2017, Vol. 48
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2017.05.011 |
2. 山东中医药大学附属医院, 山东 济南 250012
2. Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250012, China
党参为桔梗科植物党参Cdonopisis pilosula (Farnch.) Nannf.、素花党参Codonopsis pilousla Nannf. var. modesta (Nannf.) L. T. Shen或川党参Codonopsis tangshen Oliv.的干燥根，是我国常用的补益药材，具有补中益气、健脾益肺的功效[1]。研究表明，党参含有多糖类、植物甾醇类、萜类、生物碱类、苯丙素苷类等多种化学成分，其中多糖类所占比例最大[2-3]。目前，党参多糖（Codonopsis pilosula polysaccharide，CPP）的生物活性研究大多局限于其对免疫系统功能的调节方面，这在某种程度上阻碍了药材党参的相关新药资源开发，致使药材党参的附加值不高，制约了党参种植及相关产业的发展[4-5]。本课题组曾对CPP提取纯化工艺进行优化，并对其单糖组成和相对分子质量（MW）分布进行了研究[6]，本研究采用热回流浸提方法对党参中的多糖成分进行提取，并采用单因素和响应面法对其工艺进行优化。在此基础上采用中空纤维超滤[7]实验装置对提取的党参粗糖多进行分级，并考察不同MW CPP中的单糖组成及体内外抗氧化活性，为进一步探索CPP的构效关系及作用机制奠定基础。
1 仪器与材料 1.1 试药与试剂党参，采购于山西潞城，经山东省中医药大学附属医院张学顺教授鉴定为桔梗科植物党参Cdoonopisis pilosula (Farnch.) Nannf.的干燥根；血清白蛋白，北京恒业中远化工有限公司；葡聚糖，截留MW 500 000，上海谷研科技有限公司；考马斯亮蓝，上海迈坤化工有限公司；维生素C（VC）、D-半乳糖均购自Sigma公司；实验测定试剂盒均购自碧云天生物技术有限公司；其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备TU-1901紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；Tensor Ⅱ傅里叶变换红外光谱仪，德国Bruker公司；中空纤维超滤装置，北京旭邦膜设备有限责任公司；LGJ-10冷冻干燥机，北京四环科学仪器四厂；ML503电子天平，Mettler Toledo仪器（上海）有限公司；德国Heidolph旋转蒸发器，艾拓思实验设备（上海）有限公司；Milli QA纯水处理器，Millipore公司。Bradford蛋白浓度测定试剂盒、丙二醛（MDA）检测试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒、谷胱甘肽（GSH）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测试剂盒均购自碧云天生物技术有限公司。
1.3 实验动物1月龄清洁型雌性ICR小鼠，共60只，体质量（20±2）g，购于山东省实验动物中心，许可证号SCXK（鲁）20140007。饲养环境安静，室温25 ℃，各组小鼠自由进食、饮水。
2 方法 2.1 党参粗多糖的制备取60 ℃干燥后粉碎的党参药材，加入3倍体积的石油醚（30~60 ℃），加热回流2次，每次2 h，弃去提取液，滤渣挥干溶剂。取500 g脱脂处理的党参药材粉末，以水为提取溶剂，在提取温度为85 ℃，料液比为1:12，提取时间为1.5 h的情况下回流提取2次，合并提取液，经5 000 r/min离心10 min，60 ℃减压浓缩至2 000 mL，加入4倍体积的无水乙醇过夜，沉淀多糖，干燥至恒定质量即得粗多糖样品[8]。
2.2 CPP的分离与精制 2.2.1 CPP的精制与分离操作流程及考察指标将党参粗多糖加水溶解，置分液漏斗中，采用Sevage法沉淀蛋白。将去除蛋白的多糖溶液加于DEAE-纤维素柱，经1 mol/L NaCl溶液洗脱，洗脱液浓缩后灌入透析袋中，循环透析24 h，除去残留NaCl及其他的小分子物质[9-11]。
将透析后的多糖旋蒸浓缩，选用合适的超滤膜，在适当的压力和膜通量下，以一定的体积流量进行超滤，工作流程图见图 1。
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图 1 超滤装置工作流程图 Fig.1 Ultrafiltration device flowcharts |
采用恒流泵提供动力和控制体积流量，调节调压阀控制压力，将试样放入恒温水浴中，透过液采用量筒收集，计算膜通量和截留率。
膜通量=V/(St)
截留率=V2C2/(V1C1)
V为超滤时间内透过的超滤液的体积（mL），t为超滤时间（min），S为有效膜面积（cm2），V2和C2分别是截留后超滤液的体积和质量浓度，V1和C1分别是储存液的体积和质量浓度
2.2.2 超滤膜的选择不同规格的超滤膜对截留率和膜通量的影响，截留MW越大，截留率越低，膜通量越大，MW 30 000与MW 10 000相比截留率相差不明显，而膜通量显著增加；MW 5 000与MW 3 000相比截留率相差不明显，而MW 5 000的膜通量显著增加，因此，选择MW 300 000的超滤膜进行初滤，MW 30 000和MW 5 000分别对多糖进行截留，结果见表 1。
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表 1 不同规格的超滤膜对截留率和膜通量的影响 Table 1 Effects of different sizes of ultrafiltration membrane on rejection rate and membrane flux |
2.2.3 超滤压力的选择
适当增加超滤压力，膜通量在一定范围内可以提高，但随着超滤压力的增大，膜表面的质量浓度也会增加，因此导致截留率会相应的降低，由表 2可以看出，当超滤压力为0.2 MPa时，膜通量相对较大，而截留率也不至于太低，因此选择超滤压力为0.2 MPa较合适。
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表 2 超滤压力对截留率和膜通量的影响 Table 2 Effect of ultrafiltration pressure on retention rate and membrane flux |
2.2.4 超滤温度的选择
多糖的生物活性会随着温度的升高而改变，因此一般情况下超滤的温度不宜超过50 ℃。因此，本实验考察温度为25、35、45 ℃时，对截留率和膜通量的影响，结果见表 3。结果显示，膜通量会随着温度的升高而增加，但是随着温度的升高，溶液的黏度也会增加，相应的膜的截留率也会下降，因此在保证有一定的膜通量的情况下，选择25 ℃作为超滤温度，以便于操作。
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表 3 超滤温度对截留率和膜通量的影响 Table 3 Effect of ultrafiltration temperature on retention rate and membrane flux |
2.2.5 超滤法分离CPP的流程
将预处理的CPP粗提液采用中空纤维超滤实验装置，设定超滤压力为0.20 MPa，超滤温度为25 ℃，超滤膜选用CLN-300KD（MW 300 000）、CLN-30KD（MW 30 000）、CLN-5KD（MW 5 000）3种滤膜，其中CLN-300KD的超滤膜起初滤的作用，CLN-30KD和CLN-5KD分别截留30 000以上，30 000~5 000和5 000以下MW的多糖共3个组分，即CPP1、CPP2、CPP3，具体流程见图 2。
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图 2 超滤法分离流程图 Fig.2 Separation flow chart by ultrafiltration |
2.3 红外光谱分析
取党参多糖各级冻干粉3.0 mg与KBr混合研磨均匀后压片，使用红外光谱扫描仪在4 000~400 cm-1内进行扫描，记录扫描图谱。由图 3可知，党参多糖组分在3 418 cm-1处有一吸收强度较大的峰，是多糖特征的O-H的伸缩振动峰，由糖分子内或分子间氢键O-H伸缩振动引起的吸收；2 930 cm-1附近的吸收峰为次甲基（-CH2）中-C-H的伸缩振动的吸收峰；1 633 cm-1附近的吸收峰为C=O伸缩振动峰；1 056 cm-1附近的吸收峰，此为醇羟基的变角振动；923 cm-1的吸收，此吸收为吡喃糖环醚键（-C-O-C-）的非对称伸缩振动，为甘露糖的特征吸收。由红外图谱可知CPP1、CPP2、CPP3具有明显的糖类化合物的特征。
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图 3 党参多糖红外光谱图 Fig.3 Infrared spectrogram of CPP |
2.4 体外抗氧化活性研究[12-14] 2.4.1 CPP对DPPH自由基清除能力的测定
取1.0 mg/mL的多糖溶液2.0 mL，加入2.0 mL现配的0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液，混匀后静置30 min，以50%的乙醇作参比，在517 nm测定样品的吸光度（A）值。以2.0 mL蒸馏水代替多糖溶液，其余操作同上作为空白，VC作阳性对照。样品对DPPH的清除率即为自由基清除率。
DPPH自由基清除率=(ADPPH-A样品)/ADPPH
CPP1、CPP2、CPP3对DPPH的清除作用结果如表 4所示。由表 4可知，VC对DPPH的清除作用强于CPP。CPP各级分随着质量浓度增加清除率增大，CPP3清除作用强于CPP1和CPP2。
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表 4 CPP对DPPH自由基的清除能力 Table 4 DPPH free radical scavenging ability of CPP |
2.4.2 CPP对羟自由基清除能力测定
取10 mL的试管，每支加入2 mL的FeSO4溶液（6 mmol/L）以及2 mL不同浓度的多糖溶液，然后加入2 mL的H2O2（6 mmol/L）溶液，摇匀后静置10 min，再加入2 mL的水杨酸（6 mmol/L）溶液，摇匀后静置30 min，测定其在510 nm处A值，以蒸馏水按同样方法做空白，以VC作阳性对照。每个样品重复试验3次，取其平均值，计算羟自由基的清除率。
清除率=A0-(Ai-Aj)/A0
A0为不加样品溶液的A值，Ai为加入样品溶液反应后的A值，Aj为不加水杨酸时溶液的A值
各级多糖对羟自由基的清除作用结果如表 5所示。由表 5可知，当VC质量浓度达0.5 mg/mL时其对羟基自由基清除率达95.33%。在一定的范围内多糖清除羟自由基的能力随着浓度的增大而增强，相同浓度下，CPP3清除作用强于CPP1和CPP2。
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表 5 CPP对羟自由基的清除能力 Table 5 Hydroxyl rdical scavenging ability of CPP |
2.4.3 CPP对超氧阴离子自由基清除能力测定
取6.0 mL 50 mmol/L、pH 8.12 Tris-HCl缓冲液，分别加入不同质量浓度多糖溶液0.5 mL，混匀后37 ℃水浴保温10 min，加入37 ℃预热过的7 mmol/L邻苯三酚盐酸溶液1 mL，混匀，测定其在325 nm处的A值。依照以上方法，用蒸馏水代替样品，所测得A0为邻苯三酚的吸光度，以VC作为阳性对照，每个样品重复3次，取其平均值，计算清除率。
清除率=(A0-A)/A0
A0为空白邻苯三酚的吸光度，A为加入样品溶液后邻苯三酚的吸光度
CPP1、CPP2、CPP3对超氧阴离子的清除作用结果如表 6所示。由表 6可知，党参多糖对超氧阴离子的清除作用弱于阳性对照VC，当样品质量浓度为5 mg/mL时VC的清除率达99.01%，CPP1为71.02%，CPP2为75.52%，CPP3为90.33%。在质量浓度为0.125~5.0 mg/mL时，CPP3清除作用强于CPP1和CPP2。
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表 6 CPP对超氧阴离子的清除能力 Table 6 Superoxide anion scavenging capacity of CPP |
2.5 CPP3对D-半乳糖所致衰老小鼠模型的保护作用[14-17] 2.5.1 溶液的配制
D-半乳糖溶液的配制：取D-半乳糖适量，溶于生理盐水中配制成4 mg/mL的溶液，储存于4 ℃冰箱中备用。CPP溶液的配制：称取一定量的党参多糖CPP3，溶于生理盐水中配制成20 mg/mL的溶液，储存于4 ℃冰箱中备用。
2.5.2 实验动物分组将健康清洁级ICR雌性小鼠，经1周环境适应性饲养，随机分为6组：对照组，模型组，VE阳性对照组，党参多糖CPP3低、中、高剂量组。每组10只，分笼饲养。
2.5.3 给药除对照组每天颈背部sc生理盐水外，其他5组均按80 mg/(kg∙d) 的剂量颈背部sc D-半乳糖。与此同时，党参多糖CPP3低、中、高剂量组分别以100、200、400 mg/(kg∙d) ig给药，VE阳性对照组以25 mg/(kg∙d) ig给药，对照组和衰老模型组小鼠则ig相应体积的生理盐水。
2.5.4 组织样品的处理实验第48天（造模与给药均为48 d），停止药物干预，小鼠禁食12 h，以眼眶后静脉丛取血，取血后颈椎脱臼处死小鼠，取出肝脏用0.9%预冷的生理盐水制备10%的组织匀浆，备用。分别测定血清及肝组织中SOD、GSH-Px、GSH及MDA水平。
2.5.5 数据处理采用SPSS 16.0软件进行ANOVA单因素方差分析，数据以x±s表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为显著性差异，P＜0.01为极显著性差异。
2.5.6 小鼠血清指标的变化由表 7可知，与对照组相比，模型组小鼠血清中SOD、GSH-Px和GSH的活性均明显降低（P＜0.05），而MDA水平显著增加（P＜0.05），证明D-半乳糖致正常小鼠衰老模型造模成功。CPP3高剂量组能显著升高SOD、GSH-Px和GSH的活性（P＜0.05），且显著降低MDA水平（P＜0.05），与VE阳性对照组无显著性差异（P＞0.05），证明CPP组分CPP3高剂量组对小鼠的抗氧化作用显著；而中、低剂量组对小鼠的抗氧化作用不明显。
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表 7 CPP3对小鼠血清SOD、GSH-Px、GSH及MDA的影响 Table 7 Effects of CPP3 on serum SOD, GSH-Px, GSH, and MDA in mice |
2.5.7 小鼠肝脏指标的变化
由表 8可知，与对照组比较，模型组小鼠肝脏组织匀浆中SOD、GSH-Px和GSH的活性均明显降低（P＜0.05），而MDA水平显著增加（P＜0.05），证明D-半乳糖致正常小鼠衰老模型造模成功。CPP3高剂量组能显著提高小鼠肝脏组织中SOD、GSH-Px和GSH酶的活性（P＜0.05），并能显著降低MDA水平（P＜0.05），与VE阳性对照组相比，无显著性变化（P＞0.05）；而中、低剂量组对小鼠肝脏中SOD、GSH-Px和GSH的活性及MDA水平的影响较小（P＞0.05）。
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表 8 CPP3对小鼠肝脏组织匀浆SOD、GSH-Px、GSH及MDA的影响 Table 8 Effects of CPP3 on SOD, GSH-Px, GSH, and MDA in liver homogenate of mice |
3 讨论
本研究采用采用中空纤维超滤实验装置，以膜通量为指标，对CPP粗提液进行分级、冷冻干燥，最终筛选出3个组分CPP1、CPP2、CPP3。单糖组成分析和红外光谱数据表明，CPP1可能是以葡萄糖醛酸为主链组成的杂多糖，而CPP2和CPP3可能是以氨基半乳糖为主链组成的杂多糖[18-19]。体外抗氧化实验结果表明，CPP对DPPH、羟自由基和超氧阴离子自由基的清除能力弱于VC，但在一定浓度范围内，CPP3的清除作用强于CPP1和CPP2，表明低MW的CPP3抗氧化作用最强。根据体外抗氧化实验结果，选择考察体外抗氧化力最强的CPP3对D-半乳糖致衰老小鼠的保护作用，结果CPP3高剂量组能显著提高小鼠血清和肝脏组织中SOD、GSH-Px和GSH酶的活性，表明CPP3对D-半乳糖所致衰老小鼠具有明显的保护作用。
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