2017, Vol. 48
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2017.03.012 |
中药是多组分的的组合体，中药质量控制应采用多指标、多手段等方法进行综合性评价。中药指纹图谱能全面体现中药成分的整体性与稳定性[1-3]，并体现种属间的共有性图谱片段；一测多评法（QAMS）以样品中某一典型组分为内标，建立与其他组分之间的相对校正因子（f），并通过f计算其他组分的量[4-7]，是《中国药典》2015年版品种修订中重点推广技术。QAMS常应用于对照品难分离、单体不稳定或价格昂贵的中药质量控制[8]。指纹图谱与QAMS相结合的方法全面、科学地评价中药的质量，提高了中药的稳定性和一致性[8-9]。近年来，国内外也有文献报道将2种方法结合用于中药的质量控制与定量测定[8-11]。多酚类成分含有活性羟基，有很强的抗氧化能力。具有抑菌[12-14]、抗氧化[15-16]、抗感染[17]、抗衰老[18]、抗肿瘤[19-20]和保护心脏[16, 21-24]等作用。荔枝Litchi chinensis Sonn.为无患子科（Sapindaceae）荔枝属Litchi Sonn.南方常青植物，荔枝极具开发价值。古有记载，荔枝根可行气止痛、固肾止涩；树皮可舒肝解郁、祛风健胃；树枝可治虚喘；叶可解暑消滞、收湿敛疮；花可治喉痹肿痛；果壳可治血崩；果核则有行气散结、祛寒止痛之功效[25]。本课题组前期得到的荔枝多酚提取物[26]，经过分离、分析和鉴定，已经鉴定出4个化合物的结构，分别为表儿茶素、原花青素A2、原花青素B2和表儿茶素-(4β→8, 2β→O→7)-表儿茶素-(4β→8)-表儿茶素（以下简称PC-C）。采用指纹图谱对荔枝多酚提取物进行整体评价，并采用QAMS法对多酚提取物中单个组分进行定量测定，为荔枝多酚的质量控制提供技术支持。
1 仪器与材料Acquity UPLC H-Class液相色谱仪，检测器为PDA及QDA，工作站为Empower 3，美国Waters；CP225D电子分析天平，德国Sartorius；Acquity UPLC® HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色谱柱。共收集22批荔枝不同部位、不同采收期的原材料，见表 1。其中共获得5个成熟期的荔枝皮。取原材料适量，用68%乙醇按液料比20：1、59 ℃回流提取93 min，共2次。合并滤液，减压浓缩至无醇味，AB-8大孔吸附树脂吸附，收集65%乙醇洗脱液，43 ℃减压浓缩，冷冻干燥，即得22批多酚提取物，以原材料采集日期作为批号。荔枝生长过程中，荔枝形成果实但未成熟会出现3次大面积生理落果，未成熟核和未成熟皮由生理落果剥离获得。
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表 1 22批荔枝原材料 Table 1 22 Batches of raw materials of Litchi chinensis |
表儿茶素对照品，质量分数≥98%，批号878-200102，中国食品药品检定研究院；原花青素A2、原花青素B2、PC-C，从提取物中分离制备所得，经UV、IR、ESI-MS2、NMR谱确证，质量分数均≥98%。甲醇、乙腈，色谱纯，德国Merck KGaA；甲酸，色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；液相用蒸馏水，屈臣氏；其他用水为去离子水，其他化学试剂为分析纯。
2 方法与结果 2.1 分析条件 2.1.1 色谱条件Acquity UPLC® HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色谱柱；流动相为乙腈-1%甲酸水溶液，梯度洗脱：0~9 min，8%~13%乙腈；9~10.5 min，13%~15%乙腈；10.5~13 min，15%~18%乙腈；13~15 min，18%~22%乙腈；15~17 min，22%~50%乙腈；17~17.5 min，50%~8%乙腈；17.5~21 min，8%乙腈；检测波长：光谱扫描范围200~800 nm，检测波长为280 nm；体积流量0.35 mL/min；柱温35 ℃；进样量3 μL。
2.1.2 质谱条件电离模式ESI−；正极性毛细管电压1.5 kV；负极性毛细管电压0.8 kV；探头温度270 ℃；锥孔电压30 V；采样速率5 Hz；MS扫描范围m/z 100.00~1 100.00。
2.2 溶液配制 2.2.1 混合对照品溶液的制备取原花青素B2 15 mg，置20 mL量瓶，用30%甲醇溶解并稀释至刻度，即得原花青素B2对照品储备液。
分别取表儿茶素、原花青素A2、PC-C约30、25、12 mg，精密称定，置同一100 mL量瓶中，加入原花青素B2对照品储备液2 mL，用30%甲醇溶解并稀释至刻度，即得混合对照品储备液。
精密吸取混合对照品储备液5 mL，置10 mL量瓶，30%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
2.2.2 供试品溶液的制备取荔枝多酚提取物约100 mg，精密称定，置100 mL量瓶，30%甲醇溶解并定容至刻度，即得。
2.3 方法学考察 2.3.1 线性关系考察取混合对照品贮备液定量稀释制成分别含表儿茶素30、60、90、150、180、240、300 μg/mL，原花青素B2 3、6、9、15、18、24、30 μg/mL，原花青素A2 25、50、75、125、150、200、250 μg/mL，PC-C 12、24、36、60、72、96、120 μg/mL的系列混合对照品溶液，取上述系列溶液，按“2.1”项色谱条件进样分析，以质量浓度（C）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，进行线性回归，分别得各对照品的标准曲线及回归方程L1：A=kC+b。将所得的标准曲线截距校正为0后，得曲线回归方程L2：A=kC。各对照品校正前后曲线回归方程及线性范围见表 2。
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表 2 线性回归方程 Table 2 Linear regression equations |
2.3.2 精密度试验
取批号20140507供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下，连续进样6次，结果表儿茶素、原花青素B2、原花青素A2、PC-C的峰面积平均值RSD分别为0.12%、0.37%、0.12%、0.20%。以表儿茶素的保留时间和峰面积为参照，各共有峰的相对保留时间和峰面积RSD均≤2.5%，相似度均为1.0，符合指纹图谱技术要求，表明仪器精密度良好。
2.3.3 稳定性试验取批号20140507供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下，在0、4、8、12、18、24 h分别进样测定，结果表儿茶素、原花青素B2、原花青素A2、PC-C的峰面积平均值RSD分别为0.07%、0.74%、0.09%、0.26%。以表儿茶素的保留时间和峰面积为参照，各共有峰的相对保留时间和峰面积RSD均≤2.5%，相似度均为1.0，符合指纹图谱技术要求，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.3.4 重复性试验取批号20140507荔枝多酚提取物6份，按“2.1”项下供试品溶液制备方法处理，在“2.1”项色谱条件下测定，表儿茶素、原花青素B2、原花青素A2、PC-C平均质量分数分别为13.37%、0.86%、10.44%、5.32%，RSD分别为1.12%、1.86%、1.58%、1.33%。以表儿茶素的保留时间和峰面积为参照，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD均≤5%，相似度均大于0.990，符合指纹图谱技术要求，表明本法重复性良好。
2.3.5 加样回收率试验取批号20140507荔枝多酚提取物50 mg，置100 mL量瓶中，共6份，分别加入含表儿茶素、原花青素B2、原花青素A2、PC-C对照品各730.9、65.35、537.9、263.0 μg/mL的混合对照品溶液10 mL，按供试品溶液制备方法制备，分别按“2.1”项色谱条件进样分析，计算加样回收率及其RSD，结果表儿茶素、原花青素B2、原花青素A2、PC-C平均加样回收率分别为99.8%、97.9%、100.9%、100.0%，RSD分别为1.16%、0.67%、1.36%、1.18%。表明方法的准确度符合要求。
2.4 指纹图谱研究 2.4.1 指纹图谱共有模式的建立及部分共有峰的指认及定位将22批样品指纹图谱导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件”（2012.130723版），生成指纹图谱共有模式（对照指纹图谱，R），其中19个色谱峰为共有峰，见图 1。14号峰的分子离子[M-H]− m/z 577.20与Friedrich等[27]报道的B型原花青素二聚体在ESI负离子模式下检测的分子离子质量数一致，推测为B型原花青素二聚体。
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图 1 22批荔枝多酚提取物UPLC指纹图谱及对照指纹图谱(R) Fig.1 UPLC fingerprint of 22 batches of polyphenol in extracts of Litchi chinensis and reference fingerprint (R) |
12、16和17号峰的分子离子分别为[M-H]− m/z 863.10、[M-H]−m/z 863.20和[M-H]−m/z 863.20，与Gu等[28]报道的ESI负离子模式下A型原花青素三聚体的分子离子质量数一致，比B型原花青素三聚体在ESI负离子模式下的分子离子少了2个质子，推测3个组分均为A型原花青素三聚体。19号峰的分子离子[M-H]− m/z 575.10与Roux等[29]报道的ESI负离子模式下A型原花青素二聚体的分子离子质荷比一致，与B型原花青素二聚体在质谱ESI负离子条件下的分子离子相比，少了2个质子，推测19号峰为A型原花青素二聚体。
根据MS图、UV光谱图（图 2）及相对分子质量初步确定：12、16和17号峰为原花青素A型三聚体，14号峰为B型原花青素二聚体，19号峰为原花青素A型二聚体。通过与混合对照品谱图（图 3）各成分进行比对，指认了19个共有峰中的4个，分别为6号峰（原花青素B2）、8号峰（表儿茶素）、9号峰（PC-C）、15号峰（原花青素A2）。
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6-原花青素B2 8-表儿茶素9-PC-C 15-原花青素A2 6-procyanidin B2 8-epicatechin 9-PC-C 15-procyanidin A2 图 2 12、14、16、17及19号色谱峰的质谱和UV光谱组合图 Fig.2 MS and UV spectra combination chart of component chromatographic peaks 12, 14, 16, 17, and 19 |
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6-原花青素B2 8-表儿茶素 9-PC-C 15-原花青素A2 6-procyanidin B2 8-epicatechin 9-PC-C 15-procyanidin A2 图 3 混合对照品HPLC图 Fig.3 HPLC of mixed reference substances |
以表儿茶素为参照峰考察各待测组分，计算各共有指纹峰的保留时间、相对保留时间和相对峰面积，见表 3。22批荔枝多酚提取物部分共有峰保留时间及相对峰面积差异较大，相对保留时间无明显差异，故采用相对保留时间对共有峰进行定位。
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表 3 荔枝UPLC指纹图谱技术参数 Table 3 Technical parameters for UPLC fingerprint of Litchi chinensis |
2.4.2 指纹图谱相似度评价
采用药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012.130723版）对22批荔枝多酚提取物的指纹图谱进行相似度评价。以批号20140507为参照谱图，以平均数法生成22批荔枝多酚提取物的对照谱图，22批荔枝多酚提取物的相似度分别为0.995、0.996、0.972、0.997、0.977、0.996、0.992、0.987、0.958、0.963、0.975、0.906、0.989、0.988、0.950、0.928、0.985、0.983、0.993、0.920、0.997、0.967。
2.5 QAMS研究采用斜率比值法[30]：通过各对照品校正后曲线的斜率比求得f。f的计算公式为f=kS/kR，式中kS、kR分别为表儿茶素及其他待测组分对照品经校正后的回归方程的斜率（k）。在定量测定时，以单一的表儿茶素作为对照品，计算供试品中表儿茶素的量，其他待测成分量测定公式为Cx=fAxNW/(AS/CS)。式中N、W、Ax和Cx分别为供试品中某待测成分x的稀释倍数、称样量、峰面积和质量浓度，AS和CS分别为供试品中表儿茶素的峰面积及质量浓度。计算内标物表儿茶素对其他待测成分原花青素B2、原花青素A2、PC-C的f，见表 4。
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表 4 f计算结果 Table 4 Calculation results of f |
2.5.1 f耐用性试验
通过改变体积流量、柱温及检测波长，考察f的耐用性。各变动因素及结果见表 5，结果表明，f的耐用性良好，见表 5。
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表 5 f的耐用性试验 Table 5 Robustness test of f |
2.5.2 QAMS与外标法测定结果比较
采用QAMS（以表儿茶素为内标物）计算各待测成分的量，并与外标法测得的供试品中各待测成分的量值进行比较，2种方法测定的结果见表 6。
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表 6 荔枝提取物中4种成分的测定结果 Table 6 Total amounts of four compounds in Litchi chinensis extract |
比较传统外标法的实测值和QAMS的计算值结果，t检验结果表明，2种方法没有差别（P＞0.25），说明建立的QAMS对荔枝提取物进行定量测定的结果可靠。
2种方法所得不同部位中4种组分总量见表 6。以QAMS法结果做图，见图 4。未成熟期均比成熟期高，且在花和未成熟叶中最高，核中最低。
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1~5分别为荔枝5个成熟期 1-5-Litchi five mature period respectively 图 4 22批荔枝多酚提取物中4种组分总量 Fig.4 Total contents of four components in polyphenol extract of Litchi chinensis |
3 讨论
本实验采用指纹图谱结合QAMS评价模式，考察了22批不同荔枝原材料得到的多酚提取物的稳定性及一致性。通过PAD在线检测，UV光谱显示280 nm为荔枝多酚类成分的特征吸收波长，且出峰较多、丰度较高，故选择280 nm为测定波长。采用QAMS测定荔枝多酚提取物，表儿茶素为荔枝多酚提取物的成分，其量较高、稳定且较其他3个成分易得，故选为内标物；文献多采用平均值法计算校正因子，本实验采用标准曲线斜率比值计算校正因子，避免单个点偏差大造成的误差。
指纹图谱中已知组分采用对照品确认；其他共有峰先根据UV光谱确定为多酚类物质，再结合ESI负离子模式下检测的分子离子质量数和文献报道确认了3个A型原花青素三聚体、1个A型原花青素二聚体和1个B型原花青素二聚体。为进一步考察荔枝多酚类物质提供了参考。
采用QAMS测定22批荔枝多酚提取物4个已知组分量并与外标法比较。2种方法荔枝多酚提取物中4种指标成分量测定值无显著差异。22批荔枝多酚提取物中4种已知成分总量未成熟期均高于成熟期。提取物中多酚以A型原花青素为主；单体主要是表儿茶素，2个采收期嫩叶及花中其量最高。已确定的B型原花青素为原花青素B2，成熟荔枝核中原花青素B2远低于未成熟核及其他部位。核及老枝中4种指标成分总量最低，由于取样少，有待进一步研究，建议暂不作为荔枝多酚的原材料。本实验初步得出已知的4个组分在不同部位的分布、不同生长期其量的变化规律，为荔枝多酚有效成分的收集、研究奠定了基础。
总的来说，22批荔枝原材料多酚提取物特征指纹图谱相似度大于0.90，按指纹图谱相似度评价标准，整体上成分结构一致。但是采收期不同、产地不同及部位不同导致各指标成分量不同。荔枝核及老枝除外，其他19批中表儿茶素、原花青素B2、原花青素A2和PC-C的量分别为7.73%~30.77%、0.43%~1.40%、6.36%~11.43%和2.26%~5.41%。故暂定荔枝多酚提取物中表儿茶素、原花青素B2、原花青素A2和PC-C的量应分别不低于5.0%、0.5%、5.0%和3.0%，4个成分总量不低于20.0%。指纹图谱结合QAMS测定单个组分的量解决了对照品难以获得或不稳定的难题，并保证了荔枝提取物的稳定性及一致性。2014年广东荔枝产量124万吨，预计在2020年总产量达150万吨以上，2015年75%在省内鲜销[31]。大量被废弃的荔枝果皮和果核、成熟过程中的生理落果、枝和叶等的综合应用可扩大多酚的来源。除多酚类成分以外，荔枝原材料中还有黄酮、皂苷等组分。其他成分的进一步开发研究更是达到了变废为宝、物尽其用的效果。
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