2016, Vol. 39
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.1674-6376.2016.03.026 |
肝脏是人体最大的代谢器官，肾脏是最重要的排泄器官，两者担负着重要的生理功能。而随着人们生活水平的提高，肝肾脏疾病的发病率逐年升高。目前常见的引起肝肾损伤的主要原因包括缺血缺氧、病毒感染、药物或工业毒物中毒等。目前，针对其损伤的机制研究是学术界的热点。
多种细胞信号通路在维持细胞、组织和器官的稳态过程中起到至关重要的作用，核因子E2相关因子2（nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2）是最重要的一种。1994年，Nrf2首次被发现并从人白血病细胞系K562中将其分离出来，由NFE2L2基因编码表达，包含亮氨酸拉链（basic leucine zipper，bZip）的转录因子[1]。正常状态下，Nrf2在胞质中与胞浆蛋白伴侣分子Keap1（Kelch-like ECH-associated protein 1）相互作用，后者是由Keap1基因编码表达的一种Cul3-Rbx1 E3泛素连接酶复合物的底物适配器[2]。Nrf2由6个Neh功能性区域组成，包括可与Keap1的C-端kelch区域结合的DLG和ETGE氨基酸基序[3]。当有外界刺激时，Nrf-2与Keap1分离，迁移到细胞核中并在胞核中聚集，上调抗氧化反应元件从而保护产生细胞保护着作用[4]。在细胞核内，bZip是Nrf2的高度保守序列，它在激活状态下与Maf、JunD、cJun等小分子蛋白结合形成异源二聚体，再与抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）结合激活其下游的靶基因，包括谷氨酸半胱氨酸连接酶（GCL）、谷胱甘肽过氧化物酶（Gpx）、Sulfiredoxin（Srxn）、血红素氧化酶1（HO-1）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）、醌氧化还原酶1（NQO1）、UDP-葡萄糖醛酸（UGT）、多药耐药蛋白（Mrp）等，产生相应的生理功能，Nrf2的下游靶基因及其主要功能见表 1[5-6]。Nrf2入核后产生一系列反应，激活下游的靶基因和重要解毒酶基因的转录，以缓解毒物、氧化应激的产物、药物代谢物等对细胞的毒性作用。
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表 1 Nrf2的下游靶基因及其主要功能 Table 1 Examples of Nrf2 target genes and functions |
Nrf2一般通过以下几个方面保护细胞[7-8]：（1）直接提供抗氧化剂；（2）编码酶直接与氧化剂反应使其灭活；（3）增加谷胱甘肽合成和再生的水平；（4）刺激还原性辅酶Ⅱ（NADPH）合成；（5）促进解毒酶和转运体表达，促进毒物的代谢排泄；（6）抑制细胞因子介导的炎症反应；（7）调节细胞凋亡进程；（8）提高损伤蛋白质的识别、修复和移除。
研究发现，Nrf2的激活包括两种方式，一是通过其磷酸化为基础，有多种蛋白激酶可通过Nrf2的磷酸化对Nrf2的转录进行调控，如，蛋白激酶C、磷脂酰肌醇-3-激酶等[9]。二是Keap1蛋白的半胱氨酸残基的氧化还原修饰。Keap1蛋白的Cys-151，273或288位点的突变使其无法抑制Nrf2的活性或诱导其发生信号转导[10]。这些研究结果表明，Keap1结构的完整是有效调控Nrf2活性的关键，而在氧化应激条件下，Keap1的半胱氨酸修饰是诱导Nrf2活性的基础。此外，Nrf2通路可以与其他蛋白相互作用而被调节，如SQSTM1/p62可以与Nrf2竞争性结合Keap1蛋白从而调节后者的降解[11-12]。
有研究发现，一些药物通过调节Nrf2的表达和活性而发挥抗癌、抗凋亡、抗氧化、抗炎等作用，从而对细胞或机体产生保护作用。莱菔硫烷是Nrf2的激活剂，通过激活Nrf2的表达和活性来缓解慢性肾脏的损伤。Palsamy等发现白藜芦醇可以使糖尿病肾病大鼠的肌酐和脂质过氧化物水平降至正常大鼠水平；深入研究发现，白藜芦醇通过激活Nrf2并且促进其下游基因的表达来缓解大鼠的肾脏损伤[13-15]。有文献报道[16]，奥体普拉可以通过作用于Nrf2起到缓解胆汁淤积造成的肝损伤的作用，并且还可以降低黄曲霉素介导的肝癌的发病率。与其作用相似的药物还包括齐墩果酸衍生物等[17-18]。因此，以Nrf2为作用靶点的激活剂对肾脏和肝脏的保护作用给新药研发提供一个新思路。
1 Nrf2与代谢酶和转运体近十年来的研究揭示，在多种内源性和外源性物质的刺激条件下，许多药物代谢酶的调控与多种核受体有关。一些研究表明，细胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）的基因表型CYP2A5和CYP3A11等酶的表达依赖Nrf2的活化，Nrf2对解毒酶和外排型转运体也有直接的调控作用[19]。
1.1 Nrf2与代谢酶在Nrf2调节的诸多代谢酶（如GSTs、NQO1、UGTs等Ⅱ相药物代谢酶）会在毒物或致癌物质引起的氧化应激、细胞毒性条件下对细胞产生保护作用。对肝脏的研究发现，在CCl4造成的急性肝损伤模型中，Nrf2通过调节UGT1A1的表达，使后者与游离的胆红素结合生成葡糖糖醛酸化合物从而排出体外，以缓解肝毒性[19]。GST可催化还原性谷胱甘肽与亲电物质的结合，从而促进相关代谢产物排出体外。肝损伤后，Nrf2的下游GST的表达明显增高，从而增加毒性物质的排除[20-23]。
对肾脏的研究发现，在肾缺血再灌注条件下，相比于Nrf2基因敲除小鼠，野生型小鼠促进Nrf2下游基因包括HO-1、Nqo1的表达以缓解细胞凋亡，并且野生型小鼠的肌酐、尿素氮等反映肾损伤的指标明显好转。此外，用Nrf2的小分子诱导剂（抗氧化剂谷胱甘肽和N-乙酰半胱氨酸）预处理野生型和基因敲除小鼠，发现只有野生型小鼠的肾损伤得到明显缓解[24]。这表明Nrf2在缺血再灌注诱导产生的氧化应激所致的肾损伤具有显著的保护作用[25]。
1.2 Nrf2与转运体在多种解毒机制中，转运体与Ⅱ相药物代谢酶的协同作用是重要的排毒过程，内外源性毒物可形成随胆汁和尿液排泄的水溶性代谢产物，后者再经转运体排除体外，从而起到相应的细胞保护作用。研究表明，Nrf2与多种药物转运体的调节相关，如Mrps和有机阴离子转运多肽（organic anion-transporting polypeptide，OATP）[19]。
Klaassen等[26]和Maher等[27]发现，MRPs蛋白的表达受Nrf2激动剂的调节。在α-萘基异硫氰酸盐（α-naphthylisothiocyanate，ANIT）造成胆汁淤积型肝损伤的模型中，野生型小鼠的Nrf2核内表达增加183%，并且其下游基因NQO1的基因表达显著增加。Nrf2基因敲除型小鼠更易受到肝脏损伤，这与Nrf2基因缺失后胆汁在体内淤积有关。野生型小鼠ANIT造模后，胆汁外排型转运体Bsep、Mrp3、Mrp4以及胆汁酸合成酶（CYP7A1、CYP8A1）表达显著升高，而Nrf2基因缺失小鼠则没有上述表现，这就表示Nrf2可以通过调控转运体和酶的合成以促进胆汁酸的外排减轻肝脏损伤[28]。
在顺铂急性肾损伤模型中研究发现，Nrf2基因敲除小鼠的损伤程度较野生型小鼠更为严重，组织学研究显示中性粒细胞侵润更为明显，诸多炎症因子p65和核因子（NF）-κB显著增高。在对转运体的考察中发现，野生型小鼠的Mrp2和Mrp4的表达明显升高，Mrps的升高可增加对肾小管细胞中的顺铂、内源性毒物的外排作用，避免有毒物质在肾小管细胞中蓄积导致肾小管细胞的大量凋亡[29-30]。
以上研究表明，Nrf2可以通过对解毒酶和转运体表达的调节，促进内源性或外源性毒物的代谢和排泄，以起到抑制细胞凋亡、促进细胞恢复功能的作用而发挥明显的肝肾保护作用。
2 Nrf2与抗氧化应激在对肝肾损伤的机制研究中发现，氧化应激是诸多肝肾模型的发病机制。有氧生物常暴露于氧化剂和亲电子环境中，氧化还原系统的动态平衡对维持细胞稳态至关重要。当氧化剂和抗氧化剂的平衡被破坏且趋向氧化状态时，通常伴随着对细胞生存的消极影响，其中包括脂质过氧化，蛋白质、核酸的氧化修饰从而发生氧化应激。研究发现，包括心血管疾病、癌症、神经病变型疾病、糖尿病等多种疾病的发病机制均涉及氧化应激。抗氧化剂和氧化剂的动态平衡常被破坏，因为氧化剂的产生和抗氧化剂的缓冲能力随着机体自身状态和环境的改变而改变。研究发现，调节抗氧化剂水平可维持氧化还原系统的动态平衡，并且可以影响氧化应激反应[31]。
药物性肝损伤（drug-induced liver injury，DILI）是指药物或其代谢物引起的肝功能异常，由对乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）介导的肝损伤是模拟DILI的经典模型。APAP主要是通过形成硫酸盐和葡萄糖醛酸结合物后排出体外解毒。APAP由CYP450代谢产生有活性代谢产物，代谢物与谷胱甘肽（glutathione，GSH）结合排出体外。当GSH被耗尽时，具有亲电子性的代谢产物在肝细胞中蓄积，可引起脂质过氧化反应，干扰细胞内线粒体、内质网以及胞膜的稳定性，进一步导致肝细胞凋亡，造成肝损伤。GCL促进GSH的合成来缓解肝损伤，而Nrf2的下游基因GST和NQO1可助于解毒反应的中间体的代谢。利用胆汁淤积性肝损伤、酒精性肝损伤模型进行研究，发现Nrf2均能降低细胞内活性氧种（ROS）以及脂质过氧化物的产生，并且调节其下游的相关靶基因如HO-1、NQO1、GSH等以减缓氧化应激反应[32]。
在顺铂、缺血再灌注、重金属等造成的肾损伤模型中，研究发现Nrf2及其下游的相关靶基因在对抗氧化应激产生的细胞损伤中有重要作用[33]。将LLC-PK1细胞的Nrf2沉默后，用肌红蛋白孵育，其细胞活性氧含量明显增加，且细胞毒性显著增强。而对氧化应激的其他方面考察发现，缺失Nrf2后，细胞的乳酸脱氢酶（LDH）、H2O2及脂质过氧化物明显增多。用甘油造模后，Nrf2的核内表达增加而胞质内的表达降低，并且其下游靶基因HO-1、超氧化物歧化酶（SOD）-1、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、Gpx-1、过氧化氢酶以及GCL等mRNA的表达显著增加[34]。
在缺血再灌注导致的肾衰竭模型中研究发现，Nrf2基因缺失型小鼠的死亡率增加，并且伴随肾脏损伤和血管通透性增加。野生型小鼠Nrf2及其下游基因HO-1、NQO1的表达增加以缓解细胞凋亡，并且肌酐、尿素氮等反映肾损伤的指标明显好转。给予外源性抗氧化剂半胱氨酸和谷胱甘肽可明显缓解缺血再灌注导致的肾损伤[35]。
综合以上几点，表明Nrf2无论在肝脏和肾脏的损伤中都能通过调节其下游的相关抗氧化酶的表达而缓解细胞的氧化应激反应从而起到相应的保护作用。
3 Nrf2与抗炎研究发现，损伤发生时多半有炎症反应，适度的炎症反应是一种机体的自我保护机制，但其作用紊乱则会导致机体的损伤。敲除Nrf2基因可以增强NF-κB的活性及其他相关炎症因子的表达。在基础条件下，Keap1-Cul3-E3连接酶复合物可以诱导IKKβ泛素化和蛋白酶体降解；在应激条件下，Keap1复合物发生构象改变后引起IKKβ的释放，后者引发IkBα蛋白的降解。同时，IKKβ可磷酸化p65，增强p65的转录活性。有综述文章指出Nrf2的下游因子和NF-κB之间的相互作用可以共同调节转录因子的活性，如Nrf2下游的抗氧化蛋白HO-1可以通过抑制IkBα的降解来限制NF-κB的活性，而抑制HO-1的蛋白表达可以增强p65的活性[36-37]。并且，NF-κB的靶基因环氧化酶（COX-2）可以使Nrf2的转录活性和其抗氧化基因的表达减弱。研究发现，一些药物可以在激活Nrf2的同时抑制NF-κB的活性。
在由CCl4诱导的肝纤维化损伤中，Nrf2基因缺失型小鼠的损伤程度明显严重，并且相关炎症因子白介素（IL）-1α、肿瘤坏死因子（TNF）-α以及干扰素（IFN）-γ的表达明显升高[38]。非酒精性脂肪性肝是一种慢性肝脏疾病，由于三酰甘油的沉积产生氧化应激和脂质过氧化，进而导致肝细胞的损伤、凋亡，最终导致肝纤维化。研究发现，小鼠肝脏随着造模时间增加，出现肝脏脂肪性病变，并且随着炎症侵润程度增加，Nrf2的表达增加。进一步研究发现，Nrf2基因缺失型小鼠对于肝细胞的凋亡更加敏感，这与Nrf2减轻氧化应激以及炎症反应相关。研究表明，Nrf2可以调控体内重要的促纤维化因子转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）的表达，从而减缓肝脏的纤维化进程[39]。
在肾缺血再灌注损伤中，Nrf2基因缺失型小鼠的炎症因子角质细胞衍生趋化因子（KC）、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）明显升高，而在对野生型小鼠的样本检测中并没有发现显著的改变[35]。在顺铂导致的肾损伤组织学研究中，发现Nrf2基因缺失小鼠的中性粒细胞侵润更为明显，诸多转录因子p65和NF-κB显著增高，相关的下游炎症因子明显升高；而在野生型小鼠中相关组织学病变和炎症因子明显缓解[36, 40]。同样在慢性肾病的研究中发现，Nrf2在系统性红斑狼疮中起到抑制其进展的作用。并且Nrf2的缺失导致了狼疮样自身免疫性肾炎的发生和发展[41]。
以上结果表明，Nrf2在损伤造成之后对炎症因子有重要的调控作用，通过调控炎症反应因子来缓解肝肾的损伤。
4 Nrf2与抗凋亡近期研究发现，细胞的凋亡和坏死与肝肾损伤的机制密切相关。Nrf2在细胞的凋亡和增殖的过程中发挥重要作用。Hepa-1细胞沉默Nrf2基因后，Bcl-xl的表达显著减少。Nrf2过表达后，Bax的表达则显著降低。使用Nrf2的激活剂tBHQ后Bcl-xl表达增加，而Bax和caspase-3、caspase-7的表达减少[8, 42]。在肝脏和肾脏的疾病中，Nrf2同样在抑制凋亡方面发挥重要作用。
用棕榈酸孵育人原代肝细胞导致的内质网应激损伤中，凋亡转录因子CHOP蛋白和细胞凋亡率增加，而合用硫辛酸上调Nrf2可使上述现象明显改善。同样的现象在小鼠的肝细胞研究中，发现硫辛酸通过调节Nrf2的表达可以缓解棕榈酸引起的caspase-3的激活、减少棕榈酸的蓄积、增加脂肪酸的氧化。用硫辛酸治疗后，凋亡蛋白Bax表达下降，而抗凋亡蛋白Bax-xl表达升高，并且线粒体的膜电位更加稳定。Nrf2基因沉默后，Nrf2基因缺失，导致细胞的增殖能力下降，细胞凋亡率上升[43]。
同样在急性肾损伤中，Nrf2及其下游的靶基因对细胞凋亡具有抑制作用。在急性肾损伤中研究发现，Nrf2的下游HO-1蛋白可以下调Bax的表达，并且降低caspase-3和caspase-9的活性，而上调Bcl-xl和Bcl-2的表达，因而起到肾脏保护作用[44]。
以上表明Nrf2可以通过调节凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的表达，进而调控细胞凋亡进程，起到缓解损伤的作用。
5 结语统计发现，在美国有50%的急性肝损伤是由药物的不当使用而引起的毒性损伤或发生过敏反应，并且严重的DILI患者可能发生严重的继发性症状，如不可逆的脑、肾衰竭，甚至导致死亡。DILI是目前的肝脏损伤的研究热点，而且保肝药物具有积极的治疗作用，如可以促进肝细胞的再生、保肝解毒、降酶、利胆等，这些药物广泛应用于临床。Nrf2对肝脏的保护作用已经较为明确，保肝药物还原谷胱甘肽的抗氧化、调节细胞代谢等作用对肝脏具有显著的治疗作用。因此，Nrf2作为一个保护和治疗的靶点在新药研发过程中被给予了很大程度的关注，目前针对保护靶点而研发新药已经成为热点，本综述为研究和开发保肝、治疗药物性肝损伤新药提供了一定的理论基础。
Nrf2在肝脏、肾脏中的保护作用主要表现在：（1）Nrf2通过调节代谢酶如CYP、UGT、GSTs等增加对体内毒物的代谢，并通过调节转运体如外排性转运体加速其外排；（2）在应激条件下，Nrf2发生核位移可调节下游多种抗氧化酶如HO-1、GSH、Srxn的表达，从而缓解氧化应激损伤；（3）当损伤发生时，Nrf2可以通过调节炎症因子IL-1α、TNF-α以及IFN-γ表达来缓解炎症反应；（4）Nrf2能够调节Bcl2家族中的凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的表达，从而调节caspase家族的表达来延缓细胞凋亡的发生。总之，Nrf2在保护肝、肾损伤中发挥重要的作用，有望为肝肾损伤的治疗和新药研发提供一个新靶点。
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