2017, Vol. 48
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2017.03.023 |
2. 甘肃步云农牧科技有限公司, 甘肃 陇南 742500
2. Gansu Buyun Farming Technology Co., Ltd., Longnan 742500, China
蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.是中药大黄的基原植物之一，主产于甘肃、青海、西藏和四川等省区，以栽培为主。其根和根茎具有泻下攻积、清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经、利湿退黄的功效，是重要的清热泻火药，目前，国家药品标准中有800多个品种使用了大黄，是在中药组方中应用范围较大、使用频率较高的中药品种之一[1]。大黄主要含有蒽醌及其苷类成分，具有泻下、保肝、利胆、调血脂、抗肿瘤、抗病毒、抗炎等功效[2-4]。掌叶大黄除根及根茎为传统药用部位外，叶片、叶柄等非药用部位也有入药习惯。藏医典《四部医典》和《妙音本草》中记载，我国四川、西藏、甘肃、青海地区的农民，在以大黄的根部作药材的同时，也使用大黄属植物地上部分的叶柄和幼嫩的叶片解渴、除翳等[5-6]。
而在传统产地加工过程中，会产生大量大黄叶柄、叶片、根皮、支根等废弃物，造成大量的药用资源的浪费。因此，对掌叶大黄非药用部位的研究，对节约资源、增加收入和综合利用资源有着重要的意义。本实验对掌叶大黄不同部位（主根、根头、支根、根皮、叶柄、叶片）中蒽醌类、可溶性多糖类、总纤维素和无机元素成分进行分析评价，以期为掌叶大黄新资源的开发利用提供参考。
1 仪器与材料 1.1 仪器Waters-2695型液相色谱仪（四元泵、在线脱气及自动进样系统、2996型二极管阵列检测器）；UV-2000紫外-可见分光光度计（北京莱伯泰科仪器有限公司）；Sartorius BT125D电子分析天平（德国塞利多斯公司）；EPED超纯水系统（南京易普达易科技发展有限公司）；KQ-250E型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；FIWE 3/6纤维素测定仪（北京盈盛恒泰科技有限公司）；Anke GL-16GⅡ型离心机（上海安亭科学仪器厂），马福炉（上海洪纪仪器设备公司）；Milestone Ethos T微波消解系统（意大利Milestone公司）；Optima 2100DV型电感耦合等离子发射光谱仪（美国Perkin Elmer公司）。
1.2 试剂芦荟大黄素对照品（批号LDHS20140914）、大黄酸对照品（批号DHSA20141023）、大黄素对照品（批号DHS20140815）、大黄酚对照品（批号DHF20140721）、大黄素甲醚对照品（批号DHJM20140926），购自南京春秋生物制品公司，质量分数均大于98%。葡萄糖对照品（批号SZBD1680V）购自Sigma公司，葡萄糖醛酸对照品（批号648-200001），购自中国食品药品检定研究院。甲醇（色谱纯），购自江苏汉邦科技发展有限公司，其他试剂均为分析纯。
1.3 材料新鲜掌叶大黄全株6批采自甘肃步云农牧科技有限责任公司大黄种植基地（批号DH20140901~DH20140906），经南京中医药大学段金廒教授鉴定为掌叶大黄Rheum palmatum L.栽培品。采收时间为2014年9月。每批次分别分取主根、根头、支根、根皮、叶柄、叶片6个不同部位，40 ℃鼓风干燥后，粉碎成粗粉，置干燥器中备用。
2 方法 2.1 蒽醌类成分分析方法 2.1.1 供试品溶液制备精密称取掌叶大黄主根、根头、支根、根皮、叶柄、叶片粗粉各1 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇40 mL，静置30 min，称定质量，室温超声提取1 h，放冷，称质量，用70%甲醇补充损失质量，摇匀，滤过，取续滤液，用0.22 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。
2.1.2 对照品溶液制备分别精密称取大黄酸、大黄素甲醚、大黄酚、大黄素、芦荟大黄素对照品适量，加甲醇溶解定容，配成质量浓度分别为82.0、85.0、72.0、73.0、106.0 μg/mL的混合对照品溶液。
2.1.3 色谱条件汉邦Phecda C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-0.05%磷酸水（B），梯度洗脱：0~10 min，10%~30% A；10~20 min，30%~50% A；20~30 min，50%~70% A；30~40 min，70%~90% A；40~50 min，90%~100% A。体积流量1 mL/min，检测波长254 nm，柱温40 ℃，进样量10 μL。典型样品色谱图见图 1。
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1-芦荟大黄素2-大黄酸3-大黄素4-大黄酚5-大黄素甲醚 1-aloe emodin 2-rhein 3-emodin 4-chrysophanol 5-physcion 图 1 混合对照品(A)和掌叶大黄主根(B)的HPLC-PDA Fig.1 HPLC-PDA of the mixed reference (A) and taproot (B) |
2.1.4 标准曲线的建立
分别精密吸取“2.1.2”项下制备的对照品溶液1、2、5、8、10、15 μL，注入液相色谱仪中，以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积的积分值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得回归方程（表 1）。最低检测限（LOD）与最低定量限（LOQ）分别在信噪比（S/N）为3和10时测定（表 1）。
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表 1 回归方程及LOD和LOQ结果 Table 1 Regression equations and results of LOD and LOQ |
2.1.5 精密度试验
取混合对照品溶液，按上述色谱条件重复进样6次，测定峰面积的积分值，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积的RSD依次为0.2%、0.3%、0.5%、0.2%和1.2%。
2.1.6 重复性试验精密称取掌叶大黄（DH20140901）主根粗粉6份，按照前述方法制备供试品溶液，依法进样，分别记录芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的峰面积积分值，计算其质量分数RSD依次为0.8%、0.9%、1.2%、1.3%和1.9%。
2.1.7 稳定性试验精密称取掌叶大黄（DH20140901）主根粗粉1份，按照前述方法制备供试品溶液，12 h内每隔2 h进样1次，记录峰面积，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积的RSD依次为0. 8%、0.8%、0.9%、1.0%和1.4%，结果证明供试品溶液在12 h之内稳定。
2.1.8 加样回收率试验精密称取掌叶大黄（DH20140901）主根粗粉6份，分别加入与样品中各成分量等量的对照品，依法制备供试品溶液并进样分析，计算回收率。结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚平均回收率分别为104.3%、98.1%、98.3%、101.5%和103.1%，RSD为2.3%、2. 6%、1.9%、1.6%和2.0%。
2.1.9 样品测定结果掌叶大黄主根、根头、支根、根皮、叶柄、叶片中蒽醌类成分量分析结果见表 2。掌叶大黄主根中含有的芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚依次为3.22~4.33、0.77~1.36、0.27~0.39、2.85~3.70、1.88~2.44 mg/g；根头中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚依次为1.33~2.32、2.46~2.52、0.28~0.34、2.78~3.01、1.82~2.01 mg/g；支根中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚依次为3.21~3.68、1.16~1.46、0.30~0.42、4.02~4.81、2.48~3.02 mg/g；根皮中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚依次为3.22~3.76、1.02~1.21、0.31~0.67、4.05~4.72、3.61~4.46 mg/g；叶片中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素量依次为0.56~1.07、0.45~0.69、1.41~1.91 mg/g。叶柄中检测出大黄素，但远低于定量限。
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表 2 掌叶大黄不同部位中的蒽醌类成分量 Table 2 Chemical composition of anthraquinones compounds in different parts of R. palmatum |
2.2 可溶性多糖类成分分析方法 2.2.1 供试品溶液的制备
精密称定掌叶大黄主根、叶柄、叶片样品粗粉各1 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，加入50 mL的80%无水乙醇，室温静置1 h后超声提取30 min，在75 ℃水浴2 h后，趁热抽滤，洗涤残渣，烘干，加入40 mL蒸馏水，称恒定质量，100 ℃沸水浴1 h，取出放冷，加蒸馏水补足失质量，摇匀，离心，取上清液，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。用于中性和酸性多糖的测定。
2.2.2 对照品溶液的制备精密称取经105 ℃干燥至恒定质量的无水葡萄糖对照品9.91 mg，置100 mL量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即得99.1 μg/mL的葡萄糖对照品储备液。
精密称取经105 ℃干燥至恒定质量的葡萄糖醛酸对照品9.67 mg，置100 mL量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即得96.7 μg/mL的葡萄糖醛酸对照品储备液。
2.2.3 标准曲线的绘制参考文献方法[7]，分别绘制葡萄糖和葡萄糖醛酸标准曲线，以吸光度为纵坐标（Y），以对照品溶液浓度为横坐标（X）进行线性回归。葡萄糖对照品回归方程为Y=2.96×10-3 X+3.14×10-3，r2=0.995 3，线性范围为12.6~126 μg/mL；葡萄糖醛酸对照品回归方程为Y=7.94×10-3 X-0.019 2，r2=0.993 4，线性范围为11.2~112.0 μg/mL。
2.2.4 可溶性多糖类成分分析结果掌叶大黄主根、叶柄、叶片中可溶性多糖类成分分析结果见表 3。主根中含可溶性多糖量范围9.76%~10.42%，叶柄中量范围5.76%~7.63%，叶片中质量分数3.50%~5.72%。
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表 3 掌叶大黄不同部位中的可溶性多糖类化学成分量 Table 3 Chemical constituents of soluble polysaccharide in different parts of R. palmatum |
2.3 总纤维素类成分分析方法 2.3.1 供试品的制备
精密称取干燥至恒定质量的掌叶大黄叶柄、叶片粗粉各2 g，用乙醚将试样在冷却器中脱脂，脱脂后挥去乙醚，干燥，即得供试品。
2.3.2 试剂配制1.25%的硫酸-水溶液，1.25%的氢氧化钾-水溶液，正辛醇作为消泡剂，无水丙酮作为清洗剂。
2.3.3 样品测定采用weende法测定，根据公式计算总粗纤维量。
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其中W1是粗纤维含灰分的质量，W2是灰分的质量，W是样品质量
2.3.4 总纤维素量分析结果掌叶大黄叶柄、叶片中总纤维素量分析结果见表 4。叶柄、叶片中总纤维素平均量分别为15.54%和10.20%。
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表 4 掌叶大黄叶柄、叶片中的总纤维素量 Table 4 Total cellulose contents in petioles and leaves of R. palmatum |
2.4 无机元素测定方法 2.4.1 供试品的制备
取掌叶大黄（DH20140901）主根、叶柄和叶片3个部位干燥粉末样品各0.5 g，采用高压消解法消解样品：样品置于聚四氟乙烯消解罐中加硝酸5 mL过夜，加3 mL双氧水，拧紧密封盖，置于恒温烘箱120 ℃加热3~4 h，直至消解液澄清透明或略带黄色，冷却后定容至50 mL，滤过待测。其中测K、Mg和Ca元素时均稀释50倍后测定。
2.4.2 测定方法参照文献方法[8]，使用ICP-AES测定样品中Cu、Zn、Ni、Cd、Na、Fe、Mn、K、Mg、Ca、B、Al、Ti、Cr、Co、As、Se、Sr、Ba、Pb、Bi、Hg 22种元素。将硝化液进样，每份样品平行测定3次，取平均值。
2.5 元素分析通过ICP-AES测定掌叶大黄各部位中22种元素的量，从表 5可以得出，掌叶大黄各部位中含有较丰富的元素，种类较多。掌叶大黄叶片中Ca的量高达88.53 mg/g，K、Mg量也较高，依次为32.42、12.93 mg/g；叶片中Al、Fe量分别为1.22、1.17 mg/g，高于主根（0.91、0.64 mg/g）和叶柄（0.47、0.52 mg/g）。叶柄中Ca、K量略低于叶片，分别为80.60、28.73 mg/g，高于主根（21.08、14.09 mg/g）；Na量为2.66 mg/g，远高于主根（0.26 mg/g）和叶片（0.57 mg/g）。
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表 5 元素种类及其质量分数 Table 5 Element types and mass fraction |
3 讨论
资源的利用价值在于其可利用物质的多用性和多宜性特点[9-10]。实验结果表明，掌叶大黄中各部位中蒽醌类、纤维素和多糖类成分分布差异较大，蒽醌类成分在根中的种类和量总体高于叶柄和叶片，符合传统入药部位的认识。在产地加工过程中，会产生大量的大黄叶柄、叶片，根皮、支根等废弃物，一方面是对药用资源的浪费，另一方面也增加了环境负担。
该类资源性成分在掌叶大黄叶柄、叶片中也有分布，且叶片中大黄素量为根中的5倍。此外，叶片还含有芦荟大黄素和大黄酸，量约为根中的1/5和1/2。大黄素、芦荟大黄素、大黄酸是中药大黄的主要有效单体成分，根据文献报道[11]，大黄素具有抗炎活性、保护肝肾等作用，而芦荟大黄素中蒽醌环和2个酚羟基决定其具有清除氧自由基和抗肿瘤等多种生物活性[12]，大黄酸和大黄素具有广泛而相似的药理活性，如抗肿瘤、抗炎以及调节肾功能[13-14]等作用。掌叶大黄的叶片生物量约占总资源量的1/2，可作为提取大黄素、芦荟大黄素、大黄酸的资源部位开发利用。
本研究中，掌叶大黄叶柄、叶片中还含有一定量的纤维素和可溶性多糖类成分，有报道[15-19]，大黄多糖具有降血糖、抗衰老、抗氧化、抗肿瘤和增强免疫的功能。国外18世纪就有食用大黄叶柄的记载。我国华北地区的波叶大黄、华北大黄属于可食用大黄，叶柄粗壮，撕去外皮可生吃，或作蔬菜食用，或作食品加工的原料。掌叶大黄各部位中含有种类丰富的元素，Ca、K、Mg、Al、Fe在叶片中有较多分布，叶柄中Ca、K、Na量较高，因此在开发掌叶大黄叶柄、叶片保健产品时，应注意限定每日服用量，保证人体的安全。
掌叶大黄产地初加工废弃物和非药用部位资源丰富，目前尚未得到充分利用，本研究结果为该类生物资源的有效利用提供了一定的参考，对提升掌叶大黄利用价值、节约循环使用有限的生物资源具有重要的经济效益和生态效益。
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