鱼腥草为三白草科植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb.的新鲜全草或干燥地上部分。百部还魂为同科植物裸蒴Gymnotheca chinensis Decne.的全草或叶。两者功效和主治均不相同，但由于分布相同，常混生，形态相似，因此极易误采误用^[1]；鱼腥草与百部还魂的鉴别可从原植物的形态与显微特征等传统手段进行。但是对于干燥或经过加工的样品，传统方法进行准确鉴别具有难度。而利用化学成分的分析进行鉴定，则非常繁琐复杂，且当二者有混杂时，难以判断。因此急需建立二者间的快速鉴定方法。由于叶绿体DNA较核基因组DNA具有更高的拷贝数，在植物相关产品中更为稳定，本研究分析了来源于不同居群的鱼腥草与百部还魂的叶绿体DNA matK区的SNP，获得相互鉴别稳定的SNP位点，基于这些位点设计相互鉴别的特异引物，并利用这些特异引物分别建立了特异扩增鱼腥草与百部还魂的PCR体系。在PCR产物中加入SYBR Green I染料对真伪结果可进行快速检测。结合DNA快速提取技术，可大大提高检测效率，从而建立便捷的2种药材的鉴定方法。为了进一步实验同时对受试样品进行阳性检测，可帮助判断受试样品具有相互混杂，本研究进一步建立多重PCR体系，可进行快速、有效、稳定地鉴定鱼腥草与百部还魂，以监控这些产品的质量。

5332PCR仪（Eppendorf），DYY-12电泳系统（北京市六一仪器厂），凝胶成像分析仪（BIO-RAD ChemiDoc XRS），5810R低温冷冻离心机（Eppendorf），微量移液器（Eppendorf），ZF-7A型手持式紫外灯（Eppendorf）。

琼脂糖（Promega公司），Goldview（北京索莱宝科技有限公司），TransStart TopTaq DNA Polymerase（北京全式金公司），1 000 SYBR Green I染料（Invitrogen公司）。样品由福建中医药大学陈建雄教授鉴定并收集不同产地的样品为鱼腥草Houttuynia cordata Thunb和百部还魂Gymnotheca chinensis Decne.，具体信息见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 材料信息 Table 1 Basic information of materials 编号 物种 产地 1 鱼腥草Houttuynia cordata 福建建阳 2 鱼腥草Houttuynia cordata 福建建阳 3 鱼腥草Houttuynia cordata 福建南平 4 鱼腥草Houttuynia cordata 广东揭阳 5 鱼腥草Houttuynia cordata 广东河源 6 鱼腥草Houttuynia cordata 广西百色 7 鱼腥草Houttuynia cordata 湖北宜昌 8 鱼腥草Houttuynia cordata 湖北宜昌 9 百部还魂Gymnotheca chinensis 广东河源 10 百部还魂Gymnotheca chinensis 广东河源 11 百部还魂Gymnotheca chinensis 广西百色 12 百部还魂Gymnotheca chinensis 广西百色 13 百部还魂Gymnotheca chinensis 广西河池 14 百部还魂Gymnotheca chinensis 广西崇左 15 百部还魂Gymnotheca chinensis 湖北宜昌 16 百部还魂Gymnotheca chinensis 湖北宜昌

表 1 材料信息 Table 1 Basic information of materials

干燥样品采用碱裂解法进行基因组DNA的提取^[2]，所提DNA稀释20～100倍后作为PCR模版，进行后续实验检测。

扩增序列的通用反应体系：总体积20μL，其中包括Taq酶1 U，10×buffer缓冲液2.0μL，dNTP 20 nmol，2μmoL/L引物各2μL，灭菌蒸馏水补足20μL。PCR反应程序：94℃预变性3 min后，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环后72℃延伸7 min。获得PCR产物通过1.2%琼脂糖凝胶电泳，并用Goldview染色观察。

对所获得的PCR产物进行测序，获得16条序列；用ClustalX 2.1软件对所有序列进行多重比对，筛选鱼腥草与百部还魂的特异位点，根据特异引物设计的优化原则，通过特异位点设计鱼腥草与百部还魂的相互鉴别的特异引物。

分别利用鱼腥草及百部还魂的特异性引物HcF、GcF与通用引物反向HgR构建2个PCR体系，反应体系同上，应用TopTaq DNA聚合酶热反应体系，通过设置退火温度梯度（50.0、50.5、51.6、53.2、55.1、56.7、57.6、58.0℃）考察不同退火温度对特异性PCR扩增稳定性的影响。为了建立更加简便的检测方法，在20μL PCR产物中加入2μL SYBR Green I染料于365 nm紫外波长下检测荧光。

利用鱼腥草及百部还魂的特异性引物HcF、GcF与通用反向引物HgR构建一个多重PCR体系，除了特异引物HcF、GcF的浓度减半，其余反应体系同上，应用TopTaq DNA聚合酶热反应体系，通过设置退火温度梯度（50.0、50.5、51.6、53.2、55.1、56.7、57.6、58.0℃）考察不同退火温度对多重PCR扩增稳定性的影响。利用所构建的多重PCR体系，选择最合适退火温度对候选样品进行多重PCR扩增检测，循环数设置30个循环。

经测序，获得鱼腥草与百部还魂样品936 bp的matK序列，用ClustalX 2.1软件对所有序列进行多重比对，筛选获得鱼腥草、百部还魂的特异位点，发现在该936 bp的序列区中，位于该序列第654～678位点间有多个SNP位点及第371～372位点间有2个SNP位点，根据第654～678位点间的SNP位点设计鱼腥草的鉴别引物HcF，为了提高该引物的特异性，在其3’端倒数第2个碱基有C转换成G。另外根据第371～372位点间有2个SNP位点设计百部还魂特异的鉴别引物GcF，同时设计这2个特异引物的共同反向引物HgR。（图 1和表 2）。

图 1 鱼腥草与百部还魂鉴别方法示意图 Fig.1 Theory for authentication of H. cordata and G. chinensis

表 2(Table 2)

表 2 所用引物 Table 2 Primers in this paper 名称 序列(5’→3’) matkF CGATCTATTCATTCAATATTTC matkR TCTAGCACACGAAAGTCGAAGT HcF AAGGAGTAACATGCTAGAGAACTGG GcF TGTCAGATATCAAGGAAAATCTA HgR CAAATCGCTCCATAATATCAGAATC

表 2 所用引物 Table 2 Primers in this paper

分别利用鱼腥草与百部还魂的特异性引物HcF、GcF与共同的反向引物HgR构建了2个PCR体系，通过退火温度梯度实验，分析退火温度对PCR反应效率的影响，结果显示，这2个反应体系在退火温度50～58℃条件下均能扩增出鱼腥草185 bp的特异鉴别条带，百部还魂389 bp的特异鉴别条带。

选择退火温度52℃，使用以上建立的反应体系，分别对来源于不同居群的鱼腥草、百部还魂样品进行鉴别，受试8个鱼腥草样品，8个百部还魂样品分别检测到相应的阳性特异性条带（图 2、3），而阴性样品则扩增不到条带。表明该体系具有特异性，可以直接鉴别鱼腥草和百部还魂样品。

图 2 185 bp条带特异性PCR鉴别鱼腥草与百部还魂凝胶电泳 Fig.2 Amplification of H. cordata and G. chinensis in 185 bp strip

图 3 389 bp条带特异性PCR鉴别鱼腥草与百部还魂凝胶电泳 Fig.3 Amplification of H. cordata and G. chinensis in 389bp strip

为了建立更加简便的检测方法，在20μL PCR产物中加入2μL SYBR Green I染料于365 nm紫外波长下检测荧光，2个特异引物扩增体系所检测的阳性样品均可发出荧光，而阴性样品均未见荧光。表明该方法可更简便对受试样品进行鉴别。

为了同时鉴别鱼腥草与百部还魂的阳性样品，用于检测受试样品是否相互混杂，本研究进一步建立多重PCR体系。利用鱼腥草与百部还魂的特异性引物HcF、GcF与共同的反向引物HgR构建多重PCR体系，通过退火温度梯度实验，分析退火温度对PCR反应效率的影响，结果显示，反应体系在退火温度50～54℃条件下均能扩增出鱼腥草185 bp的特异性鉴别条带，百部还魂389 bp的特异性片段。

选择退火温度52℃，使用以上建立的多重PCR体系，对1～8号鱼腥草样品、百部还魂样品以及由1号鱼腥草样品与9号百部还魂样品的混合样品进行鉴别，受试8个鱼腥草样品（1～8），7个百部还魂样品（9～15）分别检测到相应的阳性特异性条带，同时1个混杂样品（16）可同时扩增到2个阳性特异性条带，显示所建立多重PCR体系，可用于检测鱼腥草与百部还魂及其混杂品（图 4）。

图 4 多重PCR鉴别鱼腥草与百部还魂凝胶电泳 Fig.4 Amplification of H. cordata and G. chinensis

近年来，基于SNP位点的特异PCR方法为解决药材的鉴别问题提供了有效的手段。位点特异性PCR方法已成功应用于人参、金银花、陈皮等中药材的真伪鉴别^[3-4]。经典PCR检测方法，需经过制胶、凝胶、电泳与成像等多个步骤，检测比较繁琐，本研究建立了更加快速简便的检测体系。

已有报道^[5-6]多见利用单一特异性位点进行药材的辨别，而这种方法不能同时对正品与混杂品进行阳性鉴定，因此，通过构建多重PCR对中药材真伪鉴别中的应用越来越受重视。本实验中，在基于特异差异位点的基础上，在引物的3’端主动引入个别错配的突变，可进一步提高引物的鉴别特异性。本研究为了同时对鱼腥草与百部还魂及其混杂品进行阳性鉴定，设计双位点特异性引物，构建多重PCR进行两种药材的快速鉴别，可一次同时对2种样品进行阳性鉴定，并可判断其是否相互混杂。该技术的前提是双个特异位点的筛选。本研究在多重PCR体系的优化实验中发现，引物浓度与退火问题均较低于普通特异PCR的效果较佳。另外，不同活性的Taq DNA聚合酶的应用对多重PCR具有重要影响，利用适合于热启动的Taq DNA聚合酶可以提高成功率。

本研究建立了特异PCR方法，可用于鱼腥草与百部还魂植物及其药材的简便鉴别，且建立的多重PCR方法通过单次PCR即可对2种样品进行阳性鉴定，可用于判断是否相互混杂，将为今后有关鱼腥草与百部还魂的相互鉴别提供思路。由于两者的功效和主治均不相同，本实验也对防止药材混用误用具有实际应用价值。