化学治疗是治疗恶性肿瘤的主要手段之一，可延缓肿瘤的进展从而延长患者的生存期。但是化疗引起的毒副反应却是困扰绝大多数患者的主要原因。其中骨髓抑制最为常见^[1]，约90%以上的化疗药物均可导致不同程度的骨髓抑制，包括外周血单系或多系的下降，严重时不仅可中断疗程影响疗效，甚至可能会造成严重感染、出血等并发症，甚至导致死亡。西医针对化疗后骨髓抑制的治疗方法多采用各种造血细胞集落刺激因子、成分输血及造血干细胞移植等，效果良好，但费用昂贵，且副反应较多。在中医辨证论治的理论指导下，用于治疗化疗引起的骨髓抑制的传统中药，主要以补虚类药物为主，补虚药又分为补气药、补血药、补阴药、补阳药4类，其次为活血化瘀药^[2]。治疗原则当以扶正补益为主，以补气养血、滋补肾精为法，总以补益为要，达到补气、养血、滋阴、扶正之目的，从而促进、改善骨髓造血功能，升高白细胞，进而增强免疫功能^[3]。近年来随着应用中医药防治化疗后骨髓抑制逐渐受到重视，中医药拮抗化疗性骨髓抑制的实验研究也在不断深入，在阐明其作用机制时，不仅涉及了外周血血象，而且深入到造血因子、骨髓微环境等各个血液学角度。本研究以扶正解毒祛瘀法为原则的消岩汤为研究对象，实验研究表明消岩汤具有抗肺癌作用，可以诱导肺腺癌A549细胞凋亡^{[4, 5]}。方中黄芪、太子参滋阴益气，扶正抗癌；夏枯草、生牡蛎、白花蛇舌草清热解毒、软坚散结；姜黄、郁金行气散结、活血祛瘀；蜂房搜剔络脉中之瘀毒。前期临床及基础研究表明，消岩汤于化疗前应用能有效缩小瘤体大小，增加抑瘤率，显著改善患者生活质量，增强患者的免疫功能，其中于化疗前7 d应用消岩汤效果最佳^{[6, 7, 8]}。本实验通过荷瘤动物实验，从外周血血细胞比例、免疫功能及细胞因子相关指标等方面研究消岩汤对荷瘤小鼠化疗后骨髓抑制的影响，分析消岩汤治疗骨髓抑制的机制，为进一步研究消岩汤缓解骨髓抑制临床研究奠定基础。

SPF级健康近交系C57BL/6小鼠，50只，雌性，6～8周龄，体质量（20±2）g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，动物合格证号SCXK-（军）2012-0004。饲养于天津医科大学肿瘤医院实验动物中心，动物分笼饲养，自由摄食、饮水，室温（20±2）℃，湿度20%～40%。

小鼠Lewis肺癌细胞，天津医科大学肿瘤医院免疫室保存传代。

DMEM培养液及小牛血清购自Hyclone公司；血细胞稀释液、红细胞裂解液、白细胞介素-3（IL-3）、白细胞介素-6（IL-6）、促红细胞生成素（EPO）、粒细胞巨噬细胞刺激因子（GM-CSF）ELISA kit试剂盒均购自美国Biolegend公司；流式抗体PerCP-CD₃、FITC-CD₃、PerCP-CD₄、PE-CD₄、FITC-CD₈均购自美国Biolegend公司。

消岩汤组方药材为黄芪30 g、太子参15 g、郁金10 g、姜黄10 g、夏枯草15 g、白花蛇舌草15 g、生牡蛎30 g、蜂房15 g。消岩汤水煎液自制，生药共计140 g先用凉水浸泡30 min，用水量为生药量的8倍，武火煎沸后，文火煎30 min，滤出药液；再加6倍量水煎沸后文火煎20 min，滤出药液，合并2次煎液，浓缩至300 mL，生药量为0.42 g/mL。重组人粒细胞集落刺激因子注射液（吉粒芬），每支75 μg，0.3 mL，杭州九源基因工程有限公司；注射用环磷酰胺，每支200 mg，江苏恒瑞医药股份有限公司生产，溶于10 mL生理盐水中。

Lewis肺癌瘤株接种于C57BL/6近交系小鼠右腋部皮下14 d，无菌剥离荷瘤小鼠皮下瘤块，将瘤组织剪碎，研磨，用生理盐水稀释，调整细胞浓度为1×10⁷个/mL，于小鼠右腋部sc 0.2 mL/只制备Lewis肺癌小鼠模型。而后根据相关报道^[9]和课题组前期的实验经验，制备荷瘤小鼠化疗后骨髓抑制模型。具体操作为荷瘤小鼠ip环磷酰胺（CTX）100 mg/(kg·d)，连续3 d均在相同时间内注射，第3天停药后4 h模型即成（依据CTX药动学过程，4 h后药物活性消失）。对照组按照0.02 mL/g用药量，ip同体积生理盐水。

50只小鼠，10只为对照组，另外造模的40只小鼠随机分为模型组、消岩汤组、吉粒芬组、消岩汤与吉粒芬联用组（联用组），每组10只。消岩汤组给予消岩汤水煎液18.2 g/(kg·d)^[10]，每次0.2 mL，每天分2次ig给药，连续7 d；吉粒芬组sc吉粒芬12 μg/kg，连用7 d；联用组ig消岩汤及sc吉粒芬，连续7 d。

各组小鼠末次给药1 h后称体质量，摘眼球取血。取2 mL全血用EDTA钾（1.5～2.2 mmol/L）抗凝，用全自动血细胞分析仪测定外周血白细胞总数（WBC）、红细胞数（RBC）、血红蛋白量（Hb）、血小板数（PLT）。采集各组小鼠血液1 mL，分别加入含肝素钠的离心管中，1 000 r/min离心10 min，收集各组血清0.1 mL，加入1 mL 10%溶血素，轻轻摇匀，静置10 min，每管加2 mL的PBS液洗涤2次，分别加入相应的荧光素标记抗体，即FITC-抗CD₃、PE-抗CD₄和PE-抗CD₈，于4 ℃，避光反应20 min，采用流式细胞仪检测CD₃⁺T细胞数量、CD₄⁺和CD₈⁺T细胞亚群分类、调节性T细胞（Treg）数量、自然杀伤细胞（NK）数量。剩余血液取血清，用ELISA方法测定各组小鼠血清中IL-3、IL-6、EPO和GM-CSF水平。

采用SPSS 22统计软件处理，所有实验数据均用x±s表示，用One-way ANOVA比较多组间均值差异，q检验比较两组间差异显著性。

如表 1所示，与对照组比较，模型组小鼠外周血WBC、RBC、Hb、PLT数值降低，尤以WBC减少为主（P＜0.05），说明荷瘤小鼠经过化疗后出现骨髓抑制；与模型组比较，消岩汤组和吉粒芬组小鼠外周血WBC均显著增加（P＜0.05），联用组小鼠外周血WBC增加较单用组更明显（P＜0.05）。吉粒芬组小鼠外周血RBC、Hb、PLT均较模型组显著增加（P＜0.05），联用组较吉粒芬组RBC、PLT增加更显著（P＜0.05）。

表 1(Table 1)

表 1 各组小鼠血常规指标比较 Table 1 Comparison on routine blood index of mice in each group (x±s, n = 10) 组别 剂量/(g·kg−1·d−1) WBC/(×109·L−1) RBC/(×1012·L−1) Hb/(g·L−1) PLT/(×109·L−1) 对照 — 9.93±0.31 10.09±0.12 159.00± 8.54 445.00± 9.54 模型 — 2.18±0.20 8.48±1.15 127.00± 3.61 309.33± 9.61 消岩汤 18.2 4.25±0.06*# 8.10±1.31 130.33±13.78 324.00±33.29 吉粒芬 1.2×10−5 7.96±0.25# 9.49±0.80# 150.33± 5.51# 344.00±11.14*# 联用 18.2+1.2×10−5 9.49±0.30#△ 10.48±1.17#△ 157.00±12.53# 420.67±18.88#△ 与对照组比较：*P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05；与吉粒芬组比较：△P＜0.05，下同 *P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs model group; △P < 0.05 vs rhG-CSF group,same as below

表 1 各组小鼠血常规指标比较 Table 1 Comparison on routine blood index of mice in each group

如表 2所示，与对照组比较，模型组与吉粒芬组CD₃⁺CD₈⁺T、CD₄⁺CD₈⁺T、CD₄/CD₈明显降低，消岩汤组Treg明显减少，差异均显著（P＜0.05），说明模型小鼠免疫系统受到影响；在CD₃⁺CD₈⁺T、CD₄⁺CD₈⁺T方面，与模型组比较，消岩汤组、联用组明显升高（P＜0.05），吉粒芬组无显著作用（P＞0.05）。与吉粒芬组比较，联用组Treg细胞明显减少，差异显著（P＜0.05）。各组NK细胞比较差异不显著（P＞0.05）。

表 2(Table 2)

表 2 各组小鼠外周血免疫细胞亚群比较 Table 2 Comparison on immune cell subsets in peripheral blood of mice in each group (x±s,n = 10) 组别 剂量/ (g·kg−1·d−1) CD3+CD8+T/% CD4+CD8+T/% (CD4/CD8)/% Treg/% NK/% 对照 — 9.84±0.61 8.92±0.12 1.05±0.02 0.18±0.01 2.22±0.01 模型 — 5.43±0.84 5.30±0.17 0.52±0.31 0.15±0.01 2.06±0.06 消岩汤 18.2 9.68±0.31# 9.34±0.46# 0.56±0.05 0.14±0.01 2.13±0.02 吉粒芬 1.2×10−5 5.16±0.30 5.52±0.19 0.65±0.10 0.18±0.01 2.25±0.06 联用 18.2+1.2×10−5 9.70±0.23# 8.89±0.52# 0.70±0.05 0.10±0.02△ 2.14±0.02

表 2 各组小鼠外周血免疫细胞亚群比较 Table 2 Comparison on immune cell subsets in peripheral blood of mice in each group

如表 3所示，与对照组比较，模型组小鼠血清中IL-3、IL-6水平明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，消岩汤组、联用组均能升高IL-3、IL-6、EPO、GM-CSF水平（P＜0.05），吉粒芬组显著升高IL-3、IL-6水平（P＜0.05）。

表 3(Table 3)

表 3 各组小鼠血清细胞因子水平 Table 3 Changes on serum cytokine of mice in each group (x±s,n = 10) 组别 剂量/(g·kg−1·d−1) IL-3/(pg·mL−1) IL-6/(pg·mL−1) EPO/(pg·mL−1) GM-CSF/(pg·mL−1) 对照 — 180.65±1.07 162.93±3.32 33.54±1.52 260.19± 4.00 模型 — 129.91±1.25 113.30±5.79 29.60±0.72 194.67± 5.26 消岩汤 18.2 167.33±8.88*# 150.48±0.69# 36.27±0.86*# 242.21±10.40*# 吉粒芬 1.2×10−5 140.76±4.94*# 133.41±1.91*# 28.18±0.32 210.65±10.61 联用 18.2+1.2×10−5 178.58±2.27# 181.36±6.01*# 25.02±1.84# 265.93± 2.29#

表 3 各组小鼠血清细胞因子水平 Table 3 Changes on serum cytokine of mice in each group

骨髓抑制是化疗常见的毒副反应，常引起被动减量或停药，因此骨髓抑制被认为是化疗成功与否的关键。除激素、博来霉素、L-门冬酰胺酶以外，大部分抗癌药物均会引起不同程度的WBC下降、PLT减少以及贫血等，其中以WBC为主，又以粒细胞减少为著^[11]。基因重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）和基因重组巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）是目前常见的两种造血细胞集落刺激因子。研究^[12]表明rhG-CSF参与化疗后骨髓抑制的治疗，可明显缩短患者WBC数目恢复至正常水平的时间。李娇等^[13]回顾性调查天津医科大学肿瘤医院进行多西紫杉醇75 mg/m²，表柔比星65 mg/m²与环磷酰胺500 mg/m²（TEC）化疗方案的浸润性乳腺癌患者发现，与第1个周期末次给予化疗药后24～48 h内未给予rhG-CSF的患者相比，预防性给予rhG-CSF的患者外周血WBC＜4.0×10⁹/L的发生率和中性粒细胞绝对值（ANC）＜2.0×10⁹/L的发生率明显降低，化疗延迟率和延迟时间明显降低，以及发热性中性粒细胞减少症（FN）的发生率和用药后不良反应均显著减低，差异有统计学意义（P＜0.05）。并认为对于浸润性乳腺癌患者，第1周期化疗后24～48 h内预防性给予rhG-CSF，能降低白细胞减少症的发生，减轻骨髓抑制的程度及持续时间，降低FN的发生风险，且能减少rhG-CSF用药不良反应的发生。雷双根等^[14]认为rhG-CSF治疗乳腺癌术后化疗后骨髓抑制，能有效控制肿瘤术后化疗后骨髓抑制的发生，减少感染机会，能保障化疗的顺利进行。临床防治骨髓抑制较常用细胞因子，虽然作用迅速，但维持时间较短，且易引起发热、骨痛等不良反应，同时加强了化疗药物引起骨髓细胞损害、刺激恶性细胞生长的可能性^[15]。

现代中医研究认为，化疗所致骨髓抑制是恶性肿瘤在人体虚损的基础上再外加化疗药物带来的“毒邪”侵犯，故更耗伤人体正气，导致脏腑亏虚、气血两虚。以扶正解毒祛瘀法为原则的消岩汤，其中黄芪、太子参、夏枯草、生牡蛎、白花蛇舌草、姜黄、郁金、蜂房等组成可以益气扶正，解毒祛瘀。近年来随着应用中医药防治化疗后骨髓抑制逐渐受到重视，中医药拮抗化疗性骨髓抑制的实验研究也在不断深入。在CD₃⁺CD₈⁺T、CD₄⁺CD₈⁺T方面，与模型组相比，消岩汤组、联用组CD₃⁺CD₈⁺T、CD₄⁺CD₈⁺T明显提高，吉粒芬组无显著差异（P＞0.05）。T淋巴细胞亚群数量和比率的动态平衡是一个复杂的过程，其调节机制并不十分清楚，而CD₄⁺T和CD₈⁺T淋巴细胞的失调是许多疾病的主要表现特征。CD₄⁺是辅助性T细胞表面的标志分子，一般认为CD₄⁺Th细胞可以分泌IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、γ干扰素（IFN-γ）等细胞因子，可诱导和增强细胞和体液免疫应答；CD₈⁺T细胞是杀伤性T细胞表面的标志分子，包括抑制性T淋巴细胞和杀伤性T淋巴细胞，可以分泌抑制因子，抑制细胞毒性T细胞（CTL）和B淋巴细胞起到负调节作用。本研究发现与吉粒芬组比较，联用组Treg细胞明显减少，提示消岩汤有可能影响了Treg细胞的表达，进而发挥免疫调节作用。Treg细胞可以识别抑制自身肿瘤细胞的效应细胞的发育和活化，在介导机体肿瘤免疫耐受中起着重要作用，多项研究也表明，Treg细胞的数量与肿瘤的预后呈负相关^{[16, 17]}。IL-3、GM-CSF是造血干细胞增殖分化的调节因子，通过与靶细胞表面的受体结合传递生长、分化信号，调控造血干细胞生存并向各系血细胞分化成熟^{[18, 19]}。许淑芬等^[20]研究表明中药能够刺激人IL-3、GM-CSF的表达，并相互协同作用，从多途径、促进造血干细胞的增殖与分化。IL-6不仅能够刺激粒系-单核细胞系集落形成，还可协同促红细胞因子促进红细胞的形成，同时对巨核细胞成熟释放血小板也有重要影响^[21]。早期红系祖细胞（BFU-E）的增殖受EPO、IL-3、巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）等多种因子的调控，晚期红系祖细胞（CFU-E）则主要受EPO的调节。EPO可直接作用于激活的B细胞，促进B细胞增殖。因此，本研究采用Lewis肺癌小鼠骨髓抑制模型，结果表明消岩汤联合吉粒芬能改善骨髓抑制小鼠的外周血象，以及T细胞亚群的免疫功能，改善化疗后骨髓抑制程度，这可能与其促进小鼠血清造血因子IL-3、IL-6、EPO、GM-CSF的生成，发挥调节、促进骨髓造血功能的作用，从而缓解化疗导致的骨髓抑制程度有关。