肺癌是全球死亡率最高的肿瘤疾病之一，近些年其发病率和死亡率均明显增加。在男性肿瘤患者中，肺癌已居首位；在女性中发病率也迅速升高。大量临床研究证实，中医药在抗肺癌方面具有一定的治疗效果，不但可以改善临床症状，还能提高生活质量，延长患者的带瘤生存期^[1]。因此，研究能够治疗肺癌的中药具有重要的临床意义。肺癌的病因至今尚不完全明确^[2]。目前，中医药抗肺癌作用的主要机制有诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成及侵袭转移和调节机体免疫功能^[3]。

自噬是在进化过程中高度保守的、广泛存在于真核细胞内的一种溶酶体依赖性的降解途径。自噬的生理功能包括清除细胞内受损的蛋白质和（或）衰老的细胞器，调节固有免疫和适应性免疫等^[4]。近年来研究表明，自噬与肿瘤的发生、发展有着密切联系^[5]，自噬具有抑制肿瘤的作用^[6]，尤其是在肿瘤形成的早期阶段^[7]。

麦冬为百合科沿阶草属Ophiopogon Ker-Gawl.植物麦冬Ophiopogon japonicus (Thunb.) Ker-Gawl. 的干燥块根。麦冬的主要药用成分甾体皂苷可用于治疗心肌缺血、血栓、高血糖等疾病^{[8, 9]}，目前关于麦冬抗肺癌效果的研究报道较少，本实验通过小鼠Lewis肺癌模型，研究麦冬的抗肺癌活性，并通过A549肺癌细胞模型来进行麦冬醇提物抗肺癌活性及调节自噬作用机制研究。

C57BL/6小鼠60只，雌性，体质量（20±3）g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证号SCXK（沪）2015-0002。实验动物饲养于江苏省中医药研究院SPF级实验动物中心，每笼10只，饲料与饮水保持充足。室温（25±1）℃，湿度（65±5）%，每天光照12 h，黑暗12 h。小鼠Lewis肺癌瘤株、A549肺癌瘤株，均购于中国医学科学院肿瘤研究所。

LABCONCO Class Ⅱ生物安全柜（美国Labconco公司）；HERA Cell 150 CO₂培养箱（美国热电集团）；COIC XDS-1B相差倒置显微镜（重庆光电仪器总公司）；Anke TDL-40B离心机（上海安亭科学仪器厂）；HH-60数显恒温搅拌循环水箱（常州国华仪器有限公司）；便携式电子天平-PL1502-S（上海Mettler Tledo仪器有限公司）；T06001天平（天津天马恒基仪器有限公司）；紫外-ZXC型紫外消毒车（江苏巨光光电科技有限公司）；Agilent1200 高效液相色谱仪（Agilent Technologies）。

麦冬（川）购于亳州万珍中药饮片厂，批号20150108，经南京中医药大学吴德康教授鉴定为麦冬Ophiopogon japonicus (Thunb.) Ker-Gawl. 的干燥块根。顺铂（DDP，南京制药有限公司，规格20 mL/瓶，质量浓度为13 mg/mL，批号20150204）；氯化钠注射剂（南京小营药业有限公司，规格100 mL/瓶，批号12012120808）；甲基麦冬二氢高异黄酮B、麦冬甲基黄烷酮A、麦冬皂苷D对照品（批号分别为110867-201406、110852-201406、110766-201519，质量分数≥98%，中国食品药品检定研究院）。

2 方法 2.1 麦冬醇提物的制备

称取1 kg麦冬，加入70%乙醇10 L煮沸1 h，共2次，4层纱布滤过后，回收乙醇，5 000 r/min离心15 min，取上清，高压蒸汽灭菌后，于4 ℃冰箱中贮存备用。

精密称取氧化甲基麦冬二氢高异黄酮B、麦冬甲基黄烷酮A和麦冬皂苷D对照品，置10 mL棕色量瓶中，甲醇定容至刻度，得到质量浓度分别为14、20、123 μg/mL混合对照品溶液。

色谱柱为Prevail C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为A（乙腈）-B（纯水），梯度洗脱条件：0～10 min，20% A；10～20 min，20%～30% A；20～25 min，30% A；25～30 min，30%～50% A；30～60 min，50%～80% A；60～70 min，80%～100% A。体积流量1 mL/min；柱温25 ℃；检测波长210 nm；进样量10 μL。混合对照品和麦冬醇提物，HPLC图谱见图 1。

1-麦冬甲基黄烷酮A 2-甲基麦冬二氢高异黄酮B 3-麦冬皂苷D 1-methylophiopogonanone A 2-methylophiopogonanone B 3-ophiopogonin D 图 1 混合对照品 (A) 和麦冬醇提物 (B) HPLC图 Fig.1 HPLC of reference substances (A) and extract of OJAE (B)

精密量取对照品溶液0.4、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得到不同质量浓度的对照品溶液，按“2.3.1”项的色谱条件，以对照品峰面积（Y）对其质量浓度（X，μg/mL）进行线性回归，得回归方程，见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 麦冬中各对照品回归方程 Table 1 Regression equations of each standard of OJAE 化合物 回归方程 R2 线性范围/(μg∙mL-1) 甲基麦冬二氢高异黄酮B Y＝11.74 X+4.74 0.999 9 4.00～128.00 麦冬甲基黄烷酮A Y＝22.10 X－180.44 0.999 9 3.56～114.00 麦冬皂苷D Y＝6.41 X+32.42 0.999 9 3.28～105.00

表 1 麦冬中各对照品回归方程 Table 1 Regression equations of each standard of OJAE

取甲基麦冬二氢高异黄酮B、麦冬甲基黄烷酮A和麦冬皂苷D对照品稀释4倍溶液进行精密度考察。按色谱条件连续5次进样；计算峰面积的RSD分别为0.39%、0.56%、0.23%，表明仪器的精密度良好。

精密称取麦冬醇提物样品平行制备6份供试品，连续进样测定甲基麦冬二氢高异黄酮B、麦冬甲基黄烷酮A和麦冬皂苷D质量分数的RSD分别为1.24%、1.35%和1.33%，说明其具有较好的重复性。

取麦冬醇提物样品，分别在0、2、4、8、12、24 h时进样测定，结果甲基麦冬二氢高异黄酮B、麦冬甲基黄烷酮A和麦冬皂苷D的峰面积基本不变，RSD分别为1.10%、1.41%和1.06%，说明供试品溶液在24 h内各成分稳定性较好。

取6份已测定麦冬醇提物样品，吸取1.0 mL，置10 mL量瓶中，精密加入甲基麦冬二氢高异黄酮B、麦冬甲基黄烷酮A和麦冬皂苷D对照品，蒸馏水定容至刻度，计算甲基麦冬二氢高异黄酮B、麦冬甲基黄烷酮A和麦冬皂苷D的平均加样回收率为97.21%、98.71%和98.47%。RSD分别为1.51%、1.27%、1.16%。

取麦冬醇提物制备供试品溶液，按照上述色谱条件测定峰面积，计算甲基麦冬二氢高异黄酮B、麦冬甲基黄烷酮A和麦冬皂苷D的质量分数，结果显示麦冬醇提物中甲基麦冬二氢高异黄酮B、麦冬甲基黄烷酮A和麦冬皂苷D的质量分数分别为0.005 1%、0.007 5%和0.006 4%。

Lewis肺癌细胞培养至对数生长期，用0.25%胰酶消化，于37 ℃，5% CO₂培养箱中消化2 min，待细胞呈流沙样流下时，迅速加入完全培养基终止消化，吹打细胞转移至离心管中（2 000 r/min离心2 min），收集底部细胞。用灭菌PBS将细胞制备成细胞悬液，显微镜下计数，调节细胞密度至1×10⁷个/mL。接种于4只小鼠右腋下，取接种Lewis肺癌细胞5 d的小鼠，处死并于75%乙醇中浸泡2 min，无菌条件取瘤组织中生长良好新鲜部分，按肿瘤质量（g）与细胞培养基（mL）1:10比例研磨成匀浆，多次离心弃去上清，最后用培养基混匀制成20 mL肺癌瘤细胞的混悬液。

分别于40只C57BL/6小鼠右侧腋下皮下接种0.2 mL肺癌瘤细胞悬液。实验中10只未接种肿瘤细胞的小鼠作为对照组，接种小鼠随机分为4组：模型组、阳性药组（顺铂）、麦冬醇提物高剂量（10 g/kg）组、麦冬醇提物低剂量（5 g/kg）组。每组10只小鼠。麦冬醇提物高、低剂量组每天分别ig 0.2 mL对应的麦冬醇提物。对照组和模型组小鼠每天ig生理盐水0.2 mL，阳性药组ip顺铂，每只小鼠注射0.2 mL（相当于3 mg/kg），现用现配。连续给药11 d，末次给药1 h后测定肿瘤体积，处死小鼠。剥离肿瘤，分别称瘤质量和体质量，计算抑瘤率。

抑瘤率＝1-给药组平均瘤质量/模型组平均瘤质量

运用小动物专用高频彩色超声仪对小鼠肿瘤的体积进行测量，采用加拿大Visual Sonics产的Vevo 2100高分辨小动物超声成像系统（MS 400探头，频率设置为30 MHz，探测深度为8 mm，宽度为10.36 mm），小鼠采取吸入2%异氟烷麻醉，仰卧位固定于37 ℃恒温加热板上，探头置于小鼠右腋下肿瘤处，记录各切面的面积，并将3个切面组合成一张三维图，从而计算肿瘤体积。

将剥离下来的肿瘤组织制成石蜡病理切片，将石蜡病理切片放置于65 ℃恒温箱中2 h后，二甲苯溶液进行浸泡脱蜡，无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇进行梯度浸泡脱水后，用重蒸水漂洗3～5次后进行抗原修复。石蜡病理切片在柠檬酸缓冲溶液中煮沸后冷却10 min，然后将柠檬酸缓冲溶液冲洗掉。Elivison两步法进行免疫组织化学染色，使用DM2500光学显微镜进行照片的拍摄。

A549细胞用RPMI 1640不完全培养基（含有10%胎牛血清、2 g/L葡萄糖、0.3 g/L L-谷氨酰胺、2 g/L碳酸氢钠、80 U/mL青霉素、0.08 mg/mL链霉素）培养。A549细胞放在培养箱（37 ℃，5% CO₂）中培养。培养基需要每天换1次，每2～3天传代1次。

将A549细胞均匀接种至培养瓶，过夜贴壁后加入终质量浓度为1 mg/mL的麦冬醇提物（MTT筛选麦冬醇提物1 mg/mL时细胞抑制率＞50%），以未加麦冬醇提物的细胞作为对照组。24 h后，收集所有悬浮和贴壁细胞。先用0.25%胰蛋白酶消化细胞，制成单细胞悬液，1 000 r/min离心10 min，弃上清后用预冷的PBS洗2次，然后沿管壁缓缓加入预冷的2.5%戊二酸，注意加液时一定不要冲散细胞团，在4 ℃固定90 min。用PBS漂洗后，再用1%四氧化锇在4 ℃固定30 min，再用PBS漂洗。将细胞用50%～100%（以10%为梯度）的系列乙醇和纯丙酮脱水，然后用Epon812树脂包埋。将包埋块用切片机切成超薄切片，并用醋酸双氧铀和梓檬酸铅染色后在透射电镜下观察细胞超微结构变化。

将消化下来的细胞用PBS缓冲溶液冲洗2遍，用RIPA裂解液裂解组织（400 μL IRI-PA+4 μL IPMSF）提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，取50 μg蛋白样品进行SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳。将电泳后的蛋白转移至PVDF膜，封闭液封闭（4 ℃过夜），分别用LC3 Ⅱ抗体、LC3 Ⅰ抗体、Beclin-1抗体（1:200）和β-actin兔多克隆抗体（1:1 000）孵育，室温轻摇180 min后，再用TBS（Tris-HCl缓冲盐溶液）洗涤3次（10 min/次）后，再分别用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（1:2 000）室温孵育120 min，TBS洗涤3次（15 min/次），最后X线片曝光、显影和定影后观察结果。

采用miRNeasy Mini Kit（美国Qiagen公司）提取A549细胞RNA，RNA溶于20 μL RNAase-free H₂O中，并测纯度和浓度，A₂₆₀/A₂₈₀在1.8～2.0内，反转录反应采用Takara公司的反转录试剂盒，总体系为20 μL，其中Prime Script RT Master Mix 4 μL，RNA溶液16 μL，取300 ng总RNA上样量，反应条件：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s；4 ℃冷却，RT-PCR采用了Takara公司引物及SYBR Premix EX Taq Ⅱ和ABI 7500型基因扩增仪，总体系20 μL，其中10 μL SYBR Premix EX Taq Ⅱ，6 μL ddH₂O，相应上、下游引物各1 μL，2 μL cDNA模板，以内源性β-actin作参照，扩增条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃、5 s，64 ℃退火延伸34 s，共45个循环。

数据表示为x±s的形式，SPSS 16.0统计软件分析数据，计量资料采用单因素方差分析，组间比较采用LSD，方差不齐用H检验，组间比较用N检验。

连续ig给药11 d，通过小动物专用高频彩色超声仪对肿瘤体积进行测量，结果见图 2，麦冬醇提物10、5 g/kg组小鼠的肿瘤体积分别为（433.28±130.66）、（587.46±148.12）mm³，与模型组[（867.56±150.87）mm³]相比显著性降低（P＜0.05、0.01）。可以看出，麦冬醇提物具有显著抑制肿瘤生长的作用。随后将各组小鼠处死，解剖观察见肿瘤质硬有薄层膜状结构包绕表面，且有血管生长分布。麦冬醇提物高、低剂量及顺铂对荷瘤小鼠的瘤质量均有不同程度的抑制作用（表 2）。以抑瘤率评价药物抗肿瘤疗效的评价标准：抑瘤率＜30%为无效；抑瘤率≥30%，并且与模型组比较差异显著（P＜0.05）为有效。因此可认为麦冬醇提物具有抗肿瘤的效果。

与模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01，下同 *P < 0.05 **P < 0.01 vs model group,same as below 图 2 麦冬醇提物对Lewis肺癌小鼠肿瘤体积的影响 (x±s, n = 10) Fig.2 Effect of OJAE on tumor volume of mice with Lewis lung cancer (x±s,n = 10)

表 2(Table 2)

表 2 麦冬醇提物对Lewis肺癌小鼠肿瘤质量的影响 Table 2 Effect of OJAE on tumor weight of mice with Lewis lung cancer (x±s, n = 10) 组别 剂量/ (g∙kg−1) 瘤质量/g 抑瘤率/% 模型 — 4.07±1.01 — 顺铂 0.003 0.75±0.25** 81.57±6.44 麦冬醇提物 10 2.03±0.79** 50.49±5.83 5 2.75±0.70 32.43±3.78

表 2 麦冬醇提物对Lewis肺癌小鼠肿瘤质量的影响 Table 2 Effect of OJAE on tumor weight of mice with Lewis lung cancer

Ki67和P53蛋白是常用的检测癌细胞数量以及活跃程度的指标^[9]。从图 3可以看出，与对照组相比，模型组Ki67蛋白的表达显著增强，P53蛋白的表达显著减弱，而麦冬醇提物高、低剂量组与模型组相比，Ki67蛋白的表达显著降低，P53蛋白的表达显著增强，从而说明麦冬醇提物高、低剂量组小鼠的肺癌细胞得到一定程度的抑制，进一步说明了麦冬醇提物具有一定的抗肺癌效果。

图 3 麦冬醇提物对Lewis肺癌小鼠肿瘤组织中Ki67和P53蛋白表达的影响 Fig.3 Effect of OJAE on Ki67 and P53 protein expression in tumor tissue of mice with Lewis lung cancer

透射电镜是诊断自噬的可靠方法，本实验采用透射电镜检测麦冬醇提物干预后A549细胞。如图 4所示，对照组细胞显示正常的细胞质、细胞器和细胞核形态。麦冬醇提物处理组细胞质中出现大量的、大小不等的自噬泡，并可在电镜下见到包裹有线粒体的自噬体，而细胞核未见明显异常。结果表明麦冬醇提物处理后A549细胞有自噬发生。

箭头表示自噬泡 the arrow on behalf of autophagy bubble 图 4 麦冬醇提物对A549细胞自噬体形成的影响Fig.4 Effect of OJAE on inducing autophagy in A549

电镜结果表明，在麦冬醇提物抗肺癌过程中，自噬被激活，而Beclin-1是第一个被确认的哺乳动物自噬基因，是自噬形成的早期阶段所必需的^[10]。LC3是自噬标志物，自噬形成时，胞浆型LC3（即LC3 Ⅰ）会酶解掉一小段多肽，转为LC3 Ⅱ，LC3 Ⅱ与LC3 Ⅰ的比值越大说明自噬的水平越高^[11]。根据图 5和6可以看出，与对照组相比，麦冬醇提物处理过的A549细胞中的Beclin-1蛋白表达增强（P＜0.05），LC3 Ⅱ与LC3 Ⅰ的比值显著增加（P＜0.01），进一步说明麦冬醇提物能够诱导A549肺癌细胞产生自噬。

与对照组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01，下同 #P < 0.05 ##P < 0.01 vs control group,same as below 图 5 麦冬醇提物对A549细胞中Beclin-1和LC3蛋白表达的影响 (x±s, n = 6)Fig.5 Effect of OJAE on Beclin-1 and LC3 protein expression in A549 cells (x±s,n = 6)

图 6 麦冬醇提物对A549细胞中Beclin-1和LC3 mRNA表达的影响 (x±s, n = 6) Fig.6 Effect of OJAE on Beclin-1 and LC3 mRNA expression in A549 cells (x±s,n = 6)

本实验制备小鼠Lewis肺癌模型，观察麦冬醇提物对小鼠Lewis肺癌生长的影响。研究发现，麦冬醇提物可抑制肿瘤的体积和质量，这表明麦冬醇提物具有一定的抑制小鼠Lewis肺癌肿瘤生长的效果。

Ki67是细胞活性和增殖的一种指标^[12]，其基因定位于第10号染色体，其蛋白质产物定位于细胞核，由相对分子质量345 000和395 000两条多肽链组成，其在G₁后期开始出现，在S期和G₂期逐渐升高，M期达到高峰，有丝分裂结束后迅速降解消失，G₀期无表达。Ki67蛋白表达量的多少与细胞的增殖、分化密切相关，目前常被用来作为肿瘤发生、发展及细胞活性的指标。P53蛋白是一种肿瘤抑制蛋白^[13]，在所有恶性肿瘤中，50%以上会出现该基因的突变，像所有其他肿瘤抑制因子一样，P53蛋白在正常情况下对细胞分裂起着减慢或监视的作用。P53基因是细胞生长周期中的负调节因子，与细胞周期的调控、DNA修复、细胞分化、细胞凋亡等重要的生物学功能有关^[14]。通过蛋白免疫印迹法的检测结果可以看出麦冬醇提物对C57BL/6小鼠Lewis肺癌的癌细胞具有一定的抑制作用，从而进一步说明麦冬醇提物具有一定的抗肺癌作用。

本实验进一步从自噬的角度研究麦冬醇提物抗肺癌的机制。首先通过透射电镜观察细胞中自噬体的形成，可以看出麦冬醇提物处理过的A549细胞细胞质中出现了自噬泡，这说明麦冬醇提物可诱导A549细胞的自噬作用。

LC3是至关重要的自噬蛋白并且被用作自噬的一个标记物^[15]。在自噬过程中，LC3 Ⅰ会酶解掉一小段多肽转变为LC3 Ⅱ。所以，LC3 Ⅱ与LC3 Ⅰ的比值被作为评价自噬水平的一个标准。Beclin-1又称BECN-1，是最早被发现的哺乳动物调控自噬性死亡的基因，与酵母自噬基因ATG6同源，位于人染色体17q21上，编码一个含有450个氨基酸，分子量是60 KD的蛋白质，是介导其他自噬蛋白定位于前自噬小体的关键因子，参与哺乳动物自噬体早期形成的调控^[16]。本实验通过蛋白印迹法和免疫组织化学法检测细胞中的Beclin-1和LC3蛋白的表达，来进一步研究麦冬醇提物是否诱导A549细胞自噬。实验结果显示，麦冬醇提物处理过的A549细胞中的LC3 Ⅱ与LC3 Ⅰ的比值显著增大，并且Beclin-1的表达明显增强，进一步说明麦冬醇提物诱导A549细胞产生自噬。

综上所述，本实验发现麦冬醇提物对肺癌具有一定的抑制作用，并且麦冬醇提物能够诱导肺癌细胞产生自噬，从而发现自噬在麦冬醇提物抗肺癌过程中的作用，揭示了诱导自噬是麦冬醇提物抗肺癌的机制之一，从而为研究麦冬醇提物抗肺癌机制提供了一定的实验基础。