2016, Vol. 47
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.14.017 |
甘遂Kansui Radix为大戟科（Euphorbiaceae）植物甘遂Euphorbia kansui T. N. Liouex T. P. Wang的干燥块根[1]，其性苦、寒，有毒，具泻水逐饮、消肿散结功效。中医临床历代均采用醋制法降低其毒性，缓和其峻猛之药性。本实验室前期研究表明，与生甘遂比较，醋甘遂对正常大鼠肝、胃、肠的毒性降低[2-3]。同时与癌性腹水模型大鼠比较，醋甘遂对大鼠的肝、胃、肠毒性显著降低，表现为“有故无殒”[4]。然而，甘遂醋制前后泻水逐饮活性是否存在差异尚缺少深入研究，故本实验以癌性腹水模型大鼠为研究对象，从尿量，腹水量，尿钠、钾、氯离子水平，尿液pH值及肾素-血管紧张素II-醛固酮系统（RAAS）、抗利尿激素（ADH）方面考察生、醋甘遂粉末及其醇提加水提物泻水逐饮功效的差异，以期为甘遂临床的合理应用提供依据。
1 材料 1.1 仪器及试剂TDZ4-WS台式低速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；全自动酶标仪（美国Bio-Red公司）；羧甲基纤维素钠（CMC-Na，上海久亿化学试剂有限公司）；水合氯醛（Kermel）；氯化钠（国药集团化学试剂有限公司）；呋塞米片（上海朝晖药业有限公司，批号H31021074）；钠离子、钾离子、氯离子、肾素（PRA）、血管紧张素II（Ang II）、醛固酮（ALD）、ADH试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所。
1.2 药材甘遂药材购自陕西省宝鸡市眉县，经南京中医药大学唐于平教授鉴定为大戟科植物甘遂Euphorbia kansui T. N. Liouex T. P. Wang的干燥块根。
1.3 动物与细胞雄性SD大鼠，SPF级，体质量（230±20）g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，动物许可证号SCXK（浙）2014-0001。Walker-256大鼠腹水癌细胞株（乳腺癌细胞）购自上海拜力生物科技有限公司。
2 方法 2.1 生、醋甘遂粉末及醇提加水提物的制备 2.1.1 生甘遂粉末的制备生甘遂打粉过4号筛，备用。HPLC-UV、UPLC-TQ-MS测定含大戟醇1.689 mg/g、3-O-(2′E,4′Z-癸二烯酰基)-20-O-乙酰基巨大戟二萜醇30.15 μg/g、甘遂萜酯A 15.17 μg/g。
2.1.2 醋甘遂粉末的制备将所购甘遂生品按照《中国药典》2015年版一部附录II D醋炙法加醋拌匀闷透，待醋被吸尽后，炒锅加热至260 ℃左右，翻炒9 min至颜色加深，略有焦斑，出锅放凉。每100 kg甘遂用醋30 kg。打粉过4号筛备用，含大戟醇1.462 mg/g、3-O-(2′E,4′Z-癸二烯酰基)-20-O-乙酰基巨大戟二萜醇16.40 μg/g、甘遂萜酯A 12.74 μg/g。
2.1.3 生、醋甘遂醇提加水提物的制备称取适量生、醋甘遂粉末（过4号筛），加10倍量95%乙醇回流提取2次，每次2 h，趁热滤过，残渣加10倍量的水加热回流2次，每次2 h，趁热滤过，合并4次滤液并浓缩至浸膏。生品浸膏含大戟醇1.562 mg/g、3-O-(2′E,4′Z-癸二烯酰基)-20-O-乙酰基巨大戟二萜醇21.20 μg/g、甘遂萜酯A 8.423 μg/g；醋品浸膏含大戟醇1.406 mg/g、3-O-(2′E,4′Z-癸二烯酰基)-20-O-乙酰基巨大戟二萜醇1.17 μg/g、甘遂萜酯A 3.321 μg/g。
生、醋甘遂粉末及浸膏临用前加0.5% CMC-Na溶解并稀释至34 mg/mL（均按生药量计算）。
2.2 分组、造模及给药将SD大鼠置于室温、通风的清洁级动物室中，自由摄食饮水，适应3 d后，仿Aston[5]利尿筛选法筛选符合标准的大鼠，进入正式实验。取合格SD大鼠56只，按体质量随机分为7组，每组8只，分别为对照组、模型组、阳性药（呋塞米片加0.5% CMC-Na制成0.42 mg/mL的药液，剂量为4.2 mg/kg）组、生甘遂粉末组、醋甘遂粉末组、生甘遂提取物组、醋甘遂提取物组，甘遂各药物组剂量均为340 mg/kg（生药计）。
将冻存的Walker-256细胞株37 ℃复苏呈液态，1 000 r/min离心5 min，沉淀用生理盐水悬浮至细胞密度1.2×108/mL，每只大鼠注射1 mL，进行传代，将传代后的腹水抽出进行细胞计数，用生理盐水稀释至细胞密度1×107/mL，再给除对照组外的其余大鼠进行ip接种，每只大鼠ip 1 mL，复制癌性腹水模型。造模次日开始给药。对照组、模型组ig给予0.5% CMC-Na，其余各组ig给予相应剂量药液，给药体积10 mL/kg，每日1次，连续7 d。
2.3 大体观察给药后观察大鼠精神状态、行为活动、皮肤毛色、饮食状况、二便情况、死亡情况。
2.4 指标检测 2.4.1 对大鼠尿量，腹水量，尿钠、钾、氯离子水平及尿pH值的影响第4天给药后，将大鼠置于代谢笼中，禁食不禁水，收集24 h尿液，测量尿液体积，测定尿液中钠、钾、氯离子水平及pH值。末次给药1 h后，取腹水，通过计算取腹水前后大鼠体质量的差值间接测量腹水量。
2.4.2 对大鼠血清PRA、Ang II、ALD、ADH水平的影响第7天给药1 h后颈总动脉取血，静置30 min后，3 500 r/min离心10 min，取上清液备用。血清PRA、Ang II、ALD、ADH测定按照试剂盒说明完成。
2.5 数据分析实验数据采用SPSS 19.0软件进行统计分析，各组定量检测数据以x±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差（One-Way ANOVA）分析，组间比较采用LSD检验。数据方差不齐，不满足t检验条件时，采用Wilcoxon秩和检验。
3 结果 3.1 对大鼠一般情况的影响实验过程中无大鼠死亡。对照组大鼠精神状态良好，毛发光泽，行动敏捷，二便正常。模型组大鼠精神萎靡，眼神黯淡，毛发无光泽，耸毛，蜷缩，腹部胀大。各给药组大鼠眼无神，毛色发黄，腹部肿胀，与模型组比较，症状有所减轻。
3.2 对大鼠尿量及腹水量的影响与对照组比较，模型组大鼠尿量显著减少（P＜0.01），生成腹水。与模型组比较，各给药组大鼠尿量均显著增加（P＜0.01），腹水量不同程度地减少（P＜0.05、0.01）。其中生甘遂粉末组和醋甘遂粉末组功效最为明显，且两组间无显著性差异。实验结果见表 1。
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表 1 各组大鼠尿量及腹水量比较 (x±s, n = 8) Table 1 Comparison on volume of urine and ascites of rats in each group (x±s, n = 8) |
3.3 对大鼠尿钠、钾、氯离子及尿液pH值的影响
与对照组比较，模型组大鼠尿钠、钾、氯离子水平及尿pH值显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，各给药组大鼠尿钠、钾、氯离子水平及尿pH值均显著降低（P＜0.01），其中生甘遂粉末组和醋甘遂粉末组作用最为显著，且两组间无显著性差异。实验结果见表 2。
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表 2 各组大鼠尿钠、钾、氯离子及尿pH值的比较 (x±s, n = 8) Table 2 Comparison on urinary sodium,potassium,chloride ion,and pH value of rats in each group (x±s, n = 8) |
3.4 对大鼠血清PRA、Ang II、ALD、ADH水平的影响
与对照组比较，模型组大鼠血清中PRA、Ang II、ALD、ADH水平均显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，各给药组大鼠血清PRA、Ang II、ALD、ADH水平均显著降低（P＜0.05、0.01）。其中生甘遂粉末组和醋甘遂粉末组作用最为显著，且两组间无显著性差异。实验结果见表 3。
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表 3 各组大鼠血清PRA、Ang II、ALD、ADH水平比较 (x±s, n = 8) Table 3 Comparison on PRA,Ang II,ALD,and ADH in serum of rats in each group (x±s, n = 8) |
4 讨论
癌性腹水又称恶性腹腔积液，属于中医“臌胀”范畴。《灵枢·水胀》曰：“鼓胀如何？腹胀，身皆大，大与肤胀等也。”临床以腹大胀满，皮急如鼓为主要特征，为中医四大顽证之一。患者大量生成的腹水可压迫肾脏致少尿症状，使体液电解质紊乱，尿液酸碱失衡。肾的球旁细胞感受钠量减少的刺激，致入球小动脉压力感受器分泌肾素增加，催化血管紧张素原生成血管紧张素I、II[6]，刺激肾上腺皮质球状带分泌ALD，致肾脏集合管对水的通透性增强[6-8]，细胞外液容量增多，引起下丘脑视上核和室旁核神经细胞分泌ADH增多，远曲小管和集合管重吸收水分增多[8]，尿量排出减少，水液停留体内而加重水肿。腹水往往引起各种并发症，如肾衰竭、肝肾综合征等，严重影响患者生活质量和增加死亡率，其现代治疗常采用服用利尿剂、补充白蛋白、排放腹水、腹水回输、TIPS（经颈静脉肝内门体分流）技术等手段，但不良反应多，远期疗效不理想。
甘遂泻水逐饮作用峻猛，可使体内滞留水液随二便排出，治疗腹水效果显著。但其具明确的肝、胃肠毒性，对皮肤、黏膜亦具有严重的刺激作用，易引起黏膜炎症、充血[9]，剂量不当时易产生腹泻、脱水、昏迷等中毒症状。中医历来采用醋制以降低甘遂毒性，缓和其峻猛之效，可显著缓解药物对黏膜的强烈刺激[10]，减轻恶心、呕吐等副反应。但目前对生、醋甘遂药效的比较鲜有报道，醋制降低毒性的同时泻水逐饮功效如何变化亦不明确。甘遂醋制前后药效差异研究的缺失，使得近代医生因不知其醋制减毒后是否仍有斩夺之功，多慑于其毒性，畏其峻利而弃用，限制了甘遂的临床应用。
本实验室前期研究发现，醋甘遂粉末及其醇提加水提物在340 mg/kg（按生药量计算）剂量下对癌性腹水模型大鼠泻水逐饮功效显著[11]，故本实验选用该剂量。本实验中，各给药组较模型组大鼠有不同程度腹水量减少，尿量增加的趋势，尿中钠、钾、氯离子水平和尿液pH值均趋于正常，血清PRA、AngII、ALD、ADH水平也有不同程度的降低。提示生、醋甘遂粉末及提取物均具一定的利尿作用，可不同程度抑制腹水产生，减轻机体电解质紊乱、体液酸碱失衡的症状，并对RAAS及ALD有一定调节作用。可见，生、醋甘遂粉末及其提取物均有显著的泻水逐饮之效，对癌性腹水大鼠模型均有良好的治疗改善作用。其中生、醋甘遂粉末组效果最佳，且两组间无显著性差异，推测甘遂醋制毒性显著降低的同时，其泻水逐饮功效得以保留，表现为“减毒存效”，也从一定层面上验证了甘遂临床用药多醋制的合理性。
甘遂主要含巨大戟烷型二萜、假白榄烷型二萜及三萜等成分[12]，其中巨大戟烷型二萜类和含有8-烯-7-酮结构的三萜类成分为其主要毒性成分[13]。甘遂醋制后萜类成分水平降低[14-15]，并产生新的成分[16]，同时其泻水逐饮功效得以保留[11]，推测可能与其毒性成分在醋制过程中结构发生转化有关。后续将在本实验基础上深入考察生、醋甘遂的成分差异，以期揭示甘遂醋制“减毒存效”的内在本质，为甘遂临床安全、有效应用提供依据。
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