马齿苋Portulacae Herba为马齿苋科(Portulacaceae)马齿苋属Portulaca L. 1年生肉质草本植物马齿苋Portulaca oleracea L. 的全草，味酸、性寒，归大肠、肝经，具有清热解毒、凉血止痢之功效^[1]。马齿苋始载于《本草经集注》，又名马齿菜、蚂蚱菜、长寿菜、五行草、瓜子菜、麻绳菜等，是我国卫生部划定的78种药食同源植物之一^[2-3]。马齿苋中富含去甲肾上腺素、α-不饱和脂肪酸、β-胡萝卜素、黄酮类、香豆素、单萜糖苷类、生物碱及多糖等化学成分^[4-5]。研究表明，多糖是马齿苋的主要活性成分，具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、清除自由基、调血脂、降血糖及增强免疫力等多种药理活性^[6-8]。

膜分离技术(membrane separation technology，MST)是一项新型的高效分离技术，目前已被广泛的应用于医药、食品、化工及环保等各个领域。MST以选择性透过膜为分离递质，当两侧存在一定电位差、浓度差或者压力差时，原料一侧的组分就会选择性地透过膜^[9-11]，从而实现大、小分子的分离，达到有效成分净化浓缩的目的^[10-12]。其在分离物质过程中不涉及变相，无二次污染，具有生物膜浓缩富集的功能，且操作简便、结构紧凑、易自动化等优点^[13]。

多糖是一类具有优良活性的生物大分子物质，其药效活性与其分子结构和相对分子质量密切相关。MST主要利用相对分子质量的差异达到分离的目的，对多糖的分离纯化有非常重要应用价值。文献报道显示，目前已经应用MST对红松松塔多糖^[14]、马尾藻多糖^[15]、香菇多糖^[16]、白术多糖^[17]、沙枣多糖^[18]及满山香子多糖^[19]等几十种多糖类成分进行了分离纯化，且显示出良好的效果。本实验将传统马齿苋多糖的分离纯化工艺与现代膜分离技术联合，以过膜前后多糖回收率为评价指标，综合评价不同型号的微滤超滤膜对多糖水溶液的适用性，大致确定马齿苋多糖相对分子质量范围，并对纯化精制的多糖进行抗氧化活性研究。

1 仪器与材料

UV-2600/2700紫外可见分光光度计，日本岛津；VaCo5型低温冷冻干燥仪，Zirbus Technology；TGL-20B离心机，上海安亭科学仪器；LNG-CM-101实验室膜分离设备，上海朗级膜分离设备工程有限公司；LNG-HFM-101实验室膜分离设备，上海朗级膜分离设备工程有限公司。

马齿苋干品，购自陕西省药材市场，经陕西中医药大学生药教研室主任王继涛副教授鉴定为马齿苋科马齿苋属植物马齿苋Portulaca oleracea L. 的全草；无水D-葡萄糖对照品(批号110833-201205，质量分数95%～99%)由中国食品药品检定研究院提供。石油醚、95%乙醇、醋酸乙酯、硫酸亚铁购自成都市科龙化工试剂厂；30%过氧化氢、盐酸、三氯乙酸、水杨酸购自天津市天力化学试剂有限公司；浓氨水、浓硫酸、丙酮购自西安三浦化学试剂有限公司；邻苯三酚，天津市科密欧化学试剂有限公司；苯酚，天津市凯信化学工业有限公司；活性炭，重庆茂业化学试剂有限公司；水为蒸馏水；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果 2.1 多糖的测定

精确称取干燥的无水D-葡萄糖对照品20 mg，蒸馏水定容至100 mL，质量浓度为0.2 mg/mL，稀释成0.025、0.050、0.750、0.100、0.150 mg/mL的对照品溶液，分别精密吸取各质量浓度稀释液0.6 mL，加入新制5%苯酚溶液1.2 mL和浓硫酸4 mL，混匀后置于沸水浴中保温30 min，取出冷却至室温。在490 nm处测定吸光度(A)值，以蒸馏水作为空白对照。以多糖质量浓度为横坐标(X)，A值为纵坐标(Y)绘制标准曲线，得回归方程为Y＝5.958 9 X＋0.073 5，R²＝0.995 7，线性范围为0.025～0.150 mg/mL。

2.2 多糖的提取 2.2.1 工艺流程

将马齿苋干品用粉碎机粉碎，用10倍体积石油醚回流脱脂2次，每次2 h，烘干。称取10 g脱脂马齿苋置于圆底烧瓶中，以蒸馏水作为溶剂，按一定浸提温度、浸提时间和浸提次数进行浸提，冷却滤过，合并滤液，离心弃沉淀得上清液，上清液经浓缩后，加入4倍量80%乙醇进行沉淀，静置过夜。离心所得沉淀依次用无水乙醇、丙酮洗涤。加适量蒸馏水溶解沉淀，Sevage试剂(氯仿-正丁醇4：1)除蛋白3次，再加入4倍量80%乙醇沉淀，将沉淀冷冻干燥得马齿苋粗多糖，将粗多糖用膜分离技术进行纯化精制。

2.2.2 多糖提取率的计算

准确称取10 g马齿苋干品粉末，在一定的提取条件下水提醇沉出的粗多糖冷冻干燥，精确称取样品粗多糖0.010 g，定容至100 mL，摇匀，即得样品供试液；精确吸取供试液1 mL，490 nm处测定A值，根据回归方程计算样品中多糖的量。多糖提取率为多糖质量占马齿苋原料质量的百分比。

2.3 单因素试验

参照“2.2.1”项工艺流程，每次称取10 g马齿苋预处理粉末，考察浸提温度、浸提时间和浸提次数对马齿苋多糖提取率的影响。

2.3.1 浸提温度对多糖提取率的影响

在浸提时间2 h，提取2次的条件下，考察不同浸提温度60、70、80、90、100 ℃对马齿苋多糖提取率的影响，结果分别为2.63%、6.63%、6.66%、7.91%、7.67%。可以看出随着温度的升高，多糖提取率也随之提高，但当温度为100 ℃时，多糖提取率下降。

2.3.2 浸提时间对多糖提取率的影响

在浸提温度100 ℃，提取2次的条件下，考察不同浸提时间0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 h对马齿苋多糖提取率的影响，结果分别为3.77%、6.93%、7.67%、9.23%、9.53%。可以看出，随着浸提时间的延长，多糖提取率不断升高，但当浸提时间大于3.0 h，多糖提取率增加幅度降低。

2.3.3 浸提次数对多糖提取率的影响

在浸提温度100 ℃，浸提时间2.0 h条件下，按照浸提次数为1、2、3、4、5次对马齿苋多糖提取率的影响，结果分别为4.43%、7.67%、10.15%、11.17%、10.42%。可以看出随着浸提次数的增加，多糖提取率不断升高，当浸提次数大于4次时，提取率升高幅度接近平稳。

2.4 正交试验

在单因素试验的基础上，以多糖提取率为考察指标，进行3因素3水平L₉(4³) 正交试验，考察浸提温度(A)、浸提时间(B)和浸提次数(C)对多糖提取率的影响，试验设计与结果见表 1，方差分析见表 2。由表 1可知，3个因素对马齿苋多糖提取率的影响依次为浸提次数＞浸提温度＞浸提时间。最优工艺为A₃B₂C₃，即浸提温度100 ℃，浸提时间3.0 h，浸提次数4次。

2.5 脱蛋白实验

Sevage法：取3 g多糖粗粉溶解成25 mL多糖水溶液，按多糖水溶液-氯仿-正丁醇25：24：1的比例充分混合后萃取3次，得上清液醇沉，离心得多糖沉淀，冷冻干燥得纯化后的多糖。

盐酸法：取3 g多糖粗粉溶解成25 mL多糖水溶液，并用2 mol/L盐酸调节pH值3，放置过夜离心取上清液醇沉，冷冻干燥得多糖。

三氯乙酸法：取3 g多糖粗粉溶解成25 mL多糖水溶液，滴加10%三氯乙酸调节pH值3，放置过夜离心取上清液醇沉，冷冻干燥得多糖。

用硫酸-苯酚法测多糖的量。各方法结果见表 3。可以看出3种方法中三氯乙酸法除蛋白含糖量最高但回收率较低，接着是盐酸法和Sevage法。

2.6 脱色素实验

活性炭法：取3 g多糖粗粉溶解成25 mL多糖水溶液，取0.75 g活性炭40 ℃保温50 min离心取上清液同法醇沉，冷冻干燥得多糖。结果见表 4。多糖颜色较深，此方法除色素效果较差。

过氧化氢法：取3 g多糖粗粉溶解成25 mL多糖水溶液，浓氨水，10% NaOH调节pH值8.0后滴加10% H₂O₂溶液至pH值7.0，55 ℃保温2 h。醇沉，冷冻干燥得多糖。结果见表 4。此方法除色素较为明显，冷冻干燥得白色多糖粉末。

丙酮-无水乙醇法：取3 g多糖粗粉依次用丙酮和无水乙醇洗涤3次即得松散的多糖。结果见表 4。此方法简单，多糖损耗小，但除色素效果一般。

氯仿-正丁醇法：取3 g多糖粗粉溶解成25 mL多糖水溶液，按多糖水溶液-氯仿-正丁醇25：24：1，充分混合后萃取3次，合并上清液醇沉，冷冻干燥得多糖。结果见表 4。此法除色素效果不明显，粉末呈灰白色，多糖有一定量损失。

由实验结果可以看出用丙酮-无水乙醇法除色素多糖损耗最少，其余3种方法损耗量相差不大，从含糖量来看，过氧化氢法处理组的多糖含糖量较高，接着是氯仿-正丁醇法，用活性炭和丙酮-无水乙醇处理组的含糖量相差不大。从颜色观察，过氧化氢组多糖呈白色除色素效果最好。所以在4种方法中应选用过氧化氢法除色素。

3 马齿苋多糖膜分离研究

MST的关键在于膜型号的选择。分离膜按材质可分无机膜、有机膜。按孔径大小可分为微滤(≥0.01 μm)、超滤(10～100 nm)、纳滤(1～10 nm)、反渗透(≤1 nm)。微滤、超滤同是利用筛分原理以压力差为推动力的膜分离过程。微滤可以有效去除中药提取液中颗粒杂质、絮状沉淀提高药液澄清度。超滤主要用于大分子溶液的净化、浓缩、分级等。实验分别将孔径为0.8、0.2、0.05 μm的陶瓷微滤膜同截留相对分子质量5×10⁴中空纤维超滤膜联用，计算马齿苋多糖回收率。

将马齿苋粗多糖配成质量浓度为0.02 g/mL多糖水溶液2 L，压力为80 kPa依次过0.8、0.2、0.05 μm陶瓷膜、5×10⁴中空纤维膜得截留液和渗透液。分别取过膜所得药液0.5 mL定容至10 mL量瓶中，用紫外分光光度计测定各组药液A值。

与过膜前相比，膜分离后溶液中多糖的回收率升高，溶液由黄褐色浑浊变为淡黄色澄清，且随着滤膜孔径的变小，水溶液颜色变淡。马齿苋多糖主要集中在0.8 μm渗透液中，随着膜孔径的逐渐减小，多糖质量浓度也随之降低，由此可以得出，马齿苋中的多糖相对分子质量相对来说比较大，分子直径多大于0.2 μm。结果见表 5。

4 马齿苋多糖抗氧化活性研究 4.1 清除羟基自由基活性

采用水杨酸法，利用H₂O₂和FeSO₄混合发生Fenton反应，生成具有高反应活性的•OH，加入水杨酸捕捉•OH并产生有色物质，该物质在510 nm下有最大吸收，加入抗氧化试剂会与水杨酸竞争减少有色物质的生成，在510 nm处A值降低。

在试管中依次加入6 mmol/L FeSO₄溶液2 mL、不同质量浓度多糖溶液2 mL，6 mmol/L H₂O₂溶液2 mL，摇匀，静置10 min，再加入6 mmol/L水杨酸溶液2 mL，摇匀，水浴37 ℃保温30 min后于510 nm处测得不同多糖浓度下的A_i；用水代替水杨酸时测得本底A_j，用水代替抗氧化剂时测得空白对照A₀，测得A₀＝2.053^[20]。清除率(S)按公式计算。

S＝1－(A_i－A_j)/A₀

取2、4、8、12、16、20 mg/mL 6个质量浓度梯度，采用水杨酸法测定马齿苋多糖对羟基自由基的清除活性。结果A_i－A_j分别为1.392、1.323、1.256、1.066、0.844、0.911，清除率分别为32.20%、35.56%、38.82%、48.08%、58.89%、51.73%。可知马齿苋多糖对•OH 有清除作用，且清除能力随着多糖质量浓度的增加而增加。说明羟基自由基的清除率与马齿苋多糖质量浓度呈一定的量效关系。当马齿苋质量浓度为16 mg/mL时清除率达到58.89%。

4.2 清除超氧离子自由基活性

邻苯三酚自氧化反应产生超氧阴离子自由基且其自身氧化产物在322nm处有紫外吸收。在pH＜9.0时，邻苯三酚自氧化速率与生成的超氧阴离子自由基浓度呈正相关，故可通过紫外分光光度仪来定量测定抗氧化剂在此体系中对超氧阴离子自由基的清除作用，间接评价多糖抗氧化能力^[21]。

实验在参考黄敏等^[22]的方法上进行改良。在试管中各加入2.0 mL pH 8.34 Tris-HCl缓冲溶液，分别加入1.0 mL不同浓度多糖溶液，置于25 ℃水浴保温20 min，加入6 mL蒸馏水稀释。然后加入1.0 mL 0.2 mmol/L邻苯三酚溶液，震荡均匀倒入比色皿中，在322 nm处每隔30 s记录1次A值，记录5 min。根据邻苯三酚自氧化速率计算抑制率。测得A₁/t＝0.090。

抑制率＝(A₁/t－A₂/t)/(A₁/t)

A₁/t为邻苯三酚自氧化反应速率，A₂/t为加入样品溶液后邻苯三酚自氧化反应速率

取2、4、8、12、16 mg/mL 5个质量浓度梯度，测定马齿苋多糖对超氧离子自由基的清除活性。结果A₂/t分别为0.083、0.084、0.076、0.068、0.055，清除率分别为7.78%、6.67%、15.56%、24.44%、38.89%。可知，马齿苋多糖具有清除超氧离子自由基的作用，在多糖质量浓度为2～16 mg/mL，随着多糖质量浓度的升高清除率增强，在此范围中多糖质量浓度与清除率呈良好的量效关系。

5 讨论

马齿苋是药食同源植物，具有清热解毒、凉血止血等功效。本实验将传统提取分离工艺与膜分离技术相结合，对马齿苋中主要活性成分马齿苋多糖进行了分离纯化，并系统考察了马齿苋多糖脱蛋白和脱色素的工艺，最后对马齿苋多糖体外抗氧化活性进行了研究。结果表明马齿苋多糖水提工艺最佳条件为100 ℃，3 h，4次。在3种脱蛋白方法中盐酸法和Sevage法粗多糖得率高但存在反应较剧烈、操作较繁琐等缺点。三氯乙酸法脱蛋白操作简单、结果稳定能保证马齿苋多糖的活性，有利于多糖后续活性研究。在4种脱色素方法比较中，过氧化氢法得到白色多糖粉末且含糖量最高。

传统的水提醇沉制备工艺能耗高、乙醇消耗量大、生产周期长，提取液中鞣质、淀粉、树脂和蛋白质不易除尽^[23]。一定孔径的微滤超滤膜可以代替水提醇沉工艺去除这些杂质，提高药液澄清度及有效成分的量，有效除去多糖水溶液中蛋白及色素，且可根据多糖相对分子质量的大小进行逐级分离。范远景等^[24]将枸杞多糖浸提液经微滤处理，和离心处理相比可去掉浸提液中37.95%的蛋白，且避免了多糖这种热敏性物质在操作中的损失。冯雪^[14]将微滤超滤膜联用制得红松松塔多糖产物，超滤后多糖量由超滤前的7.20%提高到44.70%。孙瑜等^[25]采用MST纯化大黄多糖，多糖浓度提高2.73倍。马利华等^[26]采用MST纯化牛蒡多糖，得到产物质量分数达73.27%。选用截留相对分子质量2×10⁵的超滤膜处理当归多糖，与单纯醇提工艺比较，总提取物由14.8 g下降到7.81 g，多糖纯度由30.47%提高到65.42%^[27]。

综上所述，相比于传统工艺，MST在多糖的分离纯化中具有独特的优势。与用化学法纯化马齿苋多糖相比，MST是典型的物理分离过程，不添加化学试剂及其他物质，保证多糖不受污染，无化学试剂残留，仪器设备简单可室温操作^[28]，在运作过程中无变相、无化学反应可在最大程度上保留多糖活性。根据实验要求可按不同相对分子质量范围对马齿苋多糖进行精制，提高马齿苋多糖纯度，为后期研究不同相对分子质量范围多糖性质提供基础。但膜分离过程中多糖损失大、膜组件和膜清洗繁琐等问题需要进一步优化。马齿苋粗多糖具有清除羟基自由基、超氧离子自由基的作用，且清除率与马齿苋多糖质量浓度呈一定的量效关系，相比较马齿苋多糖对羟基自由基有更好的清除作用。植物多糖作为天然抗氧化剂，由于安全、无毒等优点引起人们的关注^[29]，在多糖提取、纯化过程中，寻找一种高效且能最大程度保护多糖活性的方法还有待进一步研究。