莪术Curcuma Rhizoma(CR)为姜科（Zingiberaceae）植物蓬莪术Curcuma phaeocaulis Valeton、广西莪术Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang或温郁金Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling的干燥根茎，主要分布于浙江、四川、福建、广西等省区，以根入药，其味辛、苦、性温，归肝、脾经，具有行气破血、消积止痛的功效。莪术药用功能非常广泛，临床用于治疗癥瘕痞块、瘀血经闭、食积胀痛；早期宫颈癌等症^[1]。并且作为一种抗肿瘤、抗病毒、抗炎的重要药材，莪术临床用量和工业化生产用量十分巨大^[2]。

在研究植物多样性的众多分子标记技术中，RAPD（random amplified polymorphic DNA）是应用最广泛的技术方法之一。RAPD标记是1990年由Williams等^[3]和Welsh等^[4]同时推出的一种分子标记技术，是以PCR反应为基础，以随机碱基寡核苷酸为引物，对基因组DNA进行扩增而显示出多态性的DNA指纹技术，因操作简单易行、不需要事先知道材料的基因信息、能够覆盖整个基因组以及显性遗传标记等优点而被广泛应用于药用植物种内或种间亲缘关系核遗传多样性方面的研究^[5]。如用于中药基原动植物分类、遗传关系分析、遗传多样性评价、资源保护以及药材的鉴定等方面^[6-7]。本实验采用RAPD-PCR分子标记对蓬莪术、广西莪术、福建郁金（当地品种）及温郁金共4个种9个居群的遗传关系和多样性进行了研究。以期为莪术种质资源筛选提供参考。

样品为不同地域莪术的4个种，经温州医科大学董建勇教授鉴定，结果见表 1。选取莪术嫩叶，每居群取样4～5个，野外采集用冰壶和变色硅胶快速干燥，带回实验室后置于−80 ℃下低温保存。

表 1(Table 1)

表 1 用于RAPD-PCR分析的9个莪术居群 Table 1 Analysis on CR from nine different populations by RAPD-PCR 编号 类型 居群 样本数 SC-1 蓬莪术Curcuma phaeocaulis 四川崇州市三江镇 4 SC-2 蓬莪术 四川双流县金桥镇 5 GX-3 广西莪术Curcuma kwangsiensis 广西灵山县陆屋镇 5 GX-4 温郁金Curcuma wenyujin 广西贵港市桥圩镇 5 FJ-5 福建郁金Curcuma fujian 福建省泉州市马甲镇 5 FJ-6 温郁金 福建省泉州市马甲镇 4 ZJ-7 温郁金 浙江瑞安市 5 ZJ-8 温郁金 浙江温州市苍南县 4 ZJ-9 温郁金 浙江乐清市 5

表 1 用于RAPD-PCR分析的9个莪术居群 Table 1 Analysis on CR from nine different populations by RAPD-PCR

DNA的提取与纯化采用改进的CTAB法^[5]。提取后用核酸蛋白质仪检测DNA浓度，1.2%琼脂糖胶电泳检查DNA的完整性。

PCR扩增在PC-818A PCR仪上进行。反应体系（25 μL）：Taq酶（5 U/μL）0.3 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，Mg²⁺（25 mmol/L）2 μL，引物（20 μmol/L）1 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，模板DNA 1 μL（DNA量1～2 ng），ddH₂O 16.2 μL。

94 ℃预变性5 min，94 ℃变性35 s，36 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，共42个循环；72 ℃延伸10 min。

吸取6 μL反应液与2 μL 6×加样缓冲液混合，扩增产物在含0.5 μg/μL溴化乙锭（EB）的1.5%琼脂糖胶中电泳，电极缓冲液为0.5×TAE，5 V/cm的电场强度下电泳30 min左右，在紫外灯下观察并拍照。

选择4个种的10个样本，从90个引物中选出10个扩增条带数目适中、信号强、背景清晰、重复性好、样本间具有较多差异的引物（表 2），然后用于全部DNA样品的扩增，每个选定的引物至少扩增2次。

表 2(Table 2)

表 2 莪术种质资源随机引物的扩增结果 Table 2 Amplificaiton for random primers in germplasm resources of CR 引物 核苷酸碱基序列（5’-3’） 位点总数 多态性位点数 多态百分率/% 0163 TGCTCTGCCC 8 6 75.0 0165 GAGAGCCAAC 10 8 80.0 0172 ACCCGGTCAC 5 3 60.0 0176 AATCGGGCTG 15 12 80.0 0181 AGCCAGCGAA 4 4 100.0 0188 AAAGCTGCGG 7 6 85.7 0194 GGAGGGTGTT 8 5 62.5 0196 AGGTGACCGT 10 7 70.0 0201 GTTGCGATCC 5 4 80.0 0212 GGACACCACT 11 9 81.8 总数 — 83 64 77.5 平均数 — 8.3 6.4 77.5

表 2 莪术种质资源随机引物的扩增结果 Table 2 Amplificaiton for random primers in germplasm resources of CR

以DL2000 Markers作为相对分子质量标记的标准，根据PCR扩增条带在琼脂糖凝胶上的迁移程度，确定各品种莪术RAPD-PCR条带的位置和相对分子质量大小，将每个样品的扩增条带按有或无来记录，有此条带赋值“1”（含明带和暗带），无此条带赋值为“0”，按Nei’s的方法统计条带数，计算遗传相似系数（GS）和遗传距离（GD）。

N_AB是样品A和样品B共有的条带数，N_A和N_B分别是样品A和样品B具有的条带数

用POPGEN32软件进行统计分析，根据遗传距离采用UPGMA法进行聚类分析，建立树状结构图。

对购自上海英俊公司的90条10碱基随机引物进行筛选，筛选出10条扩增产物较多、谱带清晰、多态性较好的引物，用这些引物，对9个居群的莪术品种进行PCR扩增，并对扩增片断进行统计分析（表 2）。结果显示，10个引物共扩增出83个位点，其中64个为多态性位点，占77.5%。平均每个引物所扩增的位点为8.3个，多态性位点数4～15，平均6.4个位点。以引物0165、0176、0172和0196的扩增结果为代表，见图 1～4。

M-Marker 1～5-SC-1 6～10-SC-2 11～16-GX-3 17～20-GX-4 21～25-FJ-5 26～30-FJ-6 31～34-ZJ-7 35～38-ZJ-8 39～42-ZJ-9，下同 M-Marker 1～5-SC-1 6～10-SC-2 11～16-GX-3 17～20-GX-4 21～25-FJ-5 26～30-FJ-6 31～34-ZJ-7 35～38-ZJ-8 39～42-ZJ-9, same as below 图 1 引物0165的RAPD扩增 Fig.1 RAPD amplification of Primer 0165

图 2 引物0176的RAPD扩增 Fig.2 RAPD amplification of Primer 0176

图 3 引物0170的RAPD扩增 Fig.3 RAPD amplification of Primer 0170

图 4 引物0177的RAPD扩增 Fig.4 RAPD amplification of Primer 0177

用POPGEN32计算莪术品种间的Nei’s相似系数和遗传距离（表 3），由表 3可知，莪术的不同种之间的遗传多样性明显，遗传距离大，在0.22～0.58，蓬莪术和福建郁金之间的遗传距离最大，为0.573 3，广西莪术和温郁金的遗传距离最小，也达到0.222 1，同一种之间的遗传距离较小，四川的蓬莪术2个居群之间还没有形成分化，温郁金各居群间的分化也不明显，遗传距离最大的也只有0.002 0，所以，不同种的居群间分化明显，遗传距离大，而同一个种的不同居群间还没有形成明显的分化类群。

表 3(Table 3)

表 3 莪术种质资源的Nei’s相似系数和遗传距离 Table 3 Nei's Similarity coefficient and genetic distance for germplasm resources of CR 居群 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 — 1.000 0 0.627 9 0.578 7 0.563 6 0.581 8 0.587 6 0.578 7 0.585 5 2 0.000 0 — 0.627 9 0.578 7 0.563 6 0.581 8 0.587 6 0.578 7 0.585 5 3 0.465 4 0.465 4 — 0.800 0 0.617 1 0.799 2 0.800 5 0.800 0 0.800 9 4 0.547 0 0.547 0 0.223 2 — 0.625 9 0.998 4 0.998 0 1.000 0 0.999 0 5 0.573 3 0.573 3 0.482 8 0.468 6 — 0.618 2 0.617 9 0.625 9 0.622 1 6 0.541 6 0.541 6 0.224 1 0.001 6 0.481 0 — 0.998 8 0.998 4 0.998 2 7 0.531 7 0.531 7 0.222 6 0.002 0 0.481 4 0.001 2 — 0.998 0 0.999 6 8 0.547 0 0.547 0 0.223 2 0.000 0 0.468 6 0.001 6 0.002 0 — 0.999 0 9 0.535 2 0.535 2 0.222 1 0.001 0 0.474 6 0.001 8 0.000 4 0.001 0 — 左下为遗传距离右上为相似系数 The bottom left is genetic distance, and the upper right is similarity coefficient

表 3 莪术种质资源的Nei’s相似系数和遗传距离 Table 3 Nei's Similarity coefficient and genetic distance for germplasm resources of CR

以Nei’s相似系数为依据，对不同种莪术的基因组DNA的扩增条带的编码数据进行编码矩阵和聚类分析，构建莪术的UPGMA聚类图（图 5）。从图 5可知，蓬莪术的2个居群，温郁金的5个居群首先聚为一类，然后再与其他种的莪术聚类，验证了同种莪术的亲缘关系较近。聚类图中，温郁金首先和广西莪术聚类，然后和福建郁金聚类，最后和蓬莪术聚在一起，说明温郁金和广西莪术的亲缘关系最近，和福建郁金的关系次之，和蓬莪术的亲缘关系最远。瑞安市的温郁金和乐清市的温郁金首先聚为一类，这与它们来自比较近的地理种源相吻合。广西的温郁金和浙江苍南的温郁金聚为一类，福建的温郁金最后聚类。

图 5 不同莪术种质资源的RAPD聚类分析图 Fig.5 Dendrogram of RAPD cluster analysis for different germplasm resources of CR

遗传多样性决定物种进化和适应环境的能力，物种遗传多样性越丰富，对环境适应能力就越强，在进化过程维持其遗传多样性的水平就越高^[8]。本研究通过对莪术种质资源的研究，共扩增出83个位点，其中64个为多样性位点数，多态性达到77.5%，遗传距离变化范围为0.22～0.58，表明莪术不同种之间的遗传多样性丰富，遗传变异大，亲缘关系较远，而同种的莪术居群间则分化不明显，刘万水等^[9]对雷公藤属3种植物的遗传关系和遗传多样性的RAPD分析也表明不同种的雷公藤遗传分化明显，遗传多样性主要存在于居群间，而居群内的分化不明显。所以，应该加强莪术种质资源的保护，增加不同莪术遗传多样性及其农艺性状特征和遗传基础的研究，防止莪术遗传基础狭窄。

DNA分子标记技术是基于生物个体间或种群间基因组DNA某一片段的不同而反应生物个体或种群间的差异，被广泛应用于遗传多样性分析。目前，应用较广泛的分子标记技术有RAPD和ISSR技术^[10]。每种分子标记技术都能从不同层次反映供试样品的遗传多样性，但均存在一些局限性^[11]。RAPD技术是以单一随机寡核苷酸序列为引物进行PCR非定点扩增，特点是简单易操作，但对反应条件敏感、重复性差，且RAPD为显性遗传，多态性信息量较低^[12]；ISSR是利用包含重复序列并在3’或5’锚定的单寡聚核苷酸引物对基因组进行PCR扩增的标记系统，具有多态性高、能实现全基因组无编码取样和无组织器官特异性等优点，但其标记大多为显性标记，不能区分显性纯合基因型和杂合基因型。本实验在前期利用ISSR标记分析不同种和居群莪术的基础上，进一步用RAPD标记技术对莪术的种质资源进行研究，证明了ISSR和RAPD分子标记技术均可用于温郁金种质资源遗传多样性的研究，2种分子标记技术对温郁金的分类结果相似，均表明温郁金和蓬莪术的亲缘关系最远，广西莪术介于温郁金和蓬莪术之间，但是广西莪术与温郁金和蓬莪术的亲缘关系还有待进一步研究。

通常认为，不同种或种内居群的相似度大小一定程度上反映这些类群的亲缘关系远近。从聚类图和相似性系数分析结果来看，莪术的不同种之间的亲缘关系较远，同种不同居群之间的亲缘关系较近，且与地理分布有密切关系。伍莲等^[13]对金毛狗的研究也发现，居群间的遗传距离与地理种源密切相关，较近地理种源的居群间遗传相似性高，遗传距离小；较远地理种源的居群间遗传相似性低，遗传距离大。地理种源影响居群间的遗传距离。李娟等^[14]的研究也表明同一产地的同一种样品的RAPD图谱基本一致。地理分布越远，其遗传差距越明显。白音等^[15]对美花石斛种质资源的RAPD分析也表明，美花石斛的亲缘关系与其地理分布有一定的关系，与本实验对温郁金种质资源亲缘关系的研究结果相似。另外，本实验将福建郁金（地方品种）与蓬莪术、广西莪术和温郁金进行了亲缘关系分析，研究发现，福建郁金与蓬莪术的遗传距离最大，与广西莪术和温郁金的亲缘关系较近，但不属于广西莪术或温郁金，《中国药典》并未记载，福建郁金是否为一个新种，有待进一步研究。