2016, Vol. 47
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.20.005 |
叶下珠为大戟科（Euphorbiceace）叶下珠属Phyllanthus L. 植物叶下珠Phyllanthus urinaria L. 的干燥全草，又名珍珠草、夜合草、阴阳草。药用部位是其干燥全草，具有清肝明目、解毒消肿、消炎、止泻、利水、利尿等功效，常用于治疗腹泻下痢、尿路感染、小儿疳积、肝炎、肾炎等疾病[1]。主要含有鞣质类、黄酮类、木脂素类、有机酸类、萜类、甾体类、多酚类等化学成分。现代药理研究显示其具有抗乙型肝炎病毒、保肝作用、抗肿瘤作用、抗HSV病毒、影响凝血系统、镇痛作用、抗菌作用等药理功效[2-3]，因而受到广泛的关注。本实验对叶下珠全草95%乙醇提取物进行系统分离，从其石油醚和醋酸乙酯萃取部位得到16个化合物，分别鉴定为没食子酸（gallic acid，1）、咖啡酸（caffeic acid，2）、没食子酸乙酯（ethyl gallate，3）、没食子酸甲酯（methyl gallate，4）、4-乙氧基苯甲酸（4-ethoxybenzoic acid，5）、邻苯二甲酸二异丁酯（diisobutyl phthalate，6）、邻苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，7）、(4R,6R)-2,3-dihydromenisdaurilide（8）、(4R,6S)-2,3-dihydro-menisdaurilide（9）、aquilegiolide（10）、menisdaurilide（11）、cassipourol（12）、(9Z,12Z)-nonadeca-9,12-dienoic acid（13）、亚油酸甲酯（methyl linoleate，14）、豆甾醇（stigmasterol，15）、(8R,8′S,7S)-4′-(3″-methoxyrhamnopyranosyl) oxy-8′-hydroxy-3,3′,4-trimethoxy-8-hydroxymethyl-lign-7,9′-lactone（16）。其中，化合物5～7、10、11、13、14为首次从该植物中分离得到，化合物8、9、12、16为首次从该属植物中首次分离得到。
1 材料与仪器ZF-90型暗箱式紫外透射仪（上海顾村电光仪器厂）；Bruker AV-400、Avance III 600及DRX-500核磁共振仪（德国Bruker公司）；分析型HPLC（安捷伦1200系列）；半制备、制备HPLC（塞普锐斯）；柱色谱硅胶（200～300目，青岛海洋化工厂）；RP18（20～45、40～60 μm，日本）；MCI gel CHP 20P（75～150 μm，日本）；Sephadex LH-20（Amersham Biosciences，瑞士）；高效薄层色谱板GF254（青岛海洋化工厂）。
叶下珠药材产于广西，经成都中医药大学药用植物教研室卢先明教授鉴定为大戟科叶下珠属植物叶下珠Phyllanthus urinaria L. 的干燥全草。
2 提取与分离将自然阴干的叶下珠全草（6 kg），切断粉碎，用95%乙醇渗漉提取得渗漉提取液，将其减压干燥后得到的浸膏用水混悬后，依次用石油醚、醋酸乙酯、水饱和的正丁醇萃取，萃取液减压干燥，得石油醚部位浸膏（40 g）、醋酸乙酯部位浸膏（100 g）、正丁醇部位浸膏（80 g）以及剩余的水部位。醋酸乙酯部位采用正相硅胶柱色谱，石油醚-醋酸乙酯（40∶1→0∶1）梯度洗脱，再过渡为醋酸乙酯-甲醇（100∶1→0∶1）梯度洗脱后通过TCL检视，合并相同组分，分为6个部分A～F。B段经200～300目的硅胶柱色谱，按二氯甲烷-甲醇（100∶1→1∶1）梯度洗脱。经二氯甲烷-甲醇（30∶1）、Pre-HPLC（C18柱，18%甲醇-水）制备，得到化合物5（12.5 mg）；经二氯甲烷-甲醇（25∶1）、Pre-HPLC（C18柱，16%甲醇-水）制备，得到化合物3（10 mg）、4（30 mg）。C段经硅胶柱色谱（200～300目），二氯甲烷-甲醇（100∶1→1∶1）梯度洗脱。二氯甲烷-甲醇（100∶1）洗脱所得流分再经Pre-HPLC（C18柱，20%甲醇-水）制备得到化合物8（15 mg）、9（12 mg）、10（14 mg）、11（25.5 mg）；二氯甲烷-甲醇（40∶1）洗脱所得的流分再经Pre-HPLC（C18柱，18%甲醇-水）制备得到化合物6（11 mg）、7（12 mg）。
D段经硅胶柱色谱（200～300目），二氯甲烷-甲醇（100∶1→1∶1）梯度洗脱。二氯甲烷-甲醇（30∶1）洗脱所得流分再经Pre-HPLC（C18柱，23%甲醇-水）制备，得到化合物1（11 mg）；二氯甲烷-甲醇（25∶1）洗脱所得的流分经Pre-HPLC（C18柱，27%甲醇-水）制备，得到化合物2（8 mg）。
石油醚部位采用正相硅胶柱色谱，石油醚-丙酮系统（100∶1→0∶1），再过渡为丙酮-甲醇系统（100∶1→0∶1），梯度洗脱后合并为8个部分a～h。b段经硅胶柱色谱，石油醚-醋酸乙酯（100∶1→1∶1）梯度洗脱得b1～b5。b1经硅胶柱色谱（石油醚-醋酸乙酯100∶1）、Sephadex LH-20（氯仿-甲醇1∶1）、Pre-TCL（石油醚-丙酮4∶1）得b1-1、b1-2，再各经Pre-HPLC（C18柱，73%甲醇-水、67%甲醇-水）分别得到化合物13（10 mg）、14（12.5 mg）；B2经硅胶柱色谱流动相为石油醚-醋酸乙酯（80∶1）、Sephadex LH-20（氯仿-甲醇1∶1）、Pre-HPLC（C18柱，57%甲醇-水）得到化合物12（11 mg）；B4经硅胶柱色谱，石油醚-醋酸乙酯（50∶1）洗脱，再经醋酸乙酯反复重结晶得化合物15（167 mg）；D段经硅胶柱色谱（石油醚-醋酸乙酯20∶1）、Sephadex LH-20（氯仿-甲醇1∶1）、Pre-HPLC（C18柱，63%甲醇-水）得到化合物16（9 mg）。
3 结构鉴定化合物1：无色针状结晶（甲醇），1H-NMR (400 MHz,CD3OD) δ: 6.96 (2H,s,H-2,6)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD) δ: 169.4 (C-7),145.0 (C-3,5),138.0 (C-4),121.2 (C-1),109.0 (C-2,6)。以上数据与文献报道基本一致[4]，故鉴定化合物1为没食子酸。
化合物2：白色结晶（甲醇），1H-NMR (400 MHz,CD3OD) δ: 7.39 (1H,d,J = 16.0 Hz,H-7),6.90 (1H,d,J = 2.0 Hz,H-1),6.80 (1H,dd,J = 2.0,8.0 Hz,H-5),6.64 (1H,d,J = 8.0 Hz,H-2),6.08 (1H,d,J = 15.8 Hz,H-8)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD) δ: 171.1 (C-9),149.5 (C-7),147.1 (C-4),146.8 (C-3),127.8 (C-6),122.9 (C-1),116.5 (C-2),115.6 (C-8),115.1 (C-5)。以上数据与文献报道基本一致[5]，故鉴定化合物2为咖啡酸。
化合物3：白色针状结晶（氯仿），1H-NMR (400 MHz,CD3OD) δ: 7.09 (2H,s,H-2,6),4.68 (2H,q,J = 7.2 Hz,H-8),1.24 (3H,t,J = 7.2 Hz,H-9)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD) δ: 167.2 (C-7),146.2 (C-3,5),139.1 (C-4),123.1 (C-1),109.6 (C-2,6),60.1 (C-8),15.1 (C-9)。以上数据与文献报道基本一致[6]，故鉴定化合物3为没食子酸乙酯。
化合物4：白色针状结晶（甲醇），1H-NMR (400 MHz,CD3OD) δ: 7.06 (2H,s,H-2,6),4.97 (3H,s,-OCH3)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD) δ: 172.0 (C-7),146.5 (C-3,5),139.4 (C-4),123.7 (C-1),110.6 (C-2,6),50.1 (C-8)。以上数据与文献报道基本一致[7]，故鉴定化合物4为没食子酸甲酯。
化合物5：白色针状结晶（甲醇），1H-NMR (400 MHz,CDCl3) δ: 7.89 (2H,d,J = 8.6 Hz,H-2,6),6.80 (2H,m,H-3,5),4.14 (2H,q,J = 7.0 Hz,H-8),1.26 (3H,t,J = 7.0 Hz,H-9)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD) δ: 163.0 (C-7),133.0 (C-2,6),122.4 (C-1),116.0 (C-3,5),61.6 (C-8),14.5 (C-9)。以上数据与文献报道基本一致[8]，故鉴定化合物5为4-乙氧基苯甲酸。
化合物6：微黄色油状物，1H-NMR (400 MHz,CDCl3) δ: 7.72 (2H,dt,J = 3.5,7.0 Hz,H-1,2),7.54 (2H,dd,J = 3.3,5.7 Hz,H-3,6),4.09 (4H,d,J = 6.7 Hz,H-1′,1″),2.04 (2H,tt,J = 6.7,13.5 Hz,H-2′,2″),1.08 (12H,d,J = 7.0 Hz,H-3′,3″,4′,4″)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ: 167.5 (C-7,8),132.1 (C-4,5),130.7 (C-1,2),128.7 (C-3,6),71.5 (C-1′,1″),27.5 (C-2′,2″),18.9 (C-3′,4′,3″,4″)。以上数据与文献报道基本一致[9]，故鉴定化合物6为邻苯二甲酸二异丁酯。
化合物7：微黄色油状物，1H-NMR (400 MHz,CDCl3) δ: 7.71 (2H,dt,J = 3.7,7.0 Hz,H-1,2),7.53 (2H,dd,J = 3.3,5.7 Hz,H-3,6),4.31 (4H,t,J = 6.7 Hz,H-1′,1″),2.29 (4H,dd,J = 7.3,14.8 Hz,H-2′,2″),1.44 (4H,dd,J = 7.5,15.0 Hz,H-3′,3″),0.97 (6H,q,J = 7.0 Hz,H-4′,4″)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ: 167.1 (C-7,8),131.7 (C-4,5),130.3 (C-1,2),128.2 (C-3,6),64.9 (C-1′,1″),29.9 (C-2′,2″),17.8 (C-3′,3″),13.1 (C-4′,4″)。以上数据与文献报道基本一致[9]，故鉴定化合物7为邻苯二甲酸二丁酯。
化合物8：白色粉末，1H-NMR (400 MHz,CD3OD) δ: 5.82 (1H,s,H-2),4.93 (1H,dd,J = 11.6,6.2 Hz,H-4),3.91 (1H,tt,J = 3.8,11.2 Hz,H-6),2.89 (1H,dd,J = 14.4,2.6 Hz,H-8e),2.43 (1H,d,J = 5.0 Hz,H-8a),2.70 (1H,m,H-5e),1.25 (1H,s,H-5a),2.21 (1H,m,H-7e),1.38 (1H,m,H-7a)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD) δ: 176.2 (C-1),174.4 (C-3),113.4 (C-2),81.6 (C-4),67.7 (C-6),43.6 (C-7),36.1 (C-8),25.3 (C-5)。以上数据与文献报道基本一致[10]，故鉴定化合物8为(4R,6R)-2,3-dihydromenisdaurilide。
化合物9：白色粉末，1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ: 5.83 (1H,s,H-2),5.19 (1H,dd,J = 11.6,6.2 Hz,H-4),4.31 (1H,m,H-6),2.81 (1H,m,H-8a),2.81 (1H,m,H-8e),2.68 (1H,m,H-5e),2.16 (1H,m,H-7e),1.58 (1H,m,H-7a),1.40 (1H,m,H-5a)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD) δ: 176.5 (C-1),175.7 (C-3),112.9 (C-2),81.1 (C-4),66.6 (C-6),41.9 (C-7),34.1 (C-8),24.1 (C-5)。以上数据与文献报道基本一致[10]。故鉴定化合物9为 (4R,6S)-2,3-dihydro- menisdaurilide。
化合物10：白色针状结晶（甲醇），1H-NMR (400 MHz,CD3OD) δ: 6.68 (1H,dd,J = 16.0,6.0 Hz,H-8),6.40 (1H,dd,J = 9.6,5.2 Hz,H-7),5.87 (1H,d,J = 18.2 Hz,H-2),5.35 (1H,ddd,J = 12.7,5.2,1.7 Hz,H-4),4.61 (1H,m,H-6),2.57 (1H,m,H-5e),1.81 (1H,m,H-5a)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD) δ: 176.1 (C-1),166.0 (C-3),140.2 (C-7),122.4 (C-8),112.9 (C-2),78.6 (C-4),65.3 (C-6),38.8 (C-5)。以上数据与文献报道基本一致[10]，故鉴定化合物10为aquilegiolide。
化合物11：白色针状结晶（甲醇），1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ: 6.69 (1H,dd,J = 16.0,6.0 Hz,H-8),6.40 (1H,d,J = 9.6 Hz,H-7),5.91 (1H,s,H-2),5.09 (1H,dd,J = 13.2,3.6 Hz,H-4),4.65 (1H,m,H-6),2.90 (1H,dt,J = 10.0,5.0 Hz,H-5e),1.59 (1H,m,H-5a)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD) δ: 176.0 (C-1),166.4 (C-3),146.2 (C-7),120.5 (C-8),111.6 (C-2),80.2 (C-4),67.4 (C-6),41.2 (C-5)。以上数据与文献报道基本一致[10]，故鉴定化合物11为menisdaurilide。
化合物12：微黄色油状物，1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ: 5.41 (1H,dd,J = 6.4,7.4 Hz,H-14),4.15 (2H,d,J = 7.0 Hz,H-15),1.99 (2H,t,J = 7.3 Hz,H-12),1.67 (3H,s,H-20),0.87 (3H,s,H-16),0.86 (3H,s,H-17),0.85 (3H,d,J = 2.3 Hz,H-18),0.84 (3H,d,J = 2.8 Hz,H-19)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ: 140.3 (C-13),123.1 (C-14),59.4 (C-15),39.9 (C-12),39.3 (C-2),37.4 (C-4,10),37.3 (C-8),36.5 (C-1),32.8 (C-6),32.7 (C-9),28.0 (C-5),25.2 (C-11),24.8 (C-3),24.5 (C-7),22.7 (C-16),22.6 (C-17),19.7 (C-18,19),16.2 (C-20)。以上数据与文献报道基本一致[11]，故鉴定化合物12为cassipourol。
化合物13：白色固体，1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ: 5.37 (4H,m,H-9,10,12,13),3.67 (3H,s,H-19),2.80 (2H,m,H-11),2.32 (2H,t,J = 7.6,15.4 Hz,H-2),2.05 (4H,m,H-8,14),1.63 (2H,m,H-3),1.24～1.31 (16H,m,H-4～7,15～18),0.88 (3H,t,J = 6.8 Hz,H-19)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD) δ: 179.5 (C-1),131.0 (C-13),130.0 (C-12),128.2 (C-10),127.7 (C-9),34.0 (C-11),31.9 (C-14),31.6 (C-8),29.8 (C-2),29.7 (C-16),29.6 (C-15),29.4 (C-3),29.2 (C-7),29.1 (C-6),27.2 (C-5),25.6 (C-4),24.7 (C-17),22.7 (C-18),14.2 (C-19)。以上数据与文献报道基本一致[12]，故鉴定化合物13为 (9Z,12Z)-nonadeca- 9,12-dienoic acid。
化合物14：无色油状物，1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ: 5.36 (4H,m,H-9,10,12,13),3.67 (3H,s,H-19),2.77 (2H,t,J = 6.37 Hz,H-11),2.31 (2H,t,J = 7.6 Hz,H-2),2.05 (4H,m,H-8,14),1.62 (2H,m,H-3),1.36 (6H,m,H-15～17),1.31 (4H,m,H-4,5) 1.25 (4H,m,H-6,7),0.89 (3H,m,H-18)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD) δ: 174.4 (C-1),130.2 (C-13),130.1 (C-9),128.1 (C-12),127.9 (C-10),51.5 (C-19),34.2 (C-11),31.6 (C-14),29.6 (C-8),29.4 (C-2),29.1 (C-7,15,16),27.2 (C-5,6),25.6 (C-4),24.9 (C-3),22.6 (C-17),14.1 (C-18)。以上数据与文献报道基本一致[13]，故鉴定化合物14为亚油酸甲酯。
化合物15：白色结晶（醋酸乙酯），1H-NMR (400 MHz,CDCl3) δ: 5.35 (1H,d,J = 5.0 Hz,H-6),5.15 (1H,dd,J = 8.8,15.2 Hz,H-6),5.02 (1H,dd,J = 8.8,15.2 Hz,H-22),3.52 (1H,m,H-3)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ: 140.8 (C-5),138.3 (C-22),129.3 (C-23),121.7 (C-6),71.8 (C-3),56.8 (C-14),56.0 (C-17),51.3 (C-24),50.2 (C-9),42.4 (C-4),42.3 (C-13),40.5 (C-20),39.8 (C-12),37.3 (C-1),36.5 (C-10),36.2 (C-25),31.9 (C-2,8),31.7 (C-7),29.2 (C-26),28.3 (C-16),25.4 (C-28),24.3 (C-15),21.1 (C-21),19.8 (C-11),19.4 (C-19),19.0 (C-27),12.3 (C-29),12.1 (C-18)。以上数据与文献报道基本一致[14]，故鉴定化合物15为豆甾醇。
化合物16：白色固体，1H-NMR (600 MHz,CD3OD) δ: 7.05 (1H,d,J = 8.2 Hz,H-5′),6.98 (1H,d,J = 1.8 Hz,H-2′),6.84 (1H,d,J = 8.2 Hz,H-5),6.85 (1H,dd,J = 8.2,1.8 Hz,H-6′),6.59 (1H,dd,J = 8.2,1.8 Hz,H-6),6.41 (1H,d,J = 1.8 Hz,H-2),5.34 (1H,d,J = 1.6 Hz,H-1″),5.11 (1H,d,J = 9.2 Hz,H-7),3.95 (1H,dd,J = 11.4,7.4 Hz,H-9a),3.80 (3H,s,3′-OCH3),3.78 (3H,s,4-OCH3),3.65 (3H,s,3-OCH3),3.61 (1H,dd,J = 11.4,4.8 Hz,H-9b),3.53 (3H,s,3″-OCH3),3.31 (1H,d,J = 13.2 Hz,H-7′a),3.05 (1H,d,J = 13.1 Hz,H-7′b),2.45 (1H,m,H-8),1.21 (3H,d,J = 6.3 Hz,H-6″),3.86～4.28 (4H,m,H-2″～5″)；13C-NMR (150 MHz,CD3OD)δ: 180.1 (C-9′),152.0 (C-3′),151.8 (C-3),150.6 (C-4),146.0 (C-4′),132.8 (C-1′),132.9 (C-1),124.7 (C-6′),120.6 (C-6),120.2 (C-5′),116.5 (C-2′),112.8 (C-5),110.7 (C-2),101.8 (C-1″),82.9 (C-7),82.1 (C-3″),79.4 (C-8′),72.9 (C-4″),70.8 (C-5″),68.3 (C-2″),61.6 (C-9),60.6 (3″-OCH3),58.6 (3′-OCH3),57.8 (4-OCH3),56.4 (3-OCH3),51.6 (C-8),42.8 (C-7′),18.0 (C-6″)。以上数据与文献报道基本一致[15]，故鉴定化合物16为 (8R,8′S,7S)-4′-(3″-methoxyrhamno- pyranosyl) oxy-8′-hydroxyl-3,3′,4-trimethoxy-8-hydroxy methyl-lign-7,9′-lactone。
4 讨论本研究对叶下珠的乙醇提取物的醋酸乙酯萃取部位进行了系统的分离，鉴定了16个化合物，化合物5～7、10、11、13、14为首次从该植物中分离得到，化合物8、9、12、16为首次从该属植物中首次分离得到。化合物1、2～4为多酚类化合物，而多酚多具有抗菌消炎的作用；化合物8～11为内酯类化合物，有文献报道[16]其具有抗肿瘤活性；从叶下珠药材中所分离得到多酚类结构和内酯类结构，也从侧面证明了叶下珠具有抗菌消炎和抗肿瘤的药理作用。
| [1] | 罗文继, 阮细发, 杨义雄. 叶下珠研究概述[J]. 海峡药学 , 1998, 10 (1) :70–72. |
| [2] | 马新宇, 裴俊俊. 叶下珠药理研究综述[J]. 齐鲁药事 , 2006, 25 (2) :104–105. |
| [3] | 戴卫波, 肖文娟. 叶下珠药理作用研究进展[J]. 药物评价研究 , 2016, 39 (3) :498–500. |
| [4] | 董礼, 李磊, 廖志华, 等. 柴胡红景天化学成分的研究[J]. 西北植物学报 , 2007, 27 (12) :2564–2567. |
| [5] | 霍立娜, 王威, 刘洋, 等. 紫苏叶化学成分研究[J]. 中草药 , 2016, 47 (1) :26–31. |
| [6] | 杨明珠, 田新雁, 肖朝江, 等. 核桃分心木化学成分与生物活性研究[J]. 天然产物研究与开发 , 2012, 24 (12) :1707–1711. |
| [7] | 梁琼, 杨胜祥, 况燚, 等. 苦竹嫩茎化学成分的研究[J]. 中草药 , 2015, 46 (8) :1125–1128. |
| [8] | 卢启洪, 徐娟华, 赵昱, 等. 孔石莼化学成分的研究[J]. 中国药学杂志 , 2008, 43 (8) :582–584. |
| [9] | 史大永, 韩丽君, 孙杰, 等. 海藻基根硬毛藻的化学成分研究[J]. 中国中药杂志 , 2005, 30 (5) :347–350. |
| [10] | Otsuka H, Ito A, Fujioka N, et al. Butenolides from Sinomenium acutum[J]. Phytochemistry , 1993, 33 (2) :389–392. DOI:10.1016/0031-9422(93)85525-V |
| [11] | Prakash Chaturvedula V S, Andrew N, Miller J S, et al. Cytotoxic diterpenes from Cassipourea madagascariensis from the Madagascar Rainforest 1[J]. J Nat Prod , 2006, 69 (2) :287–289. DOI:10.1021/np050376w |
| [12] | Fang M J, Fang H, Li W J, et al. A new diphenyl ether from Phoma sp. strain, SHZK-2[J]. Nat Prod Res , 2012, 26 (13) :1224–1228. DOI:10.1080/14786419.2011.559947 |
| [13] | 朱珠, 马琳, 朱海燕, 等. 民族药珠芽艾麻化学成分研究[J]. 中药材 , 2011, 34 (2) :223–225. |
| [14] | 何轶, 赵明, 宗玉英, 等. 伞花木化学成分研究[J]. 中草药 , 2010, 41 (1) :36–39. |
| [15] | Yoon K D, Jeong D G, Hwang Y H, et al. Inhibitors of osteoclast differentiation from Cephalotaxus koreana[J]. J Nat Prod , 2007, 70 (12) :2029–2032. DOI:10.1021/np070327e |
| [16] | Mcnulty J, Poloczek J, Larichev V, et al. Discovery of the apoptosis-inducing activity and high accumulation of the butenolides, menisdaurilide and aquilegiolide in Dicentra spectabilis[J]. Planta Med , 2007, 73 (15) :1543–1547. DOI:10.1055/s-2007-990264 |