信号，并在δ 79.4～62.9处见到与甲基-β-D-葡萄吡喃糖一致的5个碳信号。13C-NMR中除了葡萄糖信号外，其余各峰与20 (S)-原人参二醇一致。C-20位显著向低场位移至δ 83.3，说明葡萄糖与C-20相接。与文献报道[19]的人参皂苷C-K数据基本相同。其余数据见表 1、2。因此，化合物7被鉴定为20 (S)-原人参二醇-20-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，即人参皂苷CK。

化合物8：白色粉末，mp 170～171℃，难溶于甲醇、易溶于吡啶；Liebermann-Burchard、Molish反应均呈阳性；13C-NMR (150 MHz,C5D5N) 谱中给出36个碳信号，包括1组葡萄糖信号98.3 (C-1′),75.1 (C-2′),79.3 (C-3′),71.6 (C-4′),78.5 (C-5′),62.9 (C-6′)，1个双键信号126.0 (C-24),131.0 (C-25)，4个连氧碳信号78.3 (C-3),67.8 (C-6),70.2 (C-12),83.3(C-20)。与20 (S)-原人参三醇的波谱数据[17]比较，C-20的化学位移向低场移动，说明糖连接在C-20位。以上数据与文献报道[20]一致，其余数据见表 1、2。故鉴定化合物8为人参皂苷F1。

化合物9：白色无定形粉末（甲醇）；mp 190～190℃；13C-NMR谱中共出36个碳信号，δC130.7与126.3为1组双键碳信号，δC 106.1,75.4,80.2,72.0,79.7和63.1为1组葡萄糖基的碳信号；13C-NMR数据见表 1、2。参照文献报道[21]，鉴定化合物9为20(S)-人参皂苷Rh1。

化合物10：白色粉末（乙醇），mp 194～196℃，Liebermann-Burchard反应、Molish反应均呈阳性，提示为三萜皂苷类化合物。5%硫酸全水解，检出葡萄糖。1H-NMR (300 MHz,C5D5N) δ: 0.79～1.96 (各3H,s,18,19,21,26,27,28,29,30-CH3),5.22 (1H,brs,H-24),5.16 (1H,d,J = 7.5 Hz,6-glc-H-1′)，2个端基质子信号5.05 (1H,d,J =7.5 Hz,20-glc-H-1′)，根据偶合常数结合化学位移说明分子中2个葡萄糖构型均为β-构型。13C-NMR (75 MHz,C5D5N)给出42个碳信号，数据见表 1、2。参考文献报道[22]，鉴定化合物10为20(S)-原人参三醇-6-O-β-D-吡喃葡萄糖基-20-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，即人参皂苷Rg1。

表 2 化合物7～10糖苷键的13C-NMR数据 Table 2 13C-NMR data of sugar moietyes in compounds 7—10

3 讨论

文献报道[14, 23]人参皂苷PPD和CK都具有显著的抗肿瘤作用，均为天然存在极少的达玛烷型次生皂苷。实验首次利用从种植人参的土壤中分离出的稀有菌种Fusarium sacchari对人参茎叶皂苷进行生物转化，得到了抗肿瘤活性较强的达玛烷型次生皂苷化合物，为人参茎叶皂苷的综合利用和抗肿瘤新药的研究提供依据，而且Fusarium sacchari是一种极具开发价值的稀有活性菌株。

参考文献
[1] 王嘉仡, 赵余庆, 杨松松. 近十年来西洋参地上部分研究进展[J]. 沈阳医药, 1992, 1(3):18–20.
[2] 杨凌, 何克江. 具有抗肿瘤活性的低极性人参皂苷组合物[J]. 科技开发动态, 2005, 1(5):43.
[3] 周武喜, 杨宁, 赵余庆. 人参皂苷类化合物水溶性提升方法的研究进展[J]. 药物评价研究, 2016, 39(2):322–327.
[4] Chen X P, Lin Y P, Hu Y Z, et al. Phytochemistry, metabolism, and metabolomics of ginseng[J]. Chin Herb Med, 2015, 7(2): 98–108. DOI:10.1016/S1674-6384(15)60026-0
[5] 万会达, 李丹, 张珏, 等. β-半乳糖苷酶选择性催化人参皂苷Rg3水解制备Rh2初探[J]. 食品与发酵工业, 2015, 41(8):54–58.
[6] 高娟, 周安东, 原野, 等. 黑曲霉降解人参皂苷Rb1制备稀有皂苷Compound K[J]. 生物技术进展, 2016, 6(2):89–104.
[7] 马丽媛, 杨秀伟. 人参茎叶总皂苷酸水解产物化学成分研究[J]. 中草药, 2015, 46(17):2522–2533.
[8] 马丽媛, 杨秀伟. 人参茎叶总皂苷碱水解产物中的新人参皂苷20(R)-人参皂苷Rh19[J]. 中草药, 2016, 47(1):6–14.
[9] 李东霄, 常景玲, 张志宏. 微生物转化人参皂苷Rc和Rd的研究[J]. 江苏农业科学, 2010, 38(4):22–25.
[10] Han Y, Sun B S, Zhao Y Q, et al. Transformation of bioactive compounds by Fusarium sacchari fungus isolated from the soil-cultivated ginseng[J]. J Agric Food Chem, 2007, 55(1): 9373–9379.
[11] 张龙江, 周二付. 人参皂苷Rg1对结肠癌肿瘤体外和体内的增殖抑制作用[J]. 世界华人消化杂志, 2014, 22(30):4599–4603.
[12] 刘珊, 蒋永新, 王红, 等. 人参皂苷CK与顺铂联用对人肺腺癌A549细胞株的抑制作用及其机制探讨[J]. 山东医药, 2015, 55(9):24–26.
[13] 杨延武, 何炳林. 二维核磁共振波谱归属人参二醇的NMR谱线[J]. 波谱学杂志, 1994, 11(4):427–429.
[14] 李绪文, 金永日, 桂明玉, 等. 碱催化降解法制备抗癌活性化合物20(S)-原人参二醇[J]. 高等学校化学学报, 2006, 27(3):478–481.
[15] 陈业高, 吕瑜平, 桂世鸿, 等. 三七叶苷制备原人参二醇及其差向异构体[J]. 精细化工, 2003, 20(7):425–426.
[16] 杨延武, 何炳林. 二维核磁共振波谱归属人参二醇的NMR谱线[J]. 波谱学杂志, 1994, 11(4):427–429.
[17] 马双刚, 姜永涛, 宋少江, 等. 西洋参茎叶总皂苷碱降解成分[J]. 药学学报, 2005, 40(10):924–930.
[18] 于明, 赵余庆. 人参果中一对构型异构体的分离与鉴定[J]. 中草药, 2002, 33(5):404–405.
[19] 姜彬慧, 王承志, 韩颖, 等. 三七叶中微量活性皂苷的分离与鉴定[J]. 中药材, 2004, 27(7):489–491.
[20] Ko S R, Choi K J, Suzuki K, et al. Enzymatic preparation of ginsenosides Rg2, Rh1 and F1[J]. Chem Pharm Bull, 2003, 51(4): 404–408. DOI:10.1248/cpb.51.404
[21] 贾继明, 王宗权. 西洋参总皂苷乙酸水解产物的化学成分研究(I)[J]. 中草药, 2009, 40(8):1204–1207.
[22] 金建明, 李有海, 张海伦, 等. 西洋参总皂苷酶水解产物成分研究[J]. 天然产物研究与开发, 2014, 26(10):1552–1556.
[23] 王红, 邓晶, 刘珊, 等. 人参皂苷CK对人肺腺癌A549细胞株的增殖抑制作用及其机制[J]. 现代肿瘤医学, 2016, 24(4):534–537.