2017, Vol. 48
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2017.03.019 |
2. 山东中医药大学第一临床学院, 山东 济南 250011
2. Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250011, China
肥胖性高血压，即肥胖相关性高血压（obesity-related hypertension）是指由肥胖的各种因素导致的高血压。现代研究显示：身体脂肪含量与血压呈正相关，体质量指数（BMI）每增加3 kg/m2，4年内发生高血压的风险增加50%~57%[1]。肥胖的本质是摄食/能耗失衡，脂肪组织分泌的瘦素（leptin）在肥胖性高血压中发挥重要的作用。生理情况下，瘦素具有抑制摄食、增加能量消耗、抑制脂肪合成、促进脂肪分解的作用；肥胖时，血清瘦素水平升高，机体对瘦素的摄食等代谢作用产生了抵抗，而对瘦素引起交感活性增强等作用仍然保留，即选择性瘦素抵抗（leptin resistance），这是瘦素升高血压的重要机制之一[2-3]。因此，消除选择性瘦素抵抗，是治疗肥胖性高血压的重要治疗靶点之一。目前现代医药治疗作用有限，中医药治疗有广泛的开发前景。刺蒺藜Tribul sterrestris L.为蒺藜科蒺藜属植物，其果实为传统中药，具有散风、明目、下气行血、补肾益精之功效[4]，现代药理研究表明刺蒺藜具有降压作用[5-6]。因此，本研究以肾脏为靶器官，JAK2/STAT3为靶点通路，研究刺蒺藜治疗肥胖性高血压的作用及其机制，为肥胖性高血压的中医药治疗及对刺蒺藜这味“古药”的应用，提供新的思路和坚实的实验数据支撑。
1 材料 1.1 药品与试剂刺蒺藜超微粉（由山东中医药大学附属医院中药实验室制备）；替米沙坦（德国勃林格殷格药业有限公司生产，批号H20090416）；SYBR Green I Master PCR试剂盒（10559520），购于美国罗氏公司；PCR扩增试剂盒、反转录试剂盒，购于大连Takara生物工程有限公司；一抗稀释液、过硫酸胺（AP）、蛋白上样缓冲液、蛋白裂解液（RIPA）、ECL化学发光试剂盒（P0018），购于上海碧云天生物技术有限公司；PVDF膜，购于美国Millipore公司；血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）ELISA检测试剂盒（A25364-09）、瘦素（Lep）ELISA检测试剂盒（L36247-09）、β2微球蛋白（β2-MG）检测试剂盒（B52136-09），上海博蕴生物科技有限公司；免疫组化染色试剂盒（SP-0023），购于北京博奥森公司。
1.2 动物与饲料SPF级8周龄雄性Wistar大鼠70只，体质量（180±15）g，济宁鲁抗集团提供，动物合格证scxk（鲁）2013-0001；动物房光照时间12 h，温度在20~24 ℃，湿度60%。
基础饲料配方：玉米30%、小麦31%、豆粕20.8%、麦麸10%、鱼粉6%、酵母粉1%、骨粉1%、盐0.02%、多维素0.02%、鱼肝油0.01%。高脂高营养饲料配方：普通饲料60%、猪油12%、蔗糖5%、奶粉5%、花生粉5%、鸡蛋10%、麻油1%、食盐2%，自购原材料，由济宁鲁抗集团加工制作[7]。
1.3 仪器自动脱水机（TP1020）、石蜡包埋机（EG1150H）、轮旋式切片机（LEICA RM2016），德国LEICA公司；全自动病理组织烘片仪（PHY-Ⅲ），常州中威电子仪器有限公司；电热恒温干燥箱（GZX-DH, 400-S-Ⅱ），上海跃进医疗仪器厂；ST8型低速自动平衡离心机，美国Thermo Scientific公司；5424R型高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；微量移液器，美国Thermo Scientific公司；BFM-YT 6B贝利微粉机，济南贝利粉技术工程有限公司。
2 方法 2.1 动物模型的制备、分组与给药Wistar大鼠适应性喂养1周后，完全随机单因子设计法分为对照组（n=10）和高脂饲料组（n=60）。对照组喂以常规基础饲料，高脂饲料组给予高脂饮食25周，从中选取体质量、血压均超过对照组平均值25%的大鼠作为肥胖性高血压大鼠模型，高脂饲料组大鼠共24只纳入实验。其余淘汰大鼠过量麻醉处死。成模大鼠随机分为3组：模型组、刺蒺藜组和替米沙坦组，每组8只大鼠。自26周开始各组大鼠ig给予相应药物干预12周。干预方法：根据课题组前期预试验[8]，刺蒺藜超微粉的最佳剂量为生药17.2 g/kg，每日给药1次，因本研究重在观察刺蒺藜治疗肥胖性高血压的机制，故本研究仅设置最佳剂量组，以替米沙坦作为阳性对照药物。替米沙坦组大鼠，给予溶解于生理盐水中的替米沙坦。对照组与模型组给予等剂量生理盐水，每日1次。3组成模大鼠，给药期间继续给予高脂饮食；对照组大鼠给予普通饲料。
药物剂量选择参考文献报道[9]，按体质量折算给药等效剂量。大鼠的替米沙坦临床等效剂量为3.4 mg/kg。2种药物均溶于适量的生理盐水。对照组给以相同容积的生理盐水，为每天2 mL/只。
2.2 标本收集与指标测定观察各组大鼠一般状况，监测血压、体质量。实验末，3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）ip麻醉大鼠，下腔静脉取血，分离血清，进行血脂测定（血脂测定委托山东中医药大学附属医院检验科检测），应用酶联免疫法（ELISA）检测大鼠血清中Lep、Ang Ⅱ及β2-MG水平。取左肾组织、脂肪组织，保存于4%多聚甲醛液中，用于常规病理观察，右肾放入-70 ℃冰箱保存进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和Western blotting检测。
2.3 肾组织主动脉病理检查实验末，将肾组织及脂肪组织，于4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，切片厚度4 μm，苏木素-伊红（HE）染色，脱水，透明，中性树胶封片，普通光学显微镜下观察肾脏组织的形态学改变。
2.4 免疫组织化学法观察Lep受体（LepR）的表达左肾石蜡包埋，切片厚度4 μm，常规脱蜡，3%的H2O2室温10 min消除内源性过氧化物酶，5% BSA室温封闭30 min，滴加兔抗大鼠AT1R和一抗（1:200倍稀释），湿盒内4 ℃孵育过夜，PBS洗5 min×5次，滴加羊抗兔IgG二抗，室温孵育60 min，PBS洗5 min×5次，滴加SABC，室温30 min，PBS漂洗，DAB显色，镜下控制显色时间，苏木素复染，脱水透明中性树胶封片。PBS代替一抗作为阴性对照，以棕黄色颗粒沉积者判定为阳性。
2.5 qRT-PCR检测建立20 μL PCR反应体系：2×Master Mix 10.0 μL、水6.0 μL、引物2.0 μL、cDNA 2.0 μL。qRT-PCR反应条件：95 ℃预变性5 s；95 ℃变性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，扩增45个循环；95 ℃变性5 s，65 ℃延伸60 s，97 ℃酶瞬间灭活；40 ℃冷却10 s。数据采用2-ΔΔCt法分析，通过2-ΔΔCt直接计算出模型组与对照组间对应基因的表达差异。引物序列见表 1。
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表 1 引物序列 Table 1 Sequences of primer |
2.6 Western blotting检测
右肾以PIPA裂解液提取组织蛋白。12% SDS-PAGE电泳，样品上样量50 μg，电转印至PVDF膜，5%脱脂奶的PBS-T室温封闭1 h。弃封闭液，不洗，加入适当稀释度的相应一抗（兔抗大鼠AT1、兔抗大鼠TGF-β1，均1:300稀释），以β-actin为内参，4 ℃孵育过夜。次日1×PBS-T洗涤5 min×5次，加入山羊抗兔IgG二抗（1:20 000）室温孵育1 h，1×PBS-T洗涤5 min×5次。ECL显色，Fluor Chem Q下曝光，条带进行半定量分析。
2.7 统计学方法釆用SPSS 19.0软件进行统计分析，计量结果以x±s表示。两组比较采用t检验；多组比较釆用单因素方差分析（One-way ANOVA）以及LSD或S-N-K法，如果方差不齐，则用Games-Howell分析。
3 结果 3.1 刺蒺藜干预后大鼠血压及体质量变化 3.1.1 各组大鼠体质量的变化每2周记录体质量及血压数据，对照组大鼠体质量在达到650~700 g后维持稳定、不再增长。与模型组比较，替米沙坦组及刺蒺藜组大鼠，体质量均有所下降，尤其在用药前2周时下降显著（P < 0.05）；第12周末，与替米沙坦组比较，刺蒺藜组大鼠体质量下降更为显著（P < 0.05）。结果见表 2。
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表 2 各组大鼠体质量变化(x±s) Table 2 Changes of body weight of rats in each group (x±s) |
3.1.2 各组大鼠血压变化
给药干预后各组大鼠血压比较见表 3。与对照组相比，模型组收缩压与舒张压一直维持在较高的水平（P < 0.05）；替米沙坦组0~4周血压轻度下降，4~6周时血压显著下降，6~8周平稳下降，第10周时血压逐渐稳定，从第4周开始，收缩压与舒张压较模型组相比有统计学意义（P < 0.05）；用药后，刺蒺藜组大鼠血压下降幅度较小，呈现持续缓慢降低态势，第6周开始，与模型组大鼠比较，收缩压、舒张压下降有统计学意义（P < 0.05）；刺蒺藜组与替米沙坦组大鼠比较血压下降幅度小，实验结束时，2组血压有差异（P < 0.05）。替米沙坦组与对照组比较，大鼠收缩压、舒张压均无统计学差异（P > 0.05）。
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表 3 各组大鼠收缩压和舒张压变化(x±s) Table 3 Changes of blood pressure of rats in each group (x±s) |
3.2 刺蒺藜干预后血脂水平变化
实验末，模型组大鼠血清TC、TG、LDL等水平明显升高，HDL水平无明显差异；药物干预后，与模型组大鼠比较，刺蒺藜组与替米沙坦组大鼠血清TC、TG、LDL均有不同程度降低（P < 0.05），且刺蒺藜组比替米沙坦组大鼠血脂降低更明显（P < 0.05）。见表 4。
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表 4 各组大鼠血脂变化(x±s) Table 4 Changes of blood pressure of rats in each group (x±s) |
3.3 干预后大鼠血清学指标变化
实验末，与对照组比较，模型组大鼠血清Ang Ⅱ、Lep及β2-MG均升高（P < 0.05）；与模型组比较，刺蒺藜组与替米沙坦组大鼠血清Ang Ⅱ、Lep及β2-MG均降低（P < 0.05）；替米沙坦组大鼠AngⅡ降低更显著（P < 0.05）。见表 5。
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表 5 各组大鼠血清Ang Ⅱ、Lep及β2-MG变化(x±s) Table 5 Changes of Ang Ⅱ, Lep, and β2-MG in serum of rats in each group (x±s) |
3.4 干预后大鼠肾脏及血管形态学变化 3.4.1 大鼠肾脏病理变化
模型组大鼠肾脏部分肾小球高度扩张，肾小球毛细血管扩张，球囊间隙增宽，个别肾小球变性坏死萎缩，部分肾小管扩张，动脉血管内皮增生、玻璃样变和空泡变性，管壁内蛋白分泌（蛋白管型）。与模型组大鼠比较，替米沙坦组与刺蒺藜组大鼠肾脏肾小球变性明显减轻，血管内皮增生减轻。见图 1。
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图 1 各组大鼠肾脏HE染色结果 Fig.1 HE staining results of kidney of rats in each group |
3.4.2 大鼠脂肪病理变化
与对照组相比，模型组大鼠脂肪细胞明显变大，脂肪组织间隙可见有炎性细胞浸润，刺蒺藜组与替米沙坦组大鼠脂肪细胞与模型组比较脂肪细胞变小，且刺蒺藜组大鼠更为显著。见图 2。
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图 2 各组大鼠脂肪HE染色结果 Fig.2 HE staining results of lipid of rats in each group |
3.5 免疫组织化学法测定肾脏AT1、LepR蛋白分布
对照组大鼠肾脏AT1蛋白分布集中在血管周围，与对照组大鼠相比，模型组大鼠AT1蛋白表达显著增加（P < 0.05）；刺蒺藜组与替米沙坦组大鼠肾脏AT1蛋白表达较模型组下降（P < 0.05）。大鼠LepR蛋白分布在肾组织细胞中；与对照组大鼠相比，模型组大鼠LepR蛋白表达增加显著（P < 0.05）；刺蒺藜组与替米沙坦组大鼠肾脏LepR蛋白表达较模型组下降（P < 0.05）。见表 6。
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表 6 各组大鼠肾脏AT1、LepR蛋白定量(x±s) Table 6 AT1 and LepR protein in kidney of rats in each group (x±s) |
3.6 大鼠肾脏AT1、JAK2、STAT3和LepR的mRNA的表达
与对照组比较，模型组大鼠肾脏AT1、JAK2、STAT3、LepR的mRNA表达增加（P < 0.05），与模型组比较，刺蒺藜组AT1、JAK2、STAT3及LepR的mRNA表达减少（P < 0.05）。见表 7。
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表 7 各组大鼠肾脏AT1、LepR、JAK2及STAT3基因表达(x±s) Table 7 Gene expression of AT1, LepR, JAK2, and STAT3 in kidney of rats in each group (x±s) |
3.7 大鼠肾脏JAK2、SATAT3的蛋白表达
与对照组比较，模型组大鼠肾脏JAK2和蛋白表达增加，与模型组比较，刺蒺藜组大鼠肾脏JAK2和蛋白表达降低，见图 3。
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图 3 各组大鼠肾脏JAK2和STAT3蛋白表达 Fig.3 Protein expression of JAK2 and STAT3 in kidney of rats in each group |
4 讨论
瘦素在肥胖性高血压发病机制中起重要作用，瘦素是由肥胖基因编码的蛋白质，主要由白色脂肪细胞分泌和产生[10]，瘦素有调节能量代谢，糖代谢，促进生长发育，参与免疫/炎症反应等多种生物学效应[11]。瘦素合成的多少主要取决于脂肪细胞体积的大小，当脂肪细胞体积减小时，瘦素的合成和分泌亦减少[12]。LepR分布广泛，主要于脑、心、肾脏等组织中表达，瘦素与瘦素受体结合后引发细胞内信号转导机制非常复杂，其中JAK/STAT通路是主要途径，在瘦素调整能量代谢方面不可或缺[13]。
肥胖患者体内的瘦素水平升高，下丘脑中瘦素的代谢效应（降低食欲，减轻体质量）受到抵抗，而其对于心血管、肾脏等外周组织器官的效应得以保留，即选择性瘦素抵抗，这是肥胖引起高血压的重要机制之一[14]。研究显示，瘦素水平与AngⅡ具有显著相关性。邱宁岩等[15]检测了91名高血压患者及67名血压正常者的血清瘦素水平、肾素活性（PRA）及AngⅡ，发现高血压组患者血清瘦素与BMI、PRA、AngⅡ和收缩压呈正相关。说明瘦素可以通过激活RAAS系统升高血压。
因为肥胖性高血压复杂的病理机制及现代药物治疗的单一性，针对本病的治疗现代医学并无“指南”可循。而中医中药可以发挥多靶点多途径的治疗优势，并借鉴前人研究成果，积累了丰富的经验，如：叶伊琳等[16]用肉桂通过下调脂肪组织的Toll样受体表达来治疗肥胖性高血压大鼠。
杨传华教授根据近三十年的的临床、科研经验，针对肥胖性高血压的治疗，提出“痰湿壅盛为外在表现，肝失疏泄为加剧因素，肾虚失调为内在原因”的病机本质[17]，选取刺蒺藜作为治疗本病的要药，临床上取得良好效果。刺蒺藜是一味传统中药，可以平肝补肾，祛风明目。《本草纲目》曰：蒺藜味苦性温，其性宣通，利肝肾。深入挖掘本草学文献，还可以发现刺蒺藜具有轻身减肥、化湿祛痰、活血化瘀等作用。现代药理研究也表明，刺蒺藜具有降压、利尿，抗氧化强身健体等功效。
实验末，与对照组比较，模型组大鼠体态肥胖，血脂水平升高，血压升高，大鼠腹部脂肪细胞增大，血清Lep、AngⅡ水平明显升高（P < 0.05）；肾脏LepR、AT1、JAK2和STAT3的mRNA和蛋白表达明显上调；说明高脂饲料饮食诱导的肥胖模型大鼠存在选择性瘦素抵抗及RAAS过度激活，符合肥胖性高血压的基本病理机制。本研究显示，肥胖性高血压大鼠血清升高的Lep与肾脏升高的LepR结合，通过JAK2/STAT3通路，引起瘦素外周的作用增强。同时说明肥胖性高血压大鼠RAAS系统的过度激活与肾脏局部RAS激活有关。
大鼠血清中β2-MG升高，β2-MG是体内有核细胞产生的一种小分子球蛋白，是反应早期高血压肾功能损伤的良好指标[18]，肾脏病理亦显示肥胖性高血压大鼠出现肾脏损伤。
刺蒺藜干预后，大鼠体质量减轻，血压降低，血脂水平降低，血清中Lep、AngⅡ及β2-MG降低（P < 0.05）；大鼠肾脏的LepR、AT1、JAK2和STAT3的mRNA及蛋白表达降低（P < 0.05），说明刺蒺藜可以减少肾脏LepR的表达，抑制JAK2/STAT3通路反应，降低肾脏对循环瘦素的敏感性，减轻选择性瘦素抵抗，降低血压，保护肾脏。同时，本研究结果为刺蒺藜的这一味“古老”的中药理论研究及临床应用提供了“新的”方法与思路。
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