平卧菊三七Gynura procumbens Lour. 为菊科植物，主要分布于东南亚地区，尤其是马来西亚、印度尼西亚和泰国，在我国主要分布于广东、海南、贵州、云南等地。作为一种重要的药用植物，平卧菊三七具有治疗糖尿病^[1-2]、高血压^[3-5]、癌症^[6]、炎症^[7]、肾病^[8]、脂肪肝^[9]的药理活性。研究表明，平卧菊三七中含有多种有机酸如绿原酸^[9]、原儿茶酸、对香豆酸、咖啡酸等^[10-11]和黄酮类成分如芹菜素、槲皮素、芦丁、杨梅素、山柰酚等^[10-12]以及三萜类成分^[13]，具有显著的抗氧化作用，可作为天然的抗氧化剂^[11]。由于平卧菊三七水提物成分复杂，目前，我国尚未制定平卧菊三七水提取物统一的质量标准。本实验采用HPLC-MS/MS法^[14-16]同时检测了平卧菊三七水提取物中4种有机酸类成分（绿原酸、原儿茶酸、对香豆酸、咖啡酸）和5种黄酮类成分（芹菜素、槲皮素、芦丁、杨梅素、山柰酚），方法选择性好、灵敏度高，可用于平卧菊三七水提物的质量控制。

岛津LC-MS/MS系统，包括LC-20AD二元泵、CTO-20A柱温箱、SIL-20ACHT自动进样器、DGU-20A 3R脱气装置，MS-8040质谱仪，LabSolutions工作站，日本岛津公司；5810R型高速离心机，德国Eppendorf公司；BP211D型电子天平，德国Sartorius公司；WH-2微型漩涡混合仪，上海沪西分析仪器厂；Vortex-5型漩涡震荡器，天津仪器厂；KQ-250E型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

对照品和厚朴酚（批号110730-201614，内标）、绿原酸（批号110753-201415）、槲皮素（批号10081- 9905）、咖啡酸（批号110885-200102）、原儿茶酸（批号110809-201205）均由中国食品药品检定研究院提供，质量分数均≥98%；对照品芹菜素（批号D15122101）、芦丁（批号D16021901）、杨梅素（批号D15120601）、对香豆酸（批号D15101801）、山柰酚（批号D15110802）均由南京狄尔格医药科技有限公司提供，质量分数均≥98%。屈臣氏蒸馏水；色谱纯甲醇，德国Merck公司；色谱纯甲酸，Sigma公司；平卧菊三七水提取物，陕西锦泰生物工程有限公司，批号JT151124、JT160907、JT161115；规格1 kg/袋，相当于原药材10 kg。

色谱柱为Shim-pack ODS C₁₈柱（150 mm×2.0 mm，4.6 μm），配Shim-pack ODS C₁₈保护柱（5.0 mm×2.0 mm，4.6 μm）；柱温35 ℃；流动相为0.1%甲酸水溶液-甲醇，梯度洗脱程序：0～15 min，20%～85%甲醇；15～20 min，80%～20%甲醇；体积流量0.2 mL/min；进样量5 μL。

离子源为电喷雾离子化源（ESI），在负离子模式下采用多反应检测（MRM），每种化合物的子离子依据其母离子的碰撞诱导解离优化得到，用于定量分析的离子对：和厚朴酚m/z 265.0→224.2，芹菜素m/z 269.0→117.2，槲皮素m/z 301.0→151.0，芦丁m/z 609.0→300.0，杨梅素m/z 317.0→151.0，绿原酸m/z 353.0→191.1，原儿茶酸m/z 153.0→109.0，对香豆酸m/z 163.0→119.1，咖啡酸m/z 179.0→135.05，山柰酚m/z 285.0→93.2。其他质谱条件：源喷射电压−3 500 V，温度400 ℃，雾化气体积流量3 L/min，气帘气体积流量15 L/min。

精密称取咖啡酸、原儿茶酸、绿原酸、对香豆酸、芦丁、杨梅素、芹菜素、山柰酚、槲皮素对照品适量，芹菜素用二甲基亚砜制成质量浓度为0.1 mg/mL的对照品储备液，其他均用甲醇制成1 mg/mL的对照品储备液；精密称取和厚朴酚（内标）对照品适量，用甲醇制成质量浓度为1.48 mg/mL的对照品储备液。芹菜素对照品储备液精密取10 μL，芦丁、山柰酚、杨梅素对照品储备液各精密取24 μL，咖啡酸、绿原酸、槲皮素对照品储备液各精密取32 μL，原儿茶酸、对香豆酸对照品储备液各精密取80 μL，置于10 mL量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度芹菜素为0.1 μg/mL，芦丁、山柰酚、杨梅素为2.4 μg/mL，咖啡酸、绿原酸、槲皮素为3.2 μg/mL，原儿茶酸、对香豆酸为8 μg/mL的混合对照品溶液。和厚朴酚对照品储备液精密取10 μL，置于10 mL量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度为1.48 μg/mL的内标溶液。

取平卧菊三七提取物约40 mg，置于10 mL Eppendorf离心管中，加甲醇4 mL，室温超声提取30 min后，4 000 r/min离心10 min，取上清液；沉淀重复提取1次后，合并2次上清液，放至室温，用甲醇定容至10 mL。摇匀后用0.22 μm的微孔滤膜滤过，取续滤液800 μL挥干，400 μL流动相复溶作为供试品溶液。

分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液各5 μL，进样分析，结果见图 1。各化合物所选离子对之间无干扰，方法专属性良好。

图 1 混合对照品溶液 (A) 与平卧菊三七水提取物 (B) 的提取离子流色谱图 (EIC) (A、B均为叠加图) Fig.1 EIC of mixed references solution (A) and G. procumbens aqueous extract (B) (A and B are superimposed figures)

在“2.1”项色谱条件和“2.2”项质谱条件下测定，以对照品进样质量浓度为横坐标（X），对照品色谱峰面积与内标色谱峰面积之比为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得到各物质的线性回归方程。以信噪比（S/N）为10时各对照品进样质量浓度作为定量限（LOQ），结果见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 9 种待测物的线性回归方程及定量限 Table 1 Linear regression equations and LOQs of nine testing constituents 化合物 线性回归方程 线性范围/(ng∙mL−1) r LOQ/(ng∙mL−1) 芹菜素 Y＝0.007 777 X＋0.006 360 3.125～50.000 0.999 7 0.004 8 槲皮素 Y＝0.003 042 X＋0.103 6 100～1 600 0.999 6 0.78 芦丁 Y＝0.000 682 4 X＋0.017 24 75～1 200 0.999 5 0.29 杨梅素 Y＝0.001 423 X－0.036 90 75～1 200 0.999 9 2.34 绿原酸 Y＝0.003 933 X＋0.064 84 100～1 600 0.999 6 1.56 原儿茶酸 Y＝0.001 869 X＋0.261 4 250～4 000 0.999 6 7.81 对香豆酸 Y＝0.006 429 8 X＋1.087 250～4 000 0.999 5 1.95 咖啡酸 Y＝0.006 659 X＋0.347 9 100～1 600 0.999 6 6.25 山柰酚 Y＝0.000 264 2 X＋0.001 615 75～1 200 0.999 8 2.34

表 1 9 种待测物的线性回归方程及定量限 Table 1 Linear regression equations and LOQs of nine testing constituents

按照“2.3”项下方法制备9种对照品低、高质量浓度质控（QC）样本，分别为芹菜素6.25、25.00 ng/mL，槲皮素、绿原酸、咖啡酸200、800 ng/mL，芦丁、杨梅素、山柰酚150、600 ng/mL，原儿茶酸、对香豆酸500、2 000 ng/mL，连续重复进样6次，测定对照品和内标峰面积，代入回归方程求得实测质量浓度，计算其RSD值。

结果低、高质量浓度QC样品的测定精密度（RSD）分别为芹菜素0.93%、1.86%，槲皮素2.36%、1.06%，芦丁2.64%、1.39%，杨梅素2.72%、1.78%，绿原酸2.81%、2.88%，原儿茶酸0.44%、0.35%，对香豆酸2.23%、1.61%，咖啡酸2.70%、0.47%，山柰酚1.83%、1.38%。

精密称取平卧菊三七水提物（批号JT151124）40 mg，按照“2.4”项下方法平行制备供试品溶液6份，分别在室温下放置2、6、12 h后进样测定，记录供试品和内标峰面积，代入回归方程求得实测浓度，计算其RSD值分别为芹菜素2.55%、槲皮素0.52%、芦丁3.06%、杨梅素2.94%、绿原酸2.85%、原儿茶酸1.97%、对香豆酸1.63%、咖啡酸2.59%、山柰酚3.10%。

精密称取平卧菊三七水提物（批号JT151124）6份，每份40 mg，按照“2.4”项下操作制备供试品溶液，测定每份供试品溶液中各指标成分与内标峰面积，代入回归方程求得实测浓度，计算其RSD值分别为芹菜素3.08%、槲皮素0.74%、芦丁3.06%、杨梅素2.55%、绿原酸1.29%、原儿茶酸1.23%、对香豆酸2.06%、咖啡酸2.74%、山柰酚3.24%。

精密称取平卧菊三七水提物（批号JT151124）20 mg，加入9种对照品QC样（质量浓度分别为芹菜素12.5 ng/mL，槲皮素、绿原酸、咖啡酸400 ng/mL，芦丁、杨梅素、山柰酚300 ng/mL，原儿茶酸、对香豆酸1 000 ng/mL）适量，按“2.4”项下方法平行制备6份供试品溶液，测定每份供试品溶液中各指标成分与内标峰面积，代入回归方程求得实测质量浓度，考察分析方法的加样回收率。结果9种分析物的加样回收率分别为芹菜素96.88%（RSD为3.13%）、槲皮素93.71%（RSD为3.03%）、芦丁100.0%（RSD为3.31%）、杨梅素99.90%（RSD为2.3%）、绿原酸101.2%（RSD为1.82%）、原儿茶酸101.3%（RSD为2.38%）、对香豆酸91.03%（RSD为1.69%）、咖啡酸95.85%（RSD为2.84%）、山柰酚98.89%（RSD为2.27%）。

取3批平卧菊三七水提物各40 mg，按“2.4”项下平行制备供试品溶液，每个批号平行制备6份，测定每份供试品溶液中各指标成分与内标峰面积，代入回归方程求得实测质量浓度，并计算各待测组分在平卧菊三七水提物中的质量分数，结果见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 平卧菊三七水提物中9种成分测定结果 (n = 6) Table 2 Quantitative determination of nine constituents in G.procumbens aqueous extract (n = 6) 批号 质量分数/(mg∙kg−1) 芹菜素 槲皮素 芦丁 杨梅素 绿原酸 原儿茶酸 对香豆酸 咖啡酸 山柰酚 JT151124 1.01 26.95 21.99 23.00 39.12 95.69 75.07 18.84 22.78 JT160907 0.52 20.77 10.92 29.25 32.71 70.04 56.64 13.22 11.31 JT161115 0.67 21.65 10.10 26.72 36.70 74.23 58.88 15.83 10.84

表 2 平卧菊三七水提物中9种成分测定结果 (n = 6) Table 2 Quantitative determination of nine constituents in G.procumbens aqueous extract (n = 6)

采用MRM负离子监测9种待测物时灵敏度明显优于正离子模式。不同黄酮类、酚酸类物质间结构较类似，完全色谱分离较难。考察了不同流动相组合（包括乙腈-水、甲醇-水及添加不同电解质如甲酸、乙酸铵）对分离与检测的影响，结果表明，在纯水流动相中各组分峰形差、拖尾严重，在乙腈流动相中杂质分离效果差；在水相中添加甲酸后可明显改善各物质的峰形，抑制拖尾现象。所以最终选择甲醇-0.1%甲酸水溶液作为流动相进行梯度洗脱，9种成分及内标的色谱峰分离好，响应值稳定，且无其他物质干扰。此外，柱温过高（35～40 ℃）会使原儿茶酸的峰形变宽，因此实验设定柱温为35 ℃。

9种待测组分可分为黄酮类和酚酸类2大类，理化性质相差较大。对比研究了纯甲醇、50%甲醇及水3种溶媒提取平卧菊三七水提取物中目标化合物的情况，结果表明，纯甲醇提取效果最好，通过进一步考察提取次数与提取时间对目标化合物得率的影响，最终选用纯甲醇超声提取2次，每次提取30 min。

实验发现，在MRM模式下，绿原酸及咖啡酸对照品各有1个杂峰；而平卧菊三七水提物供试液中绿原酸和对香豆酸各有1个杂峰，咖啡酸和原儿茶酸各有3个杂峰。虽然这些杂峰较小，但也说明平卧菊三七水提物中存在上述测定物质的同分异构体 ^[17-18]。由于杂峰与测定物分离良好，不会影响待测物的定量。此外，为兼顾平卧菊三七水提物供试液中9种待测成分的响应值差距，内标质量浓度的设置使得其响应值居于9种待测物响应值的中间。

目前，平卧菊三七水提取物并没有统一的质量标准。本实验建立的LC-MS/MS法可以快速准确地测定9种待测组分的量，为平卧菊三七水提取物的质量标准的建立提供了参考，也为其药效学和药动学研究打下了基础。