中草药  2017, Vol. 48 Issue (5): 859-862
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引用本文doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2017.05.003
尹秀梅, 金春梅, 王思宏. 长白山地区钝叶瓦松茎提取物的成分及活性研究[J]. 中草药, 2017, 48(5): 859-862.
YIN Xiu-mei, JIN Chun-mei, WANG Si-hong. Chemical constituents and activity of stem extract from Orostachys malacophyllus in Changbai Mountain[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2017, 48(5): 859-862 .
长白山地区钝叶瓦松茎提取物的成分及活性研究
尹秀梅1, 金春梅1,3, 王思宏2,3     
1. 延边大学药学院, 吉林 延吉 133002;
2. 延边大学 测试中心, 吉林 延吉 133002;
3. 延边大学 长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室, 吉林 延吉 133002
收稿日期: 2016-09-05
基金项目: 国家自然科学基金资助项目（21365023）
作者简介: 尹秀梅 (1971-), 女, 高级实验师, 研究方向为天然产物活性成分研究。Tel:(0433)2436004, E-mail:yinxm@ybu.edu.cn
通信作者: 王思宏 (1969-), 男, 副教授, 研究方向为基于磁性材料的天然产物活性成分研究。Tel:(0433)2733063, E-mail:shwang@ybu.edu.cn
摘要: 目的 研究长白山地区钝叶瓦松Orostachys malacophyllus茎中活性成分。 方法 使用色谱法分离钝叶瓦松甲醇提取物的醋酸乙酯萃取物中的化合物，利用核磁共振波谱、质谱等技术进行结构鉴定，采用CCK-8方法测试活性。 结果 从钝叶瓦松茎甲醇提取物中分离鉴定出5个成分，分别为苹果酸-1-乙酯（1）、2-（3，4-二羟基苯酰基氧代）-苹果酸单乙酯（2）、2-（3，4-二羟基苯酰基氧代）-苹果酸二甲酯（3）、2-对羟基苯酰基氧代-苹果酸二甲酯（4）、邻苯二甲酸二异丁酯（5）。 结论 化合物1~5为从该属植物中首次分离得到，其中化合物2是新化合物，命名为瓦松酚酸；其对HeLa细胞的细胞毒活性的IC50值为111.5 μmol/L。
关键词: 钝叶瓦松     苹果酸-1-乙酯     2-(3, 4-二羟基苯酰基氧代)-苹果酸单乙酯     邻苯二甲酸二异丁酯     瓦松酚酸     细胞毒活性    
Chemical constituents and activity of stem extract from Orostachys malacophyllus in Changbai Mountain
YIN Xiu-mei1, JIN Chun-mei1,3, WANG Si-hong2,3     
1. College of Pharmacy, Yanbian University, Yanji 133002, China;
2. Analysis and Test Center, Yanbian University, Yanji 133002, China;
3. Key Laboratory of Organism Functional Factors of the Changbai Mountains of Ministry of Education, Yanbian University, Yanji 133002, China
Abstract: Objective To explore the active constituents from the stems of Orostachys malacophyllus in Changbai Mountain. Methods The ethyl acetate fraction of the methanol extract from the stems of O. malacophyllus was separated by chromatographic methods, structure identification was by means of nuclear magnetic resonance and mass spectra, and the activity was determined by CCK-8 experiment. Results Five compounds were isolated and identified as 1-ethyl-2-hydroxysuccinate (1), 1-ethyl-2-O-[(3, 4-dihydroxybenzoyl) oxy]-succinate (2), 1, 4-dimethy-2-O-[(3, 4-dihydroxybenzoyl) oxy]-succinate (3), 1, 4-dimethy-2-O-[(4-dihydroxybenzoyl) oxy]-succinate (4), and diisobutyl phthalate (5). Conclusion Compounds 1-5 are isolated from the plants of this genus for the first time. Among them, compound 2 is a new compound named orostachysolic acid, and exhibits cytotoxicity against HeLa cell with IC50 value of 111.5 μmol/L.
Key words: Orostachys malacophyllus (Pall.) Fisch.     1-ethyl-2-hydroxysuccinate     1-ethyl-2-O-[(3, 4-dihydroxybenzoyl) oxy]-succinate     diisobutyl phthalate     orostachysolic acid     cytotoxicity    

瓦松属植物为多年生肉质草本植物，作为药用资源的瓦松属植物有7种，包括瓦松Orostachys fimbriata (Turcz.) Berger、钝叶瓦松O. malacophyllus (Pall.) Fisch.、黄花瓦松O. spinosus (L.) C. A. Mey.、狼爪瓦松O. cartilaginea A. Bor.、塔花瓦松O. chanetii (Lévl.) Berger、晚红瓦松O. erubescens (Maxim.) Ohwi、小苞瓦松O. thyrsiflora Fisch.[1]。

随着人们对肉质植物的研究兴趣越发浓厚，景天科瓦松属植物也正在受到研究者们的关注。瓦松属植物含有的化学成分有黄酮、甾醇、酚酸、三萜以及强心苷等[2-3]。国内外对该属植物化学成分和药理方面已经有研究[4-10]，但都缺少深度挖掘瓦松的潜在药用价值的研究。钝叶瓦松具有清热解毒、止血消肿、利湿敛疮等传统功效[11-13]。目前对该属植物化学成分和生物活性的研究相对较少，且多集中在粗提取物上。因此，本实验对长白山地区钝叶瓦松的化学成分及生物活性进行研究，从其茎的甲醇提取物中分离鉴定5个成分，分别为苹果酸-1-乙酯（1-ethyl-2-hydroxysuccinate，1）、2-(3, 4-二羟基苯酰基氧代)-苹果酸单乙酯（1-ethyl-2-O-[(3, 4-dihydroxy-benzoyl) oxy]-succinate，2）、2-(3, 4-二羟基苯酰基氧代)-苹果酸二甲酯（1, 4-dimethy-2-O-[(3, 4-dihydroxy-benzoyl) oxy]-succinate，3）、2-对羟基苯酰基氧代-苹果酸二甲酯（1, 4-dimethy-2-O-[(4-dihydroxybenzoyl) oxy]-succinate，4）、邻苯二甲酸二异丁酯（diisobutyl phthalate，5）。其中，化合物1~5为从该属植物中首次分离得到；2为新化合物，命名为瓦松酚酸，其对HeLa细胞的细胞毒活性IC50值为111.5 μmol/L。

1 仪器与材料

Agilent 1100高效液相色谱-质谱联用仪（美国安捷伦）；AV-300型核磁共振仪（瑞士布鲁克）；手提式紫外检测器（254 nm，上海顾村电光仪器厂）；柱色谱用硅胶（100~200目，青岛海浪硅胶干燥剂厂）；甲醇、三氯甲烷、石油醚、醋酸乙酯、二氯甲烷均为分析纯。

实验所用的药材钝叶瓦松茎采集于吉林省长白山地区，经延边大学药学院生药学教研部吕惠子副教授鉴定为钝叶瓦松Orostachys malacophyllus (Pall.) Fisch.，其标本（YB-DW-0001）保存于延边大学药学院植物标本室。

2 方法 2.1 提取与分离

称取干燥的钝叶瓦松茎约2 kg，粉碎，室温条件下甲醇浸泡，超声提取3次，每次30 min。滤过，收集提取液，合并3次提取液，浓缩干燥得提取物56.2 g。然后将提取物悬于水中，用醋酸乙酯进行萃取，经浓缩得到醋酸乙酯萃取物22.3 g。将醋酸乙酯萃取物经硅胶柱色谱分离，石油醚-醋酸乙酯-甲醇混合溶剂梯度洗脱（100%石油醚、石油醚-醋酸乙酯1:10~1:3、石油醚-醋酸乙酯-甲醇10:3:1），经TLC检测并合并得到组分，经反复硅胶柱色谱进行分离纯化，得到化合物1（4.2 mg）、2（3.6 mg）、3（4.5 mg）、4（5.1 mg）、5（4.0 mg）。结构见图 1。

图 1 化合物1~5的结构 Fig.1 Structures of compounds 1-5

2.2 细胞存活率测定

在37 ℃、5% CO2的条件下，将人宫颈癌HeLa细胞培养于含10%胎牛血清、100 g/L青霉素、100 g/L链霉素的DMEM培养基中，每2~3天消化传代1次，取其中处于对数生长期的细胞进行实验。实验组分别加入不同浓度梯度药物的培养液（2.5、5、10 μmol/mL），同时设置对照组，每组设置3个复孔，加药后继续在培养箱中孵育24 h，倒置显微镜下观察。培养结束后，避光条件下每孔加入CCK-8溶液10 μL，然后将96孔板继续在培养箱内孵育1~4 h，用酶标仪于450 nm波长处测定各孔吸光度（A）值，计算细胞存活率。

细胞存活率=A给药/A对照

3 结构鉴定

化合物1：亮黄色油状物，1H-NMR (300 MHz, CD3OD) δ: 4.47 (1H, t, J=6.0 Hz, H-2), 4.20 (2H, q, J=6.0 Hz, H-1'), 2.71 (2H, dd, J=6.0, 12.0 Hz, H-3), 1.27 (3H, t, J=6.0 Hz, H-2')；13C-NMR (75 MHz, CDCl3) δ: 173.4 (C-1), 170.5 (C-4), 67.3 (C-2), 60.9 (C-1′), 38.7 (C-3), 14.1 (C-2′)；TOF-MS m/z 162.05 [M]+，上述数据与文献报道一致[14-15]，确定化合物1及其乙酯位置，鉴定其结构为苹果酸-1-乙酯。

化合物2：无色胶状物，分子式为C13H14O8；[α]D20 +5.4 (c 0.11，MeOH)；(nm): 203, 216, 260；(cm−1): 3 358, 2 918, 2 852, 1 704, 1 616, 1 051；1H-NMR (300 MHz, CD3OD) δ: 7.42 (1H, s, H-3″), 7.41 (1H, d, J=9.0 Hz, H-6″), 6.78 (1H, d, J=9.0 Hz, H-7″), 4.46 (1H, t, J=6.0 Hz, H-2), 4.19 (2H, q, J=6.0 Hz, H-1′), 2.71 (2H, dd, J=6.0, 12.0 Hz, H-3), 1.26 (3H, t, J=6.0 Hz, H-2′)；13C-NMR (75 MHz, CD3OD)δ: 173.3 (C-1), 172.6 (C-1″), 168.8 (C-4), 150.1 (C-4″), 144.7 (C-5″), 122.5 (C-3″), 121.7 (C-2″), 116.3 (C-6″), 114.3 (C-7″), 67.3 (C-2), 60.9 (C-1′), 38.5 (C-3), 13.0 (C-4)；DEPT 135 δ: 122.5 (CH), 116.3 (CH), 114.3 (CH), 67.3 (CH), 60.9 (CH2), 38.5 (CH2), 13.0 (CH3)；TOF-MS m/z: 298.42 [M]+。紫外光谱提示结构中有苯环体系，红外光谱显示有羟基、羰基和取代苯的信号，氢谱中δ4.46, 4.19, 2.71, 1.26和碳谱中δ173.3, 168.8, 67.3, 60.9, 38.5, 13.0与化合物1骨架一致。由DEPT-135谱中化学位移在δ 122.5 (CH), 116.3 (CH), 114.3 (CH) 处是3组吸收峰，以及氢谱中的化学位移δ 7.42是单峰，δ 7.41和6.78是相互偶合关系，确定化合物结构中是1, 3, 4取代苯。基于化合物1的骨架，根据上述波谱数据再结合质谱，推断化合物2乙酯位置，结合2-(3, 4-二羟基苯酰基氧代)-苹果酸-1-甲酯的数据[16]，确定化合物2为2-(3, 4-二羟基苯酰基氧代)-苹果酸单乙酯。

化合物3：无色胶状物，1H-NMR (300 MHz, CD3OD) δ: 7.53 (1H, s, H-3″), 7.49 (1H, d, J=9.0 Hz, H-6″), 6.83 (1H, d, J=9.0 Hz, H-7″), 4.69 (1H, t, J=6.0 Hz, H-2), 3.77 (3H, s, H-1′), 3.75 (3H, s, H-2′), 3.05 (2H, d, J=6.0 Hz, H-3)；13C-NMR (75 MHz, CD3OD) δ: 170.2 (C-1), 170.1 (C-4), 165.6 (C-1″), 149.5 (C-4″), 143.4 (C-5″), 124.1 (C-3″), 120.9 (C-2″), 116.7 (C-6″), 114.8 (C-7″), 68.6 (C-2), 53.0 (C-1′), 52.5 (C-2'), 36.2 (C-3)；TOF-MS m/z: 298.07 [M]+，综合分析化合物3的1H-和13C-NMR数据发现与文献报道一致[16]，鉴定化合物3为2-(3, 4-二羟基苯酰基氧代)-苹果酸二甲酯。

化合物4：无色胶状物，[α]20D +5.5 (c 0.11，MeOH)； (nm): 202, 217, 259；(cm−1): 3 213, 2 919, 2 850, 1 730, 1 679, 1 050；1H-NMR (300 MHz, CD3OD) δ: 7.86 (2H, d, J=9.0 Hz, H-3″, 7″), 6.82 (2H, d, J=9.0 Hz, H-4″, 6″), 4.59 (1H, t, J=6.0 Hz, H-2), 3.75 (3H, s, H-1′), 3.67 (3H, s, H-2′), 3.02 (2H, d, J=6.0 Hz, H-3)；13C-NMR (75 MHz, CD3OD) δ: 170.1 (C-1), 169.8 (C-4), 165.4 (C-1″), 142.6 (C-5″), 131.2 (C-3″, 7″), 119.8 (C-2″), 114.9 (C-4″, 6″), 68.5 (C-2), 51.7 (C-1′), 51.2 (C-2′), 35.5 (C-3)；TOF-MS m/z: 282.07 [M]+，综合分析化合物4的1H-和13C-NMR数据，与文献报道相对照[17]，鉴定化合物4为2-对羟基苯酰基氧代-苹果酸二甲酯。

化合物5：黄色油状物，ESI-MS m/z: 301 [M+Na]+, 279 [M+H]+。1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 7.74 (2H, q, J=3.0 Hz, H-3, 6), 7.56 (2H, q, J=3.0 Hz, H-4, 5), 4.11 (4H, d, J=4.0 Hz, H-2′, 2′), 2.06 (2H, sept, J=4.0 Hz, H-3′, 3′), 1.01 (12H, d, J=4.0 Hz, H-4′, 4′, 4′, 4′)；13C-NMR (75 MHz, CDCl3) δ: 167.7 (C-1′, 1′), 132.2 (C-1, 2), 130.9 (C-3, 6), 128.8 (C-4, 5), 71.8 (C-2′, 2′), 27.7 (C-3′, 3′), 19.2 (C-4′, 4′, 4′, 4′)，上述数据与文献报道一致[18-22]，由此可鉴定化合物5为邻苯二甲酸二异丁酯。

4 肿瘤细胞增殖抑制活性

采用CCK-8方法对5个化合物进行了肿瘤细胞增殖抑制活性筛选，其中化合物1~5对HeLa细胞的细胞毒性的IC50值分别为136.6、111.5、150.0、163.3、200.4 μmol/L。其中，化合物1~4含有相同苹果酸骨架，构效关系有待进一步探讨。

参考文献
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