当归Angelicae Radix为常用补血药，来源于伞形科（Umbelliferae）植物当归Angelica sinensis (Oliv.) Diels的干燥根^[1]。随着中医药在世界范围内的广泛传播，当归在中国、日本、韩国的传统医学中均为补血药，但其原植物来源不同。日本当归来源于伞形科植物A.acutiloba Kitagava和A.acutiloba Kitagava var.sugiyamae Hikino的干燥根，而韩国当归则来源于A.gigas Nakai的干燥根。此外，欧洲植物药欧当归Levisticum officinale Koch.的产量高，化学成分与中国当归相近；20世纪50年代曾引种到河北、北京、山东等地，拟解决当时中国当归紧缺的问题。虽然未作为中国当归的药材来源，但在我国部分地区仍有种植，并充当中国当归使用^[2]。欧洲的另一种植物药圆当归A.archangelica L.与中国当归的拉丁学名和英文名相似，易与中国当归混淆^[3]。因此，这5种当归类药材在国内及国际市场上均有不同程度的混淆、混用情况。

当归多糖是当归药材中的主要活性成分之一，具有造血、补血作用，能够拮抗X射线诱导的造血干细胞衰老，刺激白细胞介素-6和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子等造血因子的分泌，显著促进溶血性血虚小鼠和急性失血小鼠的外周血红蛋白水平的恢复^[4-5]。其还具有调节免疫、抗癌、抗氧化、抗辐射等多种活性^[6-8]。为此，本实验从不同国家收集了这5种当归类药材46份样品，通过优化，建立了3, 5-二硝基水杨酸法测定多糖量的方法，并测定了这些样品中多糖的量，以期评价这些当归类药材的质量，为其临床应用提供依据。

UV-1100型紫外可见分光光度计（上海天美科学仪器有限公司）；DKZ型电热恒温振荡水浴槽（成都鑫益仪器有限公司）；SF-TDL-5C型离心机（上海菲恰尔分析仪器有限公司）；SA224S型电子分析天平（d=0.1 mg），BP211D电子分析天平（d=0.01 mg）均为北京赛多利斯科学仪器有限公司生产；优普超纯水制造系统（四川优普超纯科技有限公司）。

对照品D-无水葡萄糖（批号110833-201205）购于中国食品药品检定研究院；3, 5-二硝基水杨酸为国药集团化学试剂有限公司生产；盐酸、无水乙醇、氢氧化钠、酒石酸钾钠、无水亚硫酸钠、苯酚、酚酞均为分析纯，由成都市科龙化工试剂厂生产；超纯水由优普超纯水制造系统制备。

3, 5-二硝基水杨酸显色剂（DNS）的配制：称取182 g酒石酸钾钠于1 000 mL烧杯中，加水500 mL，加热，使溶解。称取3, 5-二硝基水杨酸6.3 g，加入上述酒石酸钾钠热溶液中，再加入2 mol/L的氢氧化钠溶液262 mL，混匀；分别加入苯酚和无水亚硫酸钠各5 g，搅拌溶解。待溶液冷却后，转移至1 000 mL量瓶中；加蒸馏水定容至刻度，混匀；再转移至棕色试剂瓶中保存，放置7 d后使用^[10]。

46份当归类药材样品分别从中国、日本、韩国、德国、奥地利等地收集（表 1），由成都中医药大学药学院吕光华教授鉴定。其中，12份中国当归为Angelica sinensis (Oliv.) Diels的干燥根；12份日本当归（JDG1～12）为A.acutiloba Kitagava的干燥根或其加工品，1份日本当归（JDG13）为A.acutiloba Kitagava var.sugiyamae Hikino的加工品；8份韩国当归样品为A.gigas Nakai的干燥根及其切制片；4份欧当归为Levisticum officinale Koch.的干燥根的切制品；9份圆当归为A.archangelica L.的干燥根的切制品。

表 1(Table 1)

表 1 5种当归类药材样品的来源及多糖量 Table 1 Sources and contents of polysaccharides in five species of Angelicae Radix 样品编号 名称 药材性状 来源 CDG1 中国当归 全根 甘肃岷县 CDG2 中国当归 全根 甘肃岷县 CDG3 中国当归 全根 甘肃漳县 CDG4 中国当归 全根 甘肃漳县 CDG5 中国当归 全根 甘肃漳县 CDG6 中国当归 全根 甘肃漳县 CDG7 中国当归 全根 甘肃渭源县 CDG8 中国当归 全根 甘肃渭源县 CDG9 中国当归 全根 四川茂县 CDG10 中国当归 全根 四川北川县 CDG11 中国当归 全根 云南鹤庆县 CDG12 中国当归 全根 成都荷花池中药材市场 JDG1 日本当归 全根 日本奈良 JDG2 日本当归 全根 日本奈良 JDG3 日本当归 粗颗粒 日本东京 JDG4 日本当归 全根 中国四川中江县 JDG5 日本当归 全根 中国四川北川县 JDG6 日本当归 全根 中国四川北川县 JDG7 日本当归 全根 中国四川汉源县 JDG8 日本当归 全根 深圳津村药业有限公司 JDG9 日本当归 粗粉 深圳津村药业有限公司 JDG10 日本当归 全根 韩国首尔 JDG11 日本当归 全根 韩国首尔 JDG12 日本当归 根切片 韩国首尔 JDG13 日本当归 粗颗粒 日本大阪 KDG1 韩国当归 根切片 韩国江源道平昌郡 KDG2 韩国当归 根切片 韩国江源道平昌郡 KDG3 韩国当归 根切片 韩国FDA KDG4 韩国当归 根切片 韩国首尔 KDG5 韩国当归 根切片 韩国首尔 KDG6 韩国当归 根切片 韩国首尔 KDG7 韩国当归 根切片 韩国首尔 KDG8 韩国当归 全根 吉林珲春市 EDG1 欧当归 粗颗粒 奥地利格拉茨 EDG2 欧当归 粗颗粒 奥地利格拉茨 EDG3 欧当归 粗颗粒 奥地利格拉茨 EDG4 欧当归 粗颗粒 德国柏林 AAR1 圆当归 粗颗粒 奥地利格拉茨 AAR2 圆当归 粗颗粒 奥地利维也纳 AAR3 圆当归 粗颗粒 奥地利维也纳 AAR4 圆当归 粗颗粒 奥地利维也纳 AAR5 圆当归 粗颗粒 奥地利维也纳 AAR6 圆当归 粗颗粒 波兰 AAR7 圆当归 粗颗粒 波兰 AAR8 圆当归 粗颗粒 波兰 AAR9 圆当归 粗颗粒 德国柏林

表 1 5种当归类药材样品的来源及多糖量 Table 1 Sources and contents of polysaccharides in five species of Angelicae Radix

精密称取葡萄糖对照品25.52 mg，置25 mL量瓶中，加蒸馏水溶解，定容至刻度，摇匀，得到葡萄糖对照品贮备液。分别精密吸取该贮备液0.6、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8 mL于10 mL量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，混匀。再分别精密吸取2.0 mL不同质量浓度的葡萄糖对照品溶液于具塞试管中，加DNS显色剂2.0 mL，混匀；置于恒温振荡水浴槽中显色反应30 min（99 ℃，100 r/min），冷却后加蒸馏水定容至10 mL，混匀；转移至15 mL离心管中，离心（3 000 r/min）20 min，制成不同质量浓度梯度的葡萄糖对照品溶液。

精密吸取2.0 mL蒸馏水于具塞试管中，自“加DNS显色剂2.0 mL”起操作，依法制得空白溶液。以空白溶液为背景，在520 nm波长下分别测定不同质量浓度葡萄糖对照品溶液的吸光度（A）值。以A值对质量浓度（C）进行线性回归，得回归方程为A=4.021 4 C-0.161 5，r=0.999 2。表明葡萄糖在0.061～0.286 g/L与其A值呈良好的线性关系。

精密称取药材粉末（过2号筛）1.0 g，加入50 mL蒸馏水，密封，称定质量；置于恒温振荡水浴槽中提取5 h（99 ℃，100 r/min），冷却后补足减失的质量，摇匀；取10 mL提取液，离心（3 000 r/min）20 min，精密移取上清液4.0 mL，注入装有20 mL无水乙醇的50 mL离心管中，静置10 h以上，离心（3 000 r/min）20 min，弃去上清液；加入2 mL无水乙醇洗涤离心管管壁和沉淀，离心（3 000 r/min）20 min，弃上清液；将沉淀物置于50 ℃烘箱干燥，得到粗多糖；再精密加入12 mL蒸馏水于粗多糖干燥物中，溶解多糖，即得当归类药材多糖水溶液。

精密吸取当归类药材多糖水溶液1.0 mL，加入6 mol/L盐酸2.0 mL，置恒温振荡水浴槽中水解30 min（99 ℃、100 r/min）；冷却后各加1滴1%酚酞试液，再分别滴加10 mol/L和2 mol/L的氢氧化钠溶液，中和盐酸至溶液变为粉红色。冷却后，用蒸馏水定容至10 mL，混匀；转移至15 mL离心管中，离心（3 000 r/min）20 min；取上清液，得当归类药材多糖水解液。

精密吸取2.0 mL当归类药材多糖水解液于具塞玻璃试管中，加入2.0 mL DNS显色剂，混匀，于恒温振荡水浴槽中显色30 min（99 ℃、100 r/min）；冷却后用蒸馏水定容至10 mL，混匀；转移至15 mL离心管中，离心（3 000 r/min）20 min，取上清液，即得样品供试液。

当归类药材多糖水溶液1.0 mL于具塞玻璃试管中，加入2.0 mL蒸馏水，置恒温振荡水浴槽中30 min（99 ℃、100 r/min）。冷却后分别加1%酚酞试液和2 mol/L氢氧化钠溶液各1滴。按照上述“2.1”项下方法，自“用蒸馏水定容至10 mL”起操作，依法制得空白溶液。

以空白对照溶液为背景，在520 nm处测定供试液的A值。重复测定3次。取平均值，根据回归方程计算供试液中多糖的质量浓度。再根据稀释倍数和样品质量，计算药材粉末样品中多糖的量。

取同一份当归多糖供试液，水解、显色后连续6次测定A值，其A值的RSD为0.43%。表明仪器的精密度良好。

取同一当归多糖供试液，分别于水解显色后0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h测定A值。其A值的RSD为3.49%。表明供试液显色后，在4.0 h内稳定。

取同一当归样品粉末6份，分别制备各供试品溶液，测定多糖量。其RSD为4.62%，表明所用方法重复性良好。

药材样品粉碎（过2号筛）后，每份粉末称取2份，按“2.3”项方法制备成供试品溶液，测定多糖的量，再计算2份平行样品中多糖量的平均值。46份当归类药材样品中多糖的量见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 测定结果（n=2） Table 2 Results of determination (n=2) 样品编号 质量分数/(mg·g-1) CDG1 88.28 CDG2 46.83 CDG3 68.50 CDG4 76.18 CDG5 72.23 CDG6 71.93 CDG7 99.56 CDG8 83.11 CDG9 97.79 CDG10 119.10 CDG11 80.34 CDG12 65.15 JDG1 89.67 JDG2 116.30 JDG3 119.40 JDG4 169.40 JDG5 186.60 JDG6 176.50 JDG7 155.10 JDG8 85.81 JDG9 101.40 JDG10 128.10 JDG11 87.54 JDG12 74.60 JDG13 157.80 KDG1 78.49 KDG2 61.69 KDG3 96.19 KDG4 80.37 KDG5 83.02 KDG6 79.47 KDG7 88.43 KDG8 83.36 EDG1 112.20 EDG2 134.60 EDG3 173.50 EDG4 148.80 AAR1 163.60 AAR2 171.10 AAR3 177.20 AAR4 162.00 AAR5 166.20 AAR6 142.60 AAR7 205.70 AAR8 126.50 AAR9 147.60

表 2 测定结果（n=2） Table 2 Results of determination (n=2)

5种当归类药材46份样品中均含有多糖。中国当归、日本当归、韩国当归、欧当归和圆当归中多糖的量分别为46.83～119.1 mg/g、74.60～186.6 mg/g、61.69～96.19 mg/g、112.2～173.5 mg/g、126.5～205.7 mg/g。这5种药材中多糖的量差异很大（P < 0.05），其平均值由高到低分别为圆当归（162.5 mg/g） > 欧当归（142.3 mg/g） > 日本当归（126.8 mg/g） > 韩国当归（81.38 mg/g） > 中国当归（80.75 mg/g）。当归多糖具有补血作用^[4-5]，还具有调节免疫、抗癌、抗氧化、抗辐射等多种活性^[6-9]。这5种当归类药材中多糖量不同，说明他们的生物活性和功效不同。

从日本、中国和韩国收集的日本当归中多糖量分别为89.67～157.8 mg/g、155.1～186.6 mg/g、74.60～128.1 mg/g。产于日本（131.37 mg/g）、中国（184.29 mg/g）和韩国（94.98 mg/g）的日本当归药材中多糖量之间有显著性差异（P < 0.05）。表明产地对日本当归药材中多糖量影响较大。日本当归在汉方中以补血功效入药^[10]，则不同产地的日本当归的补血功效可能不同。

测定多糖量的方法主要有3, 5-二硝基水杨酸法（DNS法）、苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法及直接滴定法。因用苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法测定多糖量时，无法排除还原性糖的干扰而致使结果偏高，且所用试剂（蒽酮和苯酚）稳定性较差，易被氧化。并且在操作过程中，硫酸在反应时会被稀释而放热，使得反应条件不易控制。而DNS法在测定多糖量时，可排除还原性糖的干扰；DNS试剂稳定性较好，从而避免了多次配制试剂所带入的误差。故本研究采用DNS法，测定5种当归类药材中多糖量。

为了选择最佳的检测波长，分别对葡萄糖用DNS显色剂显色后的溶液和DNS显色剂在400～600 nm波长下扫描。结果表明，葡萄糖-DNS显色剂的最大吸收波长为484 nm，蒸馏水-DNS显色剂的最大吸收波长为468 nm；DNS显色剂在400～510 nm内有较大吸收。若选择葡萄糖-DNS显色剂的最大吸收波长484 nm为检测波长，DNS显色剂对测定结果干扰严重。可见，最大吸收波长并非最佳检测波长。依据“吸收最大，干扰最小”原则，本研究选择520 nm作为检测波长，测定多糖的量。

为了减小DNS显色剂的干扰，比较了加入不同用量DNS显色剂的供试液的A值。结果表明，当DNS显色剂用量小于2.0 mL时，溶液的A值随显色剂用量的增加而增大；达到2.0 mL后，A值趋于稳定。表明DNS显色剂用量为2.0 mL时，样品溶液中的还原糖已完全反应、显色。因此，DNS显色剂以2.0 mL为宜。

对葡萄糖对照品溶液和当归多糖供试液的显色时间进行了考察。结果表明，30 min均可显色完全，故选择为显色时间。

当归多糖具有补血等多种生物活性。这5种当归类药材多用作补血药。但是，它们之间的多糖量差异很大，说明它们的功效不同，不宜混用。同时，本研究建立的DNS法测定多糖的方法稳定可靠、操作简便，适合于测定当归类药材多糖的量。