2017, Vol. 48
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2017.03.006 |
黑果悬钩子Rubus caesius L.是蔷薇科（Rosaceae）悬钩子属Rubus L.植物，为蔓生灌木，生于谷地、灌丛或林缘。该植物主要分布于西伯利亚、中亚、欧洲等地区，在我国分布于新疆额敏、塔城、伊宁、尼勒克等地，为新疆特有的悬钩子属植物资源[1]。悬钩子属植物中已分离到黄酮类、多酚类、鞣质类、萜类和甾体类等成分[2-4]，具有抗氧化、抗菌、抑癌、降糖、心血管保护等多种作用[5-8]。黑果悬钩子在哈萨克民族药中具有一定的历史，一直作为发汗、抗炎、止泻、安神、强身的天然良药[9]。本研究组前期研究表明，黑果悬钩子含有较高的总黄酮量和较强的抗氧化活性[10]。为深入研究黑果悬钩子的化学成分及生物活性，促进黑果悬钩子植物资源的综合开发利用，本实验从其茎、叶的醋酸乙酯部位分离得到7个化合物，分别鉴定为柚皮苷（naringin，1）、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（apigenin-7-O-β-D-glucopyranoside，2）、异槲皮苷（isoquercitrin，3）、金丝桃苷（hyperoside，4）、(−)-表儿茶素3-O-没食子酸[(−)-epicatechin 3-O-gallate（ECG），5]、类叶升麻苷（acteoside，6）、鞣花酸（ellagic acid，7）。化合物1~7为首次从该植物中分离得到，结构见图 1。以对-硝基苯基磷酸二钠（p-NPP）作为底物，以钒酸钠为阳性对照，利用酶标仪测定化合物的蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）抑制活性，化合物6表现出较好的PTP1B抑制活性，IC50为（27.41±0.61）μg/mL。
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图 1 化合物1~7的结构 Fig.1 Chemical structures of compounds 1—7 |
1 仪器和材料
Ultimate TM 3000高效液相色谱系统（美国DIONEX公司）；LC-20AT半制备液相色谱系统（日本岛津公司）；Varian MR-400核磁共振波谱仪（400 MHz）、Varian VNMRS-600核磁共振波谱仪（600 MHz）（美国Varian公司）；RE-52型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；FW型高速万能粉碎机（北京永光明医疗仪器厂）；BSA124S万分之一电子天平（德国Sartorius公司）；柱色谱硅胶（青岛海洋化工厂）；薄层色谱硅胶板（烟台江油硅胶开发有限公司）；GF254薄层色谱硅胶（青岛海洋化工厂）。Sephadex LH-20（Pharmacia公司）；反相硅胶YMC C18反相硅胶填料（成都科普生物有限公司）；其他试剂均为分析纯或色谱纯。
黑果悬钩子于2014年9月采自新疆额敏县165团，由石河子大学生命科学学院徐文斌博士鉴定为黑果悬钩子Rubus caesius L.的茎和叶。
2 方法 2.1 提取与分离黑果悬钩子干燥的茎（1.3 kg）和叶（2.4 kg）分别用粉碎机粉碎，再分别用6 L和10 L甲醇提取4次，合并浸提液减压浓缩，回收甲醇，分别加2 L水混悬后，分别用石油醚、醋酸乙酯和正丁醇分步萃取。萃取液回收溶剂，得到茎的石油醚部位36.0 g、醋酸乙酯部位39.5 g、正丁醇部位11.7 g、水部位8.3 g；得到叶的石油醚部位68.0 g、醋酸乙酯部位39.4 g、正丁醇部位22.1 g、水部位24.5 g。
黑果悬钩子茎的醋酸乙酯部位提取物（30.0 g）用硅胶柱色谱（300~400目）分离，石油醚-丙酮（19:1、10:1、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9、0:100）梯度洗脱，得到23个流分Fr. 1~23，其中Fr. 16~18用Sephadex LH-20凝胶柱和半制备液相色谱分离，得到化合物1（9.6 mg）。Fr. 19经硅胶柱色谱，氯仿-甲醇梯度洗脱，得到34个流分Fr. 19-1~19-34。Fr. 19-1~19-3用Sephadex LH-20凝胶柱和半制备液相色谱分离得到化合物2（8.3 mg）。Fr. 20经硅胶柱，以氯仿-甲醇梯度洗脱得到23个流分Fr. 20-1~20-23，流分20-3、20-10分别用Sephadex LH-20凝胶柱和半制备液相色谱分离，得到化合物3（10.2 mg）、4（14.4 mg），流分20-18、20-19分别用Sephadex LH-20凝胶柱和半制备液相色谱分离，得到化合物5（5.6 mg）。
黑果悬钩子叶的醋酸乙酯部位（30.0 g）用硅胶柱色谱（300~400目）分离，以石油醚-丙酮梯度洗脱得到25个流分AE1~AE25。AE24经硅胶柱色谱，以氯仿-甲醇梯度洗脱，得到25个流分AE24-1~AE24-25，AE24-4和AE24-14分别用Sephadex LH-20凝胶柱和半制备液相色谱分离，得到化合物6（9.4 mg）和7（5.6 mg）。
2.2 PTP1B抑制活性测定以p-NPP作为底物，以钒酸钠为阳性对照，利用酶标仪进行PTP1B酶抑制剂的筛选，根据PTP1B水解p-NPP的磷酸基团而产生颜色反应来测定PTP1B的活性。在96孔板中加入PTP1B溶液（0.115 g/L）1 μL、测试样品（各化合物用DMSO溶解，质量浓度梯度为0.16、0.31、0.62、1.25、2.50、5.00、10.00 g/L）1 μL或阳性对照钒酸钠（用DMSO溶解，浓度梯度为0.03、0.06、0.13、0.25、0.50、1.00 mmol/L）1 μL或DMSO 1 μL、缓冲液（50 mmol/L HEPES，pH 7.3，100 mmol/L NaCl，0.1% BSA，1 mmol/L DTT）96 μL混匀，10 min后加入p-PNP 2 μL，使其终浓度为2 mmol/L。30 ℃孵育30 min后，用3 mol NaOH终止反应。以不含酶溶液的系统为空白对照，利用SpectraMax MD5酶标仪测定405 nm处吸光度（A）。按下式计算不同浓度样品的抑制率。应用Origin软件计算半抑制浓度（IC50）[11]。
抑制率=(A空白-A样品)/A空白
3 结果 3.1 结构鉴定化合物1：淡黄色粉末。1H-NMR (500 MHz, MeOD) δ: 7.33 (2H, d, J=8.5 Hz, H-2′, 6′), 6.83 (2H, d, J=8.5 Hz, H-3′, 5′), 6.19 (1H, d, J=2.2 Hz, H-8), 6.17 (1H, d, J=2.2 Hz, H-6), 5.40 (1H, dd, J=2.7, 12.9 Hz, H-2), 5.25 (1H, d, J=5.3 Hz, 葡萄糖, H-1″), 5.12 (1H, d, J=5.8 Hz, 鼠李糖, H-1′′′), 3.37~3.94 (10H, m, 糖基氢), 3.18 (1H, m, H-3b), 2.76 (1H, m, H-3a), 1.29 (3H, d, J=7.2 Hz, 鼠李糖, CH3)；13C-NMR (126 MHz, MeOD) δ: 198.0 (C-4), 166.0 (C-7), 164.5 (C-5), 164.2 (C-9), 158.6 (C-4′), 130.3 (C-1′), 128.7 (C-2′), 128.6 (C-6′), 115.8 (C-3′, C-5′), 104.4 (C-10), 102.1 (C-1″), 98.8 (C-1′′′), 97.3 (C-6), 96.2 (C-8), 80.2 (C-2), 78.7 (C-2″), 78.4 (C-3″), 77.6 (C-5″), 73.4 (C-4′′′), 71.7 (C-2′′′), 71.7 (C-3′′′), 70.7 (C-4″), 69.5 (C-5′′′), 61.8 (C-6″), 43.5 (C-3), 17.7 (C-6′′′)。该数据与文献报道[12-13]一致，故鉴定化合物1为柚皮苷。
化合物2：淡黄色粉末。1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ: 7.96 (2H, d, J=9.0 Hz, H-2′, 6′), 6.93 (2H, d, J=9.0 Hz, H-3′, 5′), 6.89 (1H, s, H-3), 6.84 (1H, d, J=1.8 Hz, H-8), 6.44 (1H, d, J=2.4 Hz, H-6), 5.07 (1H, d, J=7.2 Hz, H-1″), 3.71~3.17 (5H, m, H2″~6″)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6) δ: 182.0 (C-4), 164.2 (C-2), 162.9 (C-7), 161.4 (C-4′), 161.1 (C-5), 156.9 (C-9), 128.6 (C-2′, 6′), 121.0 (C-1′), 116.0 (C-3′, 5′), 105.3 (C-10), 103.1 (C-3), 99.9 (C-6), 99.4 (C-1″), 94.8 (C-8), 77.2 (C-5″), 76.4 (C-3″), 73.1 (C-2″), 71.4 (C-4″), 60.6 (C-6″)。该数据与文献报道[14]一致，故鉴定化合物2为芹菜素-7-O-吡喃葡萄糖苷。
化合物3：黄色粉末。1H-NMR (500 MHz, MeOD) δ: 6.40 (1H, d, J=2.0 Hz, H-8), 6.21 (1H, d, J=2.0 Hz, H-6), 7.71 (1H, d, J=2.2 Hz, H-2′), 7.59 (1H, dd, J=2.2, 8.5 Hz, H-6′), 6.87 (1H, d, J=8.5 Hz, H-5′), 5.26 (1H, d, J=7.6 Hz, H-1″), 3.22~3.74 (6H, m, H-2″~6″)；13C-NMR (126 MHz, MeOD) δ: 179.5 (C-4), 166.0 (C-7), 163.1 (C-5), 159.0 (C-9), 158.5 (C-2), 149.9 (C-4′), 145.9 (C-3′), 135.6 (C-3), 123.2 (C-6′), 123.1 (C-1′), 117.5 (C-5′), 116.0 (C-2′), 105.7 (C-10), 104.3 (C-1″), 99.9 (C-6), 94.7 (C-8), 78.4 (C-5″), 78.1 (C-3″), 75.7 (C-2″), 71.2 (C-4″), 62.6 (C-6″)。该数据与文献报道[15-17]一致，故鉴定化合物3为异槲皮苷。
化合物4：黄色粉末。1H-NMR (500 MHz, MeOD) δ: 7.58 (1H, dd, J=8.5, 2.2 Hz, H-6′), 7.84 (1H, d, J=2.2 Hz, H-2′), 6.86 (1H, d, J=8.5 Hz, H-5′), 6.40 (1H, d, J=2.2 Hz, H-8), 6.20 (1H, d, J=2.2 Hz, H-6), 5.36 (1H, d, J=7.8 Hz, H-1″), 3.48~3.85 (6H, m, H-2″~6″)；13C-NMR (125 MHz, MeOD) δ: 158.6 (C-2), 135.6 (C-3), 179.4 (C-4), 162.9 (C-5), 99.7 (C-6), 165.9 (C-7), 94.5 (C-8), 158.3 (C-9), 105.5 (C-10), 122.7 (C-1′), 115.9 (C-2′), 145.7 (C-3′), 149.8 (C-4′), 117.6 (C-5′), 122.8 (C-6′), 105.2 (C1″), 73.0 (C-2″), 74.9 (C-3″), 67.9 (C-4″), 77.0 (C-5″), 61.7 (C-6″)。该数据与文献报道[17-19]一致，故鉴定化合物4为金丝桃苷。
化合物5：白色粉末。1H-NMR (500 MHz, MeOD) δ: 6.92 (2H, s, H-2″, 6″), 6.91 (1H, d, J=1.9 Hz, H-2′), 6.78 (1H, dd, J=10.0, 1.9 Hz, H-6′), 6.67 (1H, d, J=10.0 Hz, H-5′), 5.93 (2H, s, H-6, 8), 5.50 (1H, brs, H-3), 5.02 (1H, s, H-2), 2.98 (1H, dd, J=17.0, 4.6 Hz, H-4a), 2.83 (1H, dd, J=17.0, 2.2 Hz, H-4b)；13C-NMR (125 MHz, MeOD) δ: 78.6 (C-2), 70.0 (C-3), 26.9 (C-4), 99.4 (C-4a), 157.9 (C-5), 96.5 (C-6), 157.9 (C-7), 95.9 (C-8), 157.3 (C-8a), 131.5 (C-1′), 115.1 (C-2′), 146.0 (C-3′), 146.0 (C-4′), 116.0 (C-5′), 119.7 (C-6′), 121.5 (C-1″), 110.3 (C-2″), 146.3 (C-3″), 139.8 (C-4″), 146.3 (C-5″), 110.2 (C-6″), 171.2 (C=O)。该数据与文献报道[20]一致，故鉴定化合物5为(−)-表儿茶素3-O-没食子酸。
化合物6：白色粉末。1H-NMR (600 MHz, MeOD) δ:苷元6.70 (1H, d, J=2.3 Hz, H-2), 6.68 (1H, d, J=9.6 Hz, H-5), 6.57 (1H, dd, J=2.3, 9.6 Hz, H-6), 2.81 (2H, m, H-7);葡萄糖: 4.4 (1H, d, J=9.5 Hz, H-1′), 3.28~4.85 (6H, m, H-2′~6′); 鼠李糖: 5.20 (1H, d, J=1.7 Hz, H-1″), 3.28~4.85 (4H, m, H-2″~5″), 1.11 (3H, d, J=7.4 Hz, H-6″); 咖啡酰基: 7.06 (1H, d, J=2.3 Hz, H-2′′′), 6.78 (1H, d, J=9.8 Hz, H-5′′′), 6.97 (1H, dd, J=2.3, 9.8 Hz, H-6′′′), 7.60 (1H, d, J=19.0 Hz, H-7′′′), 6.30 (1H, d, J=19.0 Hz, H-8′′′)；13C-NMR (150 MHz, MeOD)δ: 131.6 (C-1), 117.3 (C-2), 146.3 (C-3), 144.9 (C-4), 116.5 (C-5), 121.4 (C-6), 36.8 (C-7), 72.4 (C-8);葡萄糖: 104.4 (C-1′), 76.4 (C-2′), 81.8 (C-3′), 70.8 (C-4′), 76.2 (C-5′), 62.5 (C-6′); 鼠李糖: 103.2 (C-1″), 72.5 (C-2″), 72.2 (C-3″), 74.0 (C-4″), 70.6 (C-5″), 18.6 (C-6″); 咖啡酰基: 127.8 (C-1′′′), 115.4 (C-2′′′), 147.0 (C-3′′′), 150.0 (C-4′′′), 116.7 (C-5′′′), 123.4 (C-6′′′), 148.2 (C-7′′′), 114.9 (C-8′′′), 168.4 (C=O, C-9′′′)。该数据和文献报道[21]一致，故鉴定化合物6为类叶升麻苷。
化合物7：黄色粉末。1H-NMR (500 MHz, Pyr-d) δ: 8.17 (2H, s, H-4, 9)；13C-NMR (126 MHz, Pyr-d) δ: 161.0 (C-5, 10), 150.7 (C-3, 8), 142.2 (C-2, 7), 138.1 (C-1a, 6a), 113.8 (C-4b, 9b), 112.1 (C-4, 9), 109.0 (C-4a, 9a)。该数据与文献报道[22-23]一致，故鉴定化合物7为鞣花酸。
3.2 PTP1B抑制活性筛选分步萃取后得到黑果悬钩子萃取部位包括石油醚部位、醋酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位，未测定石油醚部位的PTP1B活性。不同萃取部位和部分化合物的PTP1B抑制活性见表 1。黑果悬钩子茎叶不同萃取部位均有较高的PTP1B抑制活性，其IC50低于或接近于阳性对照矾酸钠，其中水部位的活性最高，IC50为（0.08±0.01）μg/mL。分离的化合物中类叶升麻苷的活性较好，IC50为（27.41±0.61）μg/mL，其他4个黄酮类化合物均没有活性。
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表 1 黑果悬钩子不同萃取部位和化合物的PTP1B抑制活性 Table 1 PTP 1B inhibitory activities of different fractions and compounds from R. caesius |
4 结论
利用硅胶、SephadexLH20凝胶柱色谱和半制备液相色谱等色谱法从黑果悬钩子茎叶中分离得到7个化合物，利用核磁共振波谱分析鉴定了它们的结构。从黑果悬钩子茎的醋酸乙酯部位分离得到5个化合物，分别是柚皮苷、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、异槲皮苷、金丝桃苷、(−)-表儿茶素-3-O-没食子酸。从黑果悬钩子叶醋酸乙酯部位分离得到2个化合物，分别是类叶升麻苷、鞣花酸。所有化合物都是首次从该植物中分离得到，而且都是从茎、叶的醋酸乙酯部位分离得到，但是单体化合物的PTP1B抑制活性均低于醋酸乙酯部位的活性，可能醋酸乙酯部位具有PTP1B抑制活性的高活性单体化合物尚未分离得到，值得进行更深入的研究。
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