2016, Vol. 47
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.16.012 |
2. 山东师范大学生命科学学院, 山东 济南 250014
, ZHANG Min-min2, CUI Li1, ZHAO Zhi-guo1, WANG Dai-jie1, YAN Hui-jiao1, GENG Yan-ling1, ZHAO Heng-qiang1
, WANG Xiao1
2. College of Life Science, Shandong Normal University, Jinan 250014, China
金银花Lonicerae Japonicae Flos为忍冬科忍冬属植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或初开的花[1]。其味甘、性寒，归肺、心、胃经，具有清热解毒、疏散风热的功能[2]。金银花及相关中成药在清热解毒、抗病毒等方面疗效显著，在临床上得到广泛应用[3-4]。环烯醚萜苷是金银花中的一类重要化学成分[5-6]。近年来研究发现，环烯醚萜苷类成分具有抗病毒、抗菌、抗氧化、保肝利胆、抗肿瘤、抗炎、增强免疫等多种活性[6-7]。《中国药典》2015年版仅以绿原酸和木犀草苷作为金银花药材的质量控制指标[2]，对环烯醚萜苷类成分的定量测定和限量标准未做说明。开展金银花药材及相关中成药中环烯醚萜苷类成分的高效提取和分析方法研究，对进一步研究其作用机制、建立质量标准，提高药材及相关成药质量控制水平，指导临床应用具有重要意义。
金银花中所含化学成分种类较多、极性差异大，包含黄酮、有机酸、环烯醚萜苷、皂苷等多种化学成分；同时，金银花提取物中还存在色素、糖等干扰成分，基质复杂。而含有金银花的相关中成药中所含中药种类更多，且加工过程中药用辅料的使用，造成其化学成分更为复杂。环烯醚萜苷类化合物在金银花中属于量相对较低且极性较强的一类成分，采用单一的回流或超声提取技术易造成提取物组成复杂，分离难度大。因此，结合环烯醚萜苷类成分的结构特点，发展适合金银花药材及其相关成药中环烯醚萜苷类成分的快速、高效的提取、净化和分析方法亟待解决。
分散固相萃取（dispersive solid-phase extraction，DSPE）法是美国农业部于2003年提出的一种用于食品样品中多种类、多残留农药快速提取和净化的一种样品前处理技术[8]。该技术将固相萃取吸附剂分散在样品的提取液中，可以有效去除样品中杂质，达到净化效果[9]，具有回收率高、前处理时间短、溶剂用量少、操作简便、装置简单，所需空间小等优点[10]。目前，DSPE法在食品安全[10-15]、环境分析[16]、生物分析[17-18]等领域得到广泛应用，但在中药、中成药等复杂样品分析中的应用鲜有报道。
本研究发展了一种基于DSPE技术的金银花药材及其相关中成药连花清瘟胶囊（LQC）中环烯醚萜苷类成分的提取、净化和分析技术，为中药中环烯醚萜苷类成分的提取、纯化和分析研究提供方法和技术支持。
1 仪器与材料Agilent 1260型高效液相色谱仪，配有四元梯度泵，DAD检测器，自动进样器等，美国Agilent公司；KQ2400KDE型高功率数控超声波仪，昆山市超声仪器有限公司；R201型旋转蒸发仪，上海申生科技有限公司；BSA1245-CW型精密天平，德国Sartorius公司；Milli-Q（18.2 MΩ）超纯水处理系统，美国Millipore公司。
甲醇（色谱纯）购于美国Tedia公司；乙腈（色谱纯）购于德国Merck公司；甲酸（色谱纯）购于德国Riedel公司；其余试剂均为分析纯，实验用水为Milli-Q超纯水（18.2 MΩ）。硅藻土（分析纯）购置于天津大茂化学试剂厂；弗洛里硅土（60～100目，色谱用）、聚酰胺（30～60目，柱色谱）、中性氧化铝（100～200目，色谱用）、碱性氧化铝（100～200目，色谱用）均购于国药集团化学试剂有限公司。本实验所采用的金银花药材（忍冬科忍冬属植物忍冬Lonicera japonica Thunb.）及LQC（批号130844、130911、130847，石家庄以岭药业股份有限公司）均购于山东省济南市漱玉平民大药房，经山东省分析测试中心王晓研究员鉴定。6种环烯醚萜苷化合物对照品（马钱酸、莫诺苷、马钱苷、当药苷、断氧化马钱子苷、开联番木鳖苷二甲基乙缩醛）均由实验室分离制备，结构经过波谱数据鉴定，峰面积归一化法质量分数均大于98%。
2 方法与结果 2.1 金银花中环烯醚萜苷的提取条件优化DSPE法分为提取和净化2个环节，本研究分别对2个环节的主要参数进行优化。超声提取技术具有高效、快速、使用方便等特点，本研究采用超声提取技术用于金银花药材中环烯醚萜苷的提取，并对提取条件进行了考察。
提取溶剂、提取时间和料液比是影响超声提取效率的关键因素。考察了不同超声提取条件（提取溶剂：30%、50%、70%、90%乙醇；提取时间：5、10、15、20、25 min；料液比：1:25、1:50、1:100、1:150）对各环烯醚萜苷类成分质量分数的影响。从表 1中可以看出，采用50%乙醇作为提取溶剂时，金银花中各环烯醚萜苷类成分质量分数较高。增加提取时间，各环烯醚萜苷类成分质量分数有增加趋势，当提取时间超过15 min时，质量分数逐渐降低，这可能是由于长时间的超声条件下，环烯醚萜苷类成分会发生分解或转化，因此选择提取时间为15 min。增加料液比有利于活性成分的提取，但同时会消耗大量的试剂，综合考虑，本研究选择1:100作为金银花中环烯醚萜苷类成分超声提取的料液比。
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表 1 提取溶剂、时间和料液比对金银花中环烯醚萜苷的影响 Table 1 Effect of extraction solvents, extracting time, and ratio of material to solvent on iridoid glycosides in LJF |
2.2 金银花中环烯醚萜苷类成分的净化条件优化 2.2.1 净化剂类型
净化剂类型是影响DSPE的重要参数，考察了不同类型净化剂（如弗洛里硅土、聚酰胺、中性氧化铝、碱性氧化铝、硅藻土）对金银花提取物的净化效果（表 2）。结果表明，采用硅藻土作为净化剂时各目标成分质量分数较高，样品溶液颜色较浅，因此选择硅藻土用于进一步研究。
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表 2 不同净化条件下各化合物质量分数对比 Table 2 Contrast of mass fraction for each compound in different cleaning conditions |
2.2.2 净化剂用量
增加净化剂的用量可以减少色素、基质及其他共存成分对目标物的影响，但同时也可能会对目标物产生一定的吸附。本研究考察了净化剂用量（10、30、50、100、150 mg）对提取率的影响（表 2），结果表明，各目标成分质量分数随着净化剂用量增加呈现出各具特色的变化趋势，但当净化剂用量为100 mg时，各目标成分质量分数均相对较高，因此，选择净化剂用量为100 mg用于后续研究。
2.2.3 净化时间在优化的净化剂类型和用量条件下，进一步考察了净化时间（0.5、1、2、5、10、30 min）对各目标成分测定结果的影响（表 2）。从表中可以看出，随着净化时间增加，各环烯醚萜苷类成分质量分数有降低趋势。为了保证净化效果，同时又不损失目标峰回收率，本研究选择净化时间为1 min。
2.3 金银花供试品溶液制备综合上述实验，可以确定金银花中环烯醚萜苷的提取净化方法，具体如下：准确称取粉碎并过20～40目筛的金银花药材0.3 g置于三角烧瓶中，加入50%乙醇30 mL，超声提取15 min，取2 mL上清液，加净化剂硅藻土100 mg，涡流振荡1 min，过0.22μm滤膜后，取3μL供HPLC分析。
2.4 LQC中环烯醚萜苷类成分的提取条件优化环烯醚萜苷类成分是一类极性较强的成分，考虑到中成药中存在多种类型化学成分，极性差异大，采用单一的净化剂难以实现中成药中环烯醚萜苷类成分的净化和富集。
在前期实验基础上，考察了混合净化剂对中成药中环烯醚萜苷类成分的提取和富集效果：硅藻土、硅藻土-活性炭（90:10）、硅藻土-活性炭（80:20）、硅藻土-活性炭（50:50）（表 3）。结果表明，当采用硅藻土-活性炭（80:20）时，多数环烯醚萜苷类成分占总峰面积百分含量相对较高（表 3），富集效果较好。进一步考察了净化剂用量（10、30、50、100、150 mg）和净化时间（0.5、1、2、5、10、30 min）的影响，结果表明，采用100 mg净化剂提取净化1 min时，各环烯醚萜苷类成分富集净化效果较好，可用于进一步研究。
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表 3 净化剂类型的影响 Table 3 Effect of purifing agent types |
2.5 LQC供试品溶液制备
综合上述实验，可以确定LQC中环烯醚萜苷的提取净化条件，具体如下：准确称取1.0 g LQC样品置于三角烧瓶中，加入50%乙醇40 mL，提取1 min，取2 mL上清液，加净化剂硅藻土-活性炭（80:20）100 mg，涡流振荡1 min，过0.22μm滤膜后，取3μL供HPLC分析。
2.6 对照品溶液的制备分别精密称取马钱酸、莫诺苷、马钱苷、当药苷、断氧化马钱子苷、开联番木鳖苷二甲基乙缩醛对照品适量置10 mL棕色量瓶中，加50%甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为333.33、333.33、366.67、300.00、333.33、333.33μg/mL混合储备液。使用时，按一定比例稀释制成标准溶液（具体稀释倍数分别为2、4、20、40、200、400、2 000倍），待用。
2.7 色谱条件Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流动相为0.4%甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脱程序：0～15 min，10%～14%乙腈；15～35 min，14%～25%乙腈；35～45 min，25%～50%乙腈；45～50 min，50%～100%乙腈；50～65 min，100%乙腈；检测波长240 nm；体积流量0.8 mL/min；进样量3μL；柱温25℃。在本研究优化的色谱条件下金银花及其中成药中环烯醚萜苷类成分的色谱图如图 1所示。
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图 1 混合对照品(A)、金银花提取物(B)、LQC提取物(C)的HPLC-DAD图 Fig.1 HPLC-DAD of mixed reference substances (A), extract of LJF (B), and extract of LQC (C) |
2.8 方法学考察
按“2.7”色谱条件进样分析，测定各不同质量浓度的混合对照品溶液中各化合物的峰面积，以各化合物质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，并求得回归方程（表 4）。将标准溶液稀释至低浓度进样，以3倍信噪比计算各成分的检测限，以10倍信噪比计算定量限，结果见表 4[11-14]。
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表 4 HPLC-DAD分析环烯醚萜苷类成分的回归方程、线性范围及检测限、定量限 Table 4 Regression curves, linear range, and detection and quantitation limits of iridoid glycosides determined by HPLC-DAD |
在本研究优化的色谱条件下，以金银花提取物中各环烯醚萜苷类成分的保留时间和峰面积为考察指标，对该分析方法的精密度、重复性、稳定性和加标回收率分别进行了考察[11-14]。精密度试验结果表明各环烯醚萜苷类成分保留时间的RSD值均低于0.95%，峰面积的RSD值均低于1.51%，结果表明仪器精密度良好。6次重复性试验结果表明，各环烯醚萜苷类成分保留时间的RSD值均低于1.23%，峰面积的RSD值均低于4.21%，结果表明该方法的重复性良好。24 h内稳定性试验表明，各环烯醚萜苷类成分保留时间的RSD值在0.08%～0.65%，峰面积的RSD值在0.85%～1.74%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。精密称取已知各目标化合物量的金银花样品0.30 g，分别准确加入对照品适量，按照供试品溶液制备方法处理6份，按“2.7”项色谱条件进样分析，测定各目标化合物峰面积，计算平均加样回收率，结果表明，各目标成分加标回收率在90.5%～102.1%，RSD值在0.67%～2.27%。以上数据说明，该方法具有较好的精密度、稳定性和重现性，可以用于金银花中环烯醚萜苷类成分的准确测定。
采用相同的方法对HPLC法测定LQC中环烯醚萜苷的方法学进行了考察。精密度试验表明，各环烯醚萜苷类成分保留时间的RSD值在0.45%～0.87%，峰面积的RSD值在0.71%～1.68%。重复性试验表明，各环烯醚萜苷类成分保留时间的RSD值均低于0.91%，峰面积的RSD值均低于3.93%。24 h内稳定性试验表明，各环烯醚萜苷类成分保留时间的RSD值均低于0.95%，峰面积的RSD值均低于3.67%。加样回收率试验表明，各环烯醚萜苷类成分加样回收率在92.7%～98.5%，RSD值在0.85%～1.91%。
2.9 样品测定分别采用“2.3”和“2.5”项样品溶液制备方法制备样品溶液，采用“2.7”项色谱条件分别进样分析，获得3批金银花和3批LQC样品中环烯醚萜苷类成分的色谱峰面积，将测得结果带入表 4线性回归方程，计算金银花和LQC中环烯醚萜苷类成分的量（表 5）。从表 5可以看出，金银花中6种环烯醚萜苷类成分总量在1 269.22～2 135.48μg/g，总量平均值为1 683.72μg/g；其中，质量分数较高的成分主要是马钱酸、当药苷和断氧化马钱子苷，其质量分数平均值分别为460.86、406.89、594.88μg/g。
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表 5 样品中环烯醚萜苷的测定结果(n=3) Table 5 Contents of iridoid glycosides of samples (n=3) |
LQC中6种环烯醚萜苷类成分的总质量分数在1 147.97～1 327.68μg/g，总量平均值为1 219.65μg/g；其中，质量分数较高的成分主要是马钱酸、当药苷和断氧化马钱子苷，其质量分数平均值分别为461.49、229.26、335.93μg/g。
3 讨论金银花中多种类型化学成分共存，色谱条件的优化对实现环烯醚萜苷类化合物的成功分析显得尤为重要。本研究考察了4根不同类型色谱柱Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5μm），Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5μm），Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5μm），Waters XSELECTTM HSS T3（150 mm×3.0 mm，3.5μm）的分析效果。结果表明，采用Kromasil C18色谱柱时，金银花及方剂提取物中各环烯醚萜苷类成分分离度高、峰形较好，可用于进一步分析研究。对比了甲醇-水和乙腈-水作为流动相时的洗脱效果，结果表明，采用乙腈-水作为流动相，梯度洗脱时各环烯醚萜苷类成分分离较好。
由于环烯醚萜苷类成分含有多羟基，可与色谱柱残留硅羟基反应造成色谱峰拖尾现象，考察了水相中加入不同体积分数（0.2%、0.4%、0.6%）甲酸对峰形的影响，结果表明，当水相中加入0.4%甲酸时，各环烯醚萜苷类成分峰形对称性较好，可以用于进一步分离研究。经二极管阵列检测器考察各环烯醚萜苷类成分在不同波长（190～640 nm）下的紫外吸收波长，结果表明，在240 nm下各环烯醚萜苷类成分具有最大吸收，且各化合物具有较好的分离度和灵敏度，因此选择240 nm作为环烯醚萜苷类成分的检测波长。
本研究建立了DSPE-HPLC法提取、净化和测定金银花及相关方剂中环烯醚萜苷类成分的方法。该方法操作简单、样品净化效果好，可减少复杂基质和多成分中药提取物色谱分离难度，避免死吸附现象发生，且目标物回收率较高。用于金银花及LQC中环烯醚萜苷类成分的提取和分析研究，效果较好。研究结果为中药及方剂等复杂基质中化学成分的提取、净化和分析研究提供了新思路，并拓展了DSPE技术在中药、中成药等复杂基质样品分析及质量控制中的应用。
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