中草药  2015, Vol. 46 Issue (11): 1597-1602
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引用本文doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.11.006
李海波, 于洋, 王振中, 梅玉丹, 秦大鹏, 李林, 萧伟, 姚新生. 热毒宁注射液化学成分研究(II)[J]. 中草药, 2015, 46(11): 1597-1602.
LI Hai-bo, YU Yang, WANG Zhen-zhong, MEI Yu-dan, QIN Da-peng, LI Lin, XIAO Wei, YAO Xin-sheng. Study on chemical constituents from Re-Du-Ning Injection (II)[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2015, 46(11): 1597-1602.
热毒宁注射液化学成分研究(II)
李海波1,2,3, 于洋3, 王振中1,2, 梅玉丹3, 秦大鹏3, 李林3, 萧伟1,2 , 姚新生3     
1. 江苏康缘药业股份有限公司, 江苏 连云港 222001;
2. 中药制药过程新技术国家重点实验室, 江苏 连云港 222001;
3. 暨南大学药学院中药及天然药物研究所, 广东 广州 510632
收稿日期: 2014-12-15;
基金项目： 江苏省自然科学青年基金:基于活性成分追踪分离及快速检识分析新策略的中药复方药效物质基础研究(BK20140441);江苏省博士后科研资助计划(1401171C)
作者简介：李海波(1985—),女,福建宁德人,博士,研究方向为中药及天然药物的活性成分研究。E-mail:lihaibo1985124@sina.com
通讯作者：萧伟,教授,博士生导师,研究方向为中药新剂型的研究与开发。Tel:(0518)85521956E-mail:xw_kanion@163.com;姚新生,中国工程院院士,博士生导师,研究方向为中药及天然药物活性成分研究。Tel:(020)85225849E-mail:tyaoxs@jnu.edu.cn
摘要：目的 研究中药复方热毒宁注射液化学成分。方法 综合应用硅胶、ODS、Sephadex LH-20和Toyopearl HW-40柱色谱以及反相MPLC、HPLC等现代色谱技术进行分离和纯化, 根据化合物的光谱数据和理化性质鉴定化合物结构, 并通过观察细胞病变效应(CPE)和检测细胞存活率的方法, 对分离得到的咖啡酰奎宁酸类化合物进行了体外抗呼吸道合胞病毒(RSV)作用研究。结果 从热毒宁注射液中分离得到16个化合物, 分别鉴定为5-O-咖啡酰奎宁酸(1)、5-O-咖啡酰奎宁酸甲酯(2)、4-O-咖啡酰奎宁酸(3)、4-O-咖啡酰奎宁酸甲酯(4)、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸(5)、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯(6)、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸(7)、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯(8)、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸(9)、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯(10)、断马钱子酸(11)、马钱子苷半缩醛内酯(12)、7-表-马钱子苷半缩醛内酯(13)、E-aldosecologanin(14)、Z-aldosecologanin(15)、5H,8H-pyrano [4,3-d] thiazolo [3,2-a] pyridine-3-carboxylic acid(16)。化合物1～10具有较强的体外抗RSV的效果, 其中化合物1～4的EC50值在10～30 μmol/L, 选择指数(SI)大于30;化合物5～10的EC50值小于10 μmol/L, SI大于100。结论 化合物1～16均为首次从热毒宁注射液中分离得到, 咖啡酰奎宁酸类化合物可能为热毒宁注射液抗病毒的主要药效物质基础之一。
关键词： 热毒宁注射液     抗病毒     咖啡酰奎宁酸     5-O-咖啡酰奎宁酸     断马钱子酸    
Study on chemical constituents from Re-Du-Ning Injection (II)
LI Hai-bo1,2,3, YU Yang3, WANG Zhen-zhong1,2, MEI Yu-dan3, QIN Da-peng3, LI Lin3, XIAO Wei1,2, YAO Xin-sheng3    
1. Kanion Pharmaceutical Co., Ltd., Lianyungang 222001, China;
2. State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process, Lianyungang 222001, China;
3. Institute of Traditional Chinese Medicine and Natural Products, College of Pharmacy, Jinan University, Guangzhou 510632, China
Abstract: Objective To investigate the chemical constituents from Re-Du-Ning Injection (RDN). Methods The chemical constituents were isolated by chromatography on silica gel, ODS, Sephadex LH-20, and Toyopearl HW-40 columns and reverse phase MPLC and HPLC repeatedly. Their structures were identified by spectral data and physicochemical property. Results Sixteen compounds were isolated and identified as 5-O-caffeoylquinic acid (1), 5-O-caffeoylquinic acid methyl ester (2), 4-O-caffeoylquinic acid (3), 5-O-caffeoylquinic acid methyl ester (4), 4,5-di-O-caffeoylquinic acid (5), 4,5-di-O-caffeoylquinic acid methyl ester (6), 3,5- di-O-caffeoylquinic acid (7), 3,5-di-O-caffeoylquinic acid methyl ester (8), 3,4-di-O-caffeoylquinic acid (9), 3,4-di-O-caffeoylquinic acid methyl ester (10), secologanic acid (11), vogeloside (12), 7-epi-vogeloside (13), E-aldosecologanin (14), Z-aldosecologanin (15), and 5H,8H-pyrano [4,3-d] thiazolo [3,2-a] pyridine-3-carboxylic acid (16). Compounds 1—10 showed high efficiency and low toxicity with antivirus activity against RSV. Conclusion All the isolated compounds are reported from RDN Injection for the first time, and caffeoylquinic acids may be one of antivirus pharmacodynamic material bases of RDN.
Key words: Re-Du-Ning Injection     antivirus     caffeoylquinic acid     5-O-caffeoylquinic acid     secologanic acid    

热毒宁注射液是江苏康缘药业股份有限公司自主研发的原国家中药二类新药，属中药复方注射液，由栀子、青蒿和金银花3味中药精制而成，具有清热、疏风、解毒的功效，临床上主要用于治疗外感风热所致的感冒、咳嗽、上呼吸道感染、急性支气管炎等症[1, 2, 3]。其临床疗效确切，效果显著，前期报道从热毒宁注射液抗病毒活性部位（95%乙醇洗脱部位）中分离鉴定20个化合物，并对黄酮类化合物进行了体外抗病毒活性评价，结果显示木犀草素具有较强的体外抗甲型流感病毒的活性[4]。热毒宁注射液正丁醇萃取部位的HPLC液相图谱涵盖了热毒宁注射液的主要色谱峰，为了全面阐释热毒宁注射液中的化学成分，并对注射液指纹图谱中的色谱峰进行指认，本实验拟对热毒宁注射液正丁醇部位的化学成分进行研究，从中分离得到16个化合物，分别鉴定为5-O-咖啡酰奎宁酸（5-O- caffeoylquinic acid，1）、5-O-咖啡酰奎宁酸甲酯（5-O- caffeoylquinic acid methyl ester，2）、4-O-咖啡酰奎宁酸（4-O- caffeoylquinic acid，3）、4-O-咖啡酰奎宁酸甲酯（5-O-caffeoylquinic acid methyl ester，4）、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸（4,5-di-O-caffeoylquinic acid，5）、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯（4,5-di-O- caffeoylquinic acid methyl ester，6）、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸（3,5-di-O-caffeoylquinic acid，7）、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯（3,5-di-O-caffeoylquinic acid methyl ester，8）、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸（3,4-di-O- caffeoylquinic acid，9）、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯（3,4-di-O-caffeoylquinic acid methyl ester，10）、断马钱子酸（secologanic acid，11）、马钱子苷半缩醛内酯（vogeloside，12）、7-表马钱子苷半缩醛内酯（7-epi-vogeloside，13）、E-aldosecologanin（14）、Z-aldosecologanin（15）、5H,​8H-​pyrano [4,​3-​d]​ thiazolo [3,​2-​a]​ pyridine-​3-​carboxylic acid（16）。所有化合物均为首次从热毒宁注射液中分离得到，采用观察细胞病变效应（CPE）和检测细胞存活率的方法[5]对咖啡酰奎宁酸类化合物进行体外抗呼吸道合胞病毒（RSV）的活性评价，结果显示该类化合物具有较强的体外抗RSV的效果，其中化合物1～4的EC50值在10～30 μmol/L，选择指数（SI）大于30；化合物5～10的EC50值小于10 μmol/L，SI大于100。

1 仪器与材料

Brucker AVANCE400型核磁共振仪（瑞士Brucker公司），Finnigan LCQ Advantage MAX质谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司），Waters Snapt G2 mass spectrometer高分辨质谱仪（美国Waters公司），Shimadzu分析高效液相色谱（日本Shimadzu公司，Shimadzu LC-6AD泵，紫外检测器），Shimadzu制备型高效液相色谱（日本Shimadzu公司）。分析高效液相色谱柱为C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，Nacalai Tesque Inc.，日本），制备高效液相色谱柱为C18柱（250 mm×20 mm，5 μm，Nacalai Tesque Inc.，日本）。薄层硅胶GF254和柱色谱硅胶（青岛海洋化工厂），HP-20大孔树脂（Mitsubishi-Chemical，日本），反相ODS填料（Merck公司），Sephadex LH-20填料（Amersham Biosciences公司），Toyo-pearl HW-40填料（Toyo Soda MFG）。热毒宁注射液（江苏康缘药业股份有限公司生产，批号100906）。人喉癌上皮细胞（Hep-2细胞，中国科学院武汉病毒所）；呼吸道合胞病毒（RSV，中国科学院武汉病毒所）。

2 提取与分离

取热毒宁注射液700支（10 mL/支），减压回收溶剂，得热毒宁注射液成品浓缩液700 g于10倍量水中，等体积醋酸乙酯和正丁醇分别萃取3次，减压浓缩得到醋酸乙酯萃取物（RDN-E，69.9 g）、正丁醇萃取物（RDN-B，300 g）和水层（RDN-W，327 g）。取正丁醇部位RDN-B（150 g）进行硅胶柱色谱分离，氯仿-甲醇梯度洗脱得到8个馏份Fr. 1～8。Fr. 2经Sephadex LH-20（氯仿-甲醇1∶1）柱色谱分离得到2个馏份Fr. 2A～2B，Fr. 2B经过反复ODS中低压柱色谱分离，HPLC制备得到化合物1（85 mg）、2（27.7 mg）、3（98 mg）和4（40 mg）。Fr. 4～5经反复硅胶、ODS和Sephadex LH-20柱色谱以及反相HPLC分离得到化合物5（440.6 mg）、6（159.2 mg）、7（16.4 mg）、8（28.9 mg）、9（15.6 mg）、10（25.2 mg）、11（6.8 mg）、12（7.9 mg）和13（10.1 mg）。Fr. 7经Sephadex LH-20柱色谱分离，甲醇为流动相除去色素，然后经ODS中低压柱色谱分离，HPLC制备得到化合物14（8.9 mg）、15（9.2 mg）和16（10.0 mg）。

3 结构鉴定

化合物1：白色无定形粉末，ESI-MS m/z: 377 [M＋Na]+,353 [M－H]-，相对分子质量为354。结合1H-NMR和13C-NMR数据确定分子式为C16H18O9，不饱和度为8。1H-NMR (400 MHz,CD3OD) δ: 7.57 (1H,d,J = 16.0 Hz,H-β),6.27 (1H,d,J = 16.0 Hz,H-α),7.04 (1H,d,J = 1.9 Hz,H-2′),6.93 (1H,dd,J = 8.2,1.9 Hz,H-6′),6.77 (1H,d,J = 8.2 Hz,H-5′),2.21 (2H,m,H-2),4.18 (1H,brs,H-3),3.74 (1H,dd,J = 8.6,3.2 Hz,H-4),5.28 (1H,ddd,J = 9.0,8.6,4.4 Hz,H-5),2.07 (2H,m,H-6)。以上数据与文献报道一致[6]，故鉴定化合物1为5-O-咖啡酰奎宁酸。

化合物2：白色无定形粉末，ESI-MS m/z: 391 [M＋Na]+,367 [M－H]-，相对分子质量为368。结合1H-NMR和13C-NMR数据确定分子式为C17H20O9，不饱和度为8。1H-NMR (400 MHz,CD3OD) δ: 7.53 (1H,d,J = 15.8 Hz,H-β),6.22 (1H,d,J = 15.8 Hz,H-α),7.04 (1H,brd,J = 1.9 Hz,H-2′),6.95 (1H,dd,J = 8.1,1.9 Hz,H-6′),6.78 (1H,d,J = 8.1 Hz,H-5′),2.21 (2H,m,H-2),4.14 (1H,ddd,J = 6.4,3.2,3.2 Hz,H-3),3.72 (1H,dd,J = 7.7,3.2 Hz,H-4),5.28 (1H,ddd,J = 7.7,7.9,4.4 Hz,H-5),2.07 (2H,m,H-6),3.70 (3H,s,7-OCH3)。以上数据与文献报道一致[7]，故鉴定化合物2为5-O-咖啡酰奎宁酸甲酯。

化合物3：白色无定形粉末，ESI-MS m/z: 377 [M＋Na]+,353 [M－H]-，相对分子质量为354。结合1H-NMR和13C-NMR数据确定分子式为C16H18O9，不饱和度为8。1H-NMR (400 MHz,CD3OD) δ: 7.66 (1H,d,J = 15.8 Hz,H-β),6.39 (1H,d,J = 15.8 Hz,H-α),7.08 (1H,d,J = 1.8 Hz,H-2′),6.98 (1H,dd,J = 8.1,1.8 Hz,H-6′),6.80 (1H,d,J = 8.1 Hz,H-5′),2.20 (2H,m,H-2),4.31 (1H,m,H-3),4.82 (1H,dd,J = 12.0,3.0 Hz,H-4),4.31 (1H,m,H-5),2.05 (2H,m,H-6)。以上数据与文献报道一致[8]，故鉴定化合物3为4-O-咖啡酰奎宁酸。

化合物4：白色无定形粉末，ESI-MS m/z: 391 [M＋Na]+,367 [M－H]-，相对分子质量为368。结合1H-NMR和13C-NMR数据确定分子式为C17H20O9，不饱和度为8。1H-NMR (400 MHz,CD3OD) δ: 7.65 (1H,d,J = 15.9 Hz,H-β),6.38 (1H,d,J = 15.9 Hz,H-α),7.08 (1H,brd,J = 1.8 Hz,H-2′),6.93 (1H,dd,J = 8.4,1.8 Hz,H-6′),6.80 (1H,d,J = 8.4 Hz,H-5′),2.21 (2H,m,H-2),4.29 (1H,m,H-3),4.84 (1H,overlap,H-4),5.28 (1H,m,H-5),2.05 (2H,m,H-6),3.76 (3H,7-OCH3)。以上数据与文献报道一致[9]，故鉴定化合物4为4-O-咖啡酰奎宁酸甲酯。

化合物5：淡黄色无定形粉末，ESI-MS m/z: 539 [M＋Na]+,515 [M－H]-，相对分子质量为516。结合1H-NMR和13C-NMR数据确定分子式为C25H24O12，不饱和度为14。1H-NMR (400 MHz,CD3OD) δ: 7.61 (1H,d,J = 16.0 Hz,H-3′),6.32 (1H,d,J = 16.0 Hz,H-2′),7.51 (1H,d,J = 16.0 Hz,H-3″),6.12 (1H,d,J = 16.0 Hz,H-2″),7.02 (2H,d,J = 2.0 Hz,H-5′,5″),6.76 (1H,d,J = 8.2 Hz,H-8′),6.94 (1H,dd,J = 8.2,2.0 Hz,H-9′),6.77 (1H,d,J = 8.2 Hz,H-8″),6.93 (1H,dd,J = 8.2,2.0 Hz,H-9″),2.35～2.11 (2H,m,H-2),4.38 (1H,td,J = 6.6,3.3 Hz,H-3),5.13 (1H,dd,J = 8.8,1.9 Hz,H-4),5.56 (1H,m,H-5),2.38～2.11 (2H,m,H-6)。以上数据与文献报道一致[10]，故鉴定化合物5为4,5-O-二咖啡酰奎宁酸。

化合物6：淡黄色无定形粉末，ESI-MS m/z: 529 [M－H]-，提示相对分子质量为530。结合1H-NMR和13C-NMR数据确定分子式为C26H26O12，不饱和度为14。1H-NMR (400 MHz,CD3OD) δ: 7.60 (1H,d,J = 16.0 Hz,H-3′),6.30 (1H,d,J = 16.0 Hz,H-2′),7.51 (1H,d,J = 16.0 Hz,H-3″),6.17 (1H,d,J = 16.0 Hz,H-2″),7.03 (1H,d,J = 2.0 Hz,H-5′),6.76 (1H,d,J = 8.2 Hz,H-8′),6.94 (1H,dd,J = 8.2,2.0 Hz,H-9′),7.01 (1H,d,J = 2.0 Hz,H-5″),6.76 (1H,d,J = 8.2 Hz,H-8″),6.91 (1H,dd,J = 8.2,2.0 Hz,H-9″),2.35～2.11 (4H,m,H-2,6),4.35 (1H,td,J = 6.6,3.3 Hz,H-3),5.13 (1H,dd,J = 8.2,2.8 Hz,H-3),5.56 (1H,dd,J = 14.6,7.0 Hz,H-5),3.72 (3H,s,7-OCH3)。以上数据与文献报道一致[11]，故鉴定化合物6为4,5-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯。

化合物7：淡黄色无定形粉末，ESI-MS m/z: 539 [M＋Na]+,515 [M－H]-，相对分子质量为516。结合1H-NMR和13C-NMR数据确定分子式为C25H24O12，不饱和度为14。1H-NMR (400 MHz,CD3OD) δ: 7.62 (1H,d,J = 16.0 Hz,H-3′),6.35 (1H,d,J = 16.0 Hz,H-2′),7.58 (1H,d,J = 16.0 Hz,H-3″),6.27 (1H,d,J = 16.0 Hz,H-2″),7.07 (2H,brd,J = 2.0 Hz,H-5′,5″),6.96 (2H,d,J = 8.1 Hz,H-8′,8″),6.79 (2H,d,J = 8.0,1.9 Hz,H-9′,9″),2.30 (2H,m,H-2),5.43 (2H,m,H-3,5),3.99 (1H,dd,J = 6.5,3.2 Hz,H-4),2.19 (2H,m,H-6)。以上数据与文献报道一致[12]，故鉴定化合物7为3,5-O-二咖啡酰奎宁酸。

化合物8：淡黄色无定形粉末，ESI-MS m/z: 529 [M－H]-，提示相对分子质量为530。结合1H-NMR和13C-NMR数据确定分子式为C26H26O12，不饱和度为14。1H-NMR (400 MHz,CD3OD) δ: 7.61 (1H,d,J = 15.8 Hz,H-3′),6.33 (1H,d,J = 15.8 Hz,H-2′),7.54 (1H,d,J = 16.0 Hz,H-3″),6.21 (1H,d,J = 16.0 Hz,H-2″),7.06 (1H,d,J = 2.0 Hz,H-5′),6.96 (1H,td,J = 8.2,2.0 Hz,H-8′),6.78 (1H,d,J = 8.2 Hz,H-9′),7.05 (1H,d,J = 2.0 Hz,H-5″),6.96 (1H,d,J = 8.0 Hz,H-8″),6.78 (1H,dd,J = 8.0,2.0 Hz,H-9″),2.35～2.27 (2H,m,H-2),5.39 (1H,td,J = 7.7,3.3 Hz,H-3),3.97 (1H,dd,J = 6.7,3.3 Hz,H-4),5.31 (1H,m,H-5),2.27～2.12 (2H,m,H-6),3.69 (3H,s,7-OCH3)。以上数据与文献报道一致[13]，故鉴定化合物8为3,5-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯。

化合物9：淡黄色无定形粉末，ESI-MS m/z: 539 [M＋Na]+,515 [M－H]-，提示相对分子质量为516。结合1H-NMR和13C-NMR数据确定分子式为C25H24O12，不饱和度为14。1H-NMR (400 MHz,CD3OD) δ: 7.65 (1H,d,J = 15.8 Hz,H-3′),6.34 (1H,d,J = 15.8 Hz,H-2′),7.58 (1H,d,J = 16.0 Hz,H-3″),6.27 (1H,d,J = 16.0 Hz,H-2″),7.06 (1H,brd,J = 1.9 Hz,H-5′),6.96 (1H,d,J = 8.1 Hz,H-8′),6.79 (1H,dd,J = 8.0,1.9 Hz,H-9′),7.07 (1H,brd,J = 1.9 Hz,H-5″),6.95 (1H,d,J = 8.1 Hz,H-8′),6.77 (1H,dd,J = 8.0,1.9 Hz,H-9′),2.21 (2H,m,H-2),5.62 (1H,m,H-3),5.03 (1H,dd,J = 8.4,3.0 Hz,H-4),4.32 (1H,m,H-5),2.21 (1H,m,H-6)。以上数据与文献报道一致[14]，故鉴定化合物9为3,4-O-二咖啡酰奎宁酸。

化合物10：淡黄色无定形粉末，ESI-MS m/z: 529 [M－H]-，提示相对分子质量为530。结合1H-NMR和13C-NMR数据确定分子式为C26H26O12，不饱和度为14。1H-NMR (400 MHz,CD3OD) δ: 7.62 (1H,d,J = 15.8 Hz,H-3′),6.32 (1H,d,J = 15.8 Hz,H-2′),7.53 (1H,d,J = 16.0 Hz,H-3″),6.21 (1H,d,J = 16.0 Hz,H-2″),7.06 (1H,d,J = 2.0 Hz,H-5′),6.96 (1H,d,J = 8.0 Hz,H-8′),6.78 (1H,d,J = 8.0,2.0 Hz,H-9′),7.05 (1H,d,J = 2.0 Hz,H-5″),6.97 (1H,d,J = 8.0 Hz,H-8″),6.78 (1H,dd,J = 8.0,2.0 Hz,H-9″),2.31 (2H,m,H-2),5.62 (1H,m,H-3),5.02 (1H,dd,J = 8.4,3.0 Hz,H-4),4.33 (1H,m,H-5),2.21 (2H,m,H-6),3.75 (3H,s,7-OCH3)。以上数据与文献报道一致[14]，故鉴定化合物10为3,4-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯。

化合物11：白色粉末，ESI-MS m/z: 399 [M＋Na]+,375 [M－H]-，提示相对分子量为376。结合1H-NMR和13C-NMR数据确定分子式为C16H22O10，不饱和度为6。1H-NMR (400 MHz,CD3OD) δ: 7.44 (1H,brs,H-3),5.62 (1H,m,H-8),5.45 (1H,d,J = 3.8 Hz,H-1),5.23 (1H,m,H-10),4.64 (1H,d,J = 7.8 Hz,H-1′),3.86 (1H,dd,J = 11.9,1.8 Hz,H-6′),3.65 (1H,dd,J = 11.9,5.6 Hz,H-6′),3.32 (1H,m,H-5),2.91 (1H,dd,J = 16.5,4.9 Hz,H-6),2.23 (1H,dd,J = 16.5,8.8 Hz,H-6)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD) δ: 168.4 (C-11),153.4 (C-3),133.5 (C-8),120.1 (C-10),105.3 (C-4),103.1 (C-7),100.1 (C-1′),98.6 (C-1),78.5 (C-3′),78.0 (C-5′),74.7 (C-2′),71.5 (C-4′),62.7 (C-6′),43.5 (C-9),30.5 (C-6),23.9 (C-5)。以上数据与文献报道一致[15]，故鉴定化合物11为断马钱子酸。

化合物12：白色粉末，ESI-MS m/z: 411 [M＋Na]+,387 [M－H]-，提示相对分子质量为388。结合1H-NMR和13C-NMR数据确定分子式为C17H24O10，不饱和度为6。化合物12的1H-NMR (400 MHz,CD3OD）和13C-NMR (100 MHz,CD3OD) 与化合物11进行对比，发现化合物12仅多出1个甲氧基信号[3.47 (3H,s,11-OCH3)]，其余信号基本一致。化合物12的核磁数据与文献报道一致[16]，故鉴定化合物12为马钱子苷半缩醛内酯。

化合物13：白色粉末，ESI-MS m/z: 411 [M+Na]+,387 [M－H]-，提示相对分子质量为388。结合1H-NMR和13C-NMR数据确定分子式为C17H24O10，不饱和度为6。化合物13与化合物12具有相同的相对分子质量，其1H-NMR (400 MHz,CD3OD) 和13C-NMR (100 MHz,CD3OD) 数据非常相似，结合1H-1H COSY、HSQC和HMBC谱的信息，确定化合物13与12的平面结构相同，进一步通过与文献报道[16]比对确定了2个化合物为C-7的差向异构体，故鉴定化合物13为7-表断氧化马钱子苷半缩醛内酯。

化合物14：黄色无定形粉末，ESI-MS m/z: 781 [M＋Na]+,757 [M－H]-，提示相对分子质量为758。结合1H-NMR和13C-NMR数据确定分子式为C34H46O19，不饱和度为12。1H-NMR (400 MHz,CD3OD) δ: 5.58 (1H,overlap,H-1),7.55 (1H,brs,H-3),3.10 (1H,m,H-5),2.44 (1H,m,H-6),3.08 (1H,m,H-6),6.72 (1H,t,J = 6.8 Hz,H-7),5.77 (1H,m,H-8),2.77 (1H,brdd,J = 8.8,5.1 Hz,H-9),5.28 (1H,brd,J = 9.9 Hz,H-10),5.34 (1H,brd,J = 17.2 Hz,H-10),3.74 (3H,s,11-OCH3),4.70 (1H,d,J = 8.1 Hz,H-1′),5.50 (1H,d,J = 3.7 Hz,H-1″),7.49 (1H,brs,H-3″),4.05 (1H,m,H-5″),9.22 (1H,s,H-7″),5.58 (1H,m,H-8″),2.61 (1H,m,H-9″),5.02 (1H,m,H-10″),5.05 (1H,m,H-10″),3.54 (3H,s,11″-OCH3)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD) δ: 97.7 (C-1),154.4 (C-3),110.5 (C-4),33.6 (C-5),29.8 (C-6),157.0 (C-7),135.5 (C-8),45.4 (C-9),120.5 (C-10),169.1 (C-11,11″),52.0 (11-OCH3),100.2 (C-1′),74.7 (C-2′,2′′′),78.2 (C-3′),71.6 (C-4′,4′′′),78.3 (C-5′),62.8 (C-6′),97.4 (C-1″),152.1 (C-3″),109.4 (C-4″),31.0 (C-5″),143.3 (C-6″),197.0 (C-7″),135.4 (C-8″),46.4 (C-9″),119.4 (C-10″),51.7 (11″-OCH3),99.9 (C-1′′′),78.0 (C-3′′′),78.4 (C-5′′′),62.6 (C-6′′′)。以上数据与文献报道一致[17]，故鉴定化合物14为E-aldosecologanin。

化合物15：黄色无定形粉末，ESI-MS m/z: 781 [M＋Na]+,757 [M－H]-，提示相对分子质量为758。结合1H-NMR和13C-NMR数据确定分子式为C34H46O19，不饱和度为12。化合物15和14具有相同的相对分子质量和分子式，且其1H-NMR (400 MHz,CD3OD) 和13C-NMR (100 MHz,CD3OD) 与化合物14非常相似，仅7″-CHO (δH 10.03,δC 192.0) 和C-7 (δH 6.39,δC 150.6）的碳和氢化学位移发生了明显的变化。结合1H-1H COSY、HSQC和HMBC谱的信息，确定化合物15和14具有相同的平面的结构，2个化合物是在C-7,6″双键上几何构型不同的同分异构体。将化合物15的全部碳氢信号进行了归属，经过SciFinder Scholar网络检索，发现与文献报道的Z-aldosecologanin的数据一致[7]，故鉴定化合物15为Z-aldosecologanin。

化合物16：黄色胶状物，ESI-MS m/z: 482 [M＋Na]+,917 [2M－H]-，提示相对分子质量为459。结合1H-NMR和13C-NMR数据确定分子式为C19H25NO10S，不饱和度为8。1H-NMR (400 MHz,CD3OD) δ: 5.49 (1H,d,J = 1.6 Hz,H-1),7.41 (1H,brs,H-3),3.16 (1H,overlap,H-5),2.17 (1H,m,H-6),1.50 (1H,m,H-6),5.00 (1H,m,,H-7),5.54 (1H,m,H-8),2.69 (1H,m,H-9),5.27 (1H,m,H-10),3.15 (1H,m,H-12),3.34 (1H,m,H-12),5.11 (1H,m,H-13),4.67 (1H,d,J = 7.9 Hz,H-1′),3.46～3.17 (4H,m,H-2′～5′),3.64 (1H,m,H-6′),3.85 (1H,m,H-6′)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD) δ: 97.9 (C-1),149.7 (C-3),107.9 (C-4),28.4 (C-5),33.0 (C-6),62.7 (C-7),133.6 (C-8),44.5 (C-9),120.8 (C-10),166.2 (C-11),32.1 (C-12),63.4 (C-13),169.7 (C-14),99.9 (C-1′),74.7 (C-2′),78.3 (C-3′),71.5 (C-4′),77.9 (C-5′),62.6 (C-6′)。以上数据与文献报道一致[18]，故鉴定化合物16为5H,8H-pyrano [4,3-d] thiazolo [3,2-a] pyridine-3-carboxylic acid。

4 咖啡酰奎宁酸类化合物体外抗RSV的活性评价 4.1 细胞毒性检测

实验采用AlamarBlue®（Invitrogen）试剂盒检测化合物对细胞的毒性作用。化合物的最高毒性测试浓度均为500 μmol/mL。

AlamarBlue®是一种氧化还原指示剂，能根据代谢活性产生吸光度变化和荧光信号。AlamarBlue®易溶于水，其氧化形式进入细胞后经线粒体酶还原产生可测量的荧光及颜色变化，用于细胞活性和细胞增殖的定量分析以及体外细胞毒性研究。这种测定是基于具有代谢活性的细胞将试剂转换成荧光和比色指示剂的能力，受损和无活性细胞具有较低的代谢活性，对应的信号较低。因此荧光信号强弱可以反映细胞活性的高低。

将Hep-2细胞接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后备用。用细胞维持液将单体化合物从2倍起始浓度连续3倍梯度稀释6个梯度，每浓度梯度单孔检测。实验分为3组，样品组加入Hep-2细胞＋化合物，空白对照组加入细胞维持液，细胞对照组加入Hep-2细胞，培养72 h后，光镜下观察化合物引起的细胞病变效应，加入AlamarBlue®，37 ℃孵育2 h，荧光检测AlamarBlue®的还原情况，激发光波长570 nm，发射光波长595 nm。计算CC50值，结果见表 1。

细胞活力＝(样品组荧光值－空白对照组荧光值)/(细胞对照组荧光值－空白对照组荧光值)

4.2 对RSV的抑制试验

Hep-2细胞接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后备用。待细胞长成单层后加入100 μL含2倍药物的维持培养基和100 μL RPMI 1640培养基稀释的RSV病毒液，37 ℃培养。实验设药物组、细胞对照组（无病毒感染）、病毒对照组（病毒感染后未加药物）和阳性药物（利巴韦林）组，每天观察并记录细胞出现特异性CPE情况，培养5 d后（病毒对照孔75%～100%病变）检测各组细胞活力，检测方法同“4.1”项。再根据各组的细胞活力值，按公式计算抑制率，得出EC50值，结果见表 1。

抑制率＝(药物组细胞活力－病毒对照组细胞活力)/(细胞对照组细胞活力－病毒对照组细胞活力)

实验结果表明咖啡酰奎宁酸类化合物（1～10）具有较强的体外抗呼吸道合胞病毒的效果，其中化合物1～4的EC50值在10～30 μmol/L，SI值大于30；化合物5～10的EC50值小于10 μmol/L，SI值大于100，高于阳性对照药利巴韦林的SI值，值得进一步深入研究该类化合物的抗病毒作用机制。

表 1 咖啡酰奎宁酸类化合物体外抗RSV实验结果 Table 1 Antiviral experiment results of caffeoylquinic acids
5 讨论

在前期研究的基础上本研究采用现代化学-药理学相结合的方法对临床疗效确切、应用广泛的热毒宁注射液正丁醇萃取部位进行系统的化学成分研究。综合应用各种色谱分离手段分离鉴定了16个化合物，所有化合物均为首次从热毒宁注射液中分离得到，并采用观察细胞病变效应（CPE）和检测细胞存活率的方法，对分离得到的咖啡酰奎宁酸类化合物进行了体外抗RSV作用研究，结果显示该类化合物具有较强的体外抗RSV效果，可能是热毒宁注射液的主要抗病毒药效物质基础之一。这在一定程度上揭示了该产品发挥抗病毒作用的物质基础，为探讨咖啡酰奎宁酸类成分对复方药效的贡献提供了依据。此部分工作也为后期热毒宁注射液指纹图谱的指认以及建立与功效相关联的质量控制方法奠定了一定的基础。

志谢：中国科学院武汉病毒所陈绪林教授课题组帮助完成单体化合物的体外活性评价工作；暨南大学药学院中药及天然药物研究所帮助完成核磁和质谱的测试工作。

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