茜草炭carbonized Rubiae Radix et Rhizoma （RRR）由茜草科（Rubiaceae）茜草属Rubus L. 植物茜草Rubia cordifolia L. 干燥根和根茎经炒炭炮制而成^[1]，炒炭后寒性下降，涩性增加，止血作用增强，临床上主要用于治疗由瘀血阻滞引起的吐血、崩漏、外伤出血等出血症^[2]。茜草炭现代研究较少，研究方向集中在炮制前后化学成分以及药理作用变化^{[3, 4, 5]}，药理研究多在正常动物身上进行，割裂了中医“病症”与中药及其炮制品之间的关联性，孤立地去评价药物。且现代研究成果无法完全揭示茜草炭化瘀止血的物质基础及作用机制。为了进一步探究茜草炭化瘀止血物质基础及作用机制，本实验观察茜草炭醇提物、醇提后水提物、醇提加水提物、水提物4种不同提取物对急性血瘀模型大鼠的影响，初步确定茜草炭化瘀止血作用的物质基础。

MR-16型多环血栓检测仪（上海高新技术研究所）；HANGPING FA1104N型十万分之一电子分析天平；SA-5000半自动血流变测试仪（北京中勤世帝科学仪器有限公司）；LG-PABER半自动凝血分析仪（北京世帝科学仪器公司）；TDZ4-WS台式低速离心机（上海安亭科学仪器厂）；352型酶标仪（芬兰Labsystems Multiskan MS）；Waters I Class超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；KH-500B超声机（昆山禾创超声仪器有限公司）。

羧甲基纤维素钠（CMC-Na）、枸橼酸钠、水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司）；凝血四项试剂盒：凝血酶时间（TT，批号STY20301-52）、凝血酶原时间（PT，批号STY20101-89B）、活化部分凝血活酶时间（APTT，批号STY20201-59）、血浆纤维蛋白原（FIB，批号STY20401-63），均为北京中勤世帝科学仪器公司生产。ADP（北京中勤世帝科学仪器公司，ADP粉剂1瓶，ADP缓冲液10 mL/瓶）。ELISA试剂盒：血栓素B₂（TXB₂，批号SBJ-R0548）、6-酮-前列腺素1α（6-keto-PGF_1α，批号SBJ-R0532）、纤溶酶原激活物（t-PA，批号SBJ-R0002）和纤溶酶原激活物抑制物（PAI-1，批号SBJ-R0574）均购自南京森贝伽生物科技有限公司；甲醇（色谱纯，江苏汉邦科技发展有限公司）；甲酸（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）。

茜草购自安徽丰原铜陵中药饮片有限公司，经南京中医药大学吴启南教授鉴定为茜草科植物茜草Rubia cordifolia L. 的干燥根和根茎。茜草炭按《中国药典》2010年版一部有关要求炒制而成。云南白药（批号Z530207，云南白药集团股份有限公司）；盐酸肾上腺素注射液（批号10150101，上海禾丰制药有限公司）；1,3,6-三羟基-2-甲基蒽醌为自制，经HPLC检测质量分数≥98%，大叶茜草素（批号110884-200604，中国食品药品检定研究院，质量分数≥98%），羟基茜草素（森贝伽生物科技有限公司，HPLC检测质量分数≥98%）。

SPF级SD大鼠雌、雄各半，体质量180～220 g，由浙江省实验动物中心提供，合格证号SCXK（浙）2014-0001。

（1）茜草炭醇提物：取茜草炭500 g，加10倍量95%乙醇加热回流提取2次，每次2 h，合并2次滤液，减压回收溶剂，干燥，得浸膏（得率7.91%）。参照文献方法^[6]，UPLC检测得到浸膏中羟基茜草素、1,3,6-三羟基-2-甲基蒽醌、大叶茜草素的质量分数分别为3.71、1.09、0.52 mg/g（以生药量计，下同）。

（2）茜草炭醇提后水提物：将500 g茜草炭醇提后的残渣继续加10倍量水，加热回流提取2次，每次2 h，合并2次滤液，减压回收溶剂，干燥，得浸膏（得率11.27%）。UPLC检测发现浸膏中检测不到大叶茜草素，而羟基茜草素、1,3,6-三羟基-2-甲基蒽醌的质量分数分别为0.63、0.04 mg/g。

（3）茜草炭醇提加水提物：取茜草炭500 g，加10倍量95%乙醇加热回流提取2次，每次2 h，残渣加10倍量水加热回流提取2次，每次2 h，合并4次滤液，减压回收溶剂，干燥，得浸膏（得率19.18%）。UPLC检测发现浸膏中羟基茜草素、1,3,6-三羟基-2-甲基蒽醌、大叶茜草素的质量分数分别为4.54、1.30、0.56 mg/g。

（4）茜草炭水提物：取茜草炭500 g，加10倍量水煎煮2次，每次2 h，合并2次滤液，减压回收溶剂，干燥，得浸膏（得率14.1%）。UPLC检测发现浸膏中检测不到大叶茜草素，而羟基茜草素、1,3,6-三羟基-2-甲基蒽醌的质量分数分别为0.75、0.09 mg/g。

用0.5% CMC-Na溶液将云南白药粉末、茜草炭4种提取物浸膏研匀并稀释至实验所需质量浓度。

SD大鼠，雌、雄各半，按体质量随机分为7组，每组10只，分别为对照组、模型组、云南白药组（0.25 g/kg）、茜草炭醇提物组、茜草炭醇提后水提物组、茜草炭醇提加水提物组、茜草炭水提物组（按临床给药剂量2倍折算，茜草炭不同提取物给药剂量均按茜草炭生药量计设为2.5 g/kg）。各给药组分别ig给予相应药物，对照组与模型组ig给予等体积的0.5% CMC-Na溶液，每天给药2次，连续给药8 d。

参照文献方法复制急性血瘀模型大鼠^[7]，第7天给药后，除对照组sc生理盐水外，其余各组均于大鼠背部两侧sc盐酸肾上腺素2次，间隔4 h，注射剂量为0.8 mL/kg，在第1次sc 2 h后，除对照组外，其余各组大鼠均浸入0～2 ℃冰水中，冰浴5 min。

第8天，各组正常给药40 min后，各组大鼠10%水合氯醛麻醉，颈动脉取血，分装1.5 mL未加抗凝剂的全血，采用MR-16型多环血栓检测仪进行体外血栓形成实验，测定体外血栓湿质量和干质量；其余全血3.8%枸橼酸钠1∶9抗凝，取1 mL全血分装，以SA-5000半自动血流变测试仪测定全血高、中、低切黏度；剩余全血以800 r/min离心10 min，得富血小板血浆（PRP），测定ADP诱导的血小板聚集率；余血再以3 000 r/min离心10 min，得贫血小板血浆（PPP），测定内/外源性凝血功能指标（TT、PT、APTT、FIB），ELISA法测定TXB₂、6-keto-PGF_1α、t-PA和PAI-1水平。

采用SPSS 17.0统计软件对数据进行双样本t检验及方差分析，实验数据均以表示。

与对照组比较，模型组大鼠体外血栓湿质量与干质量显著增加（P＜0.05）。与模型组比较，云南白药、茜草炭醇提后水提物与茜草炭水提物均显著降低模型大鼠血栓湿质量（P＜0.05、0.01），具有降低血栓干质量趋势；茜草炭醇提物、醇提加水提物显著降低血栓湿质量与干质量（P＜0.05、0.01）。其中茜草炭醇提后水提物对血栓湿质量影响最显著，茜草炭醇提加水提物作用次之，两者作用效果无统计学差异；茜草炭醇提加水提物对血栓干质量影响最显著。综合茜草炭提取物对体外血栓湿质量与干质量的影响，可见茜草炭醇提加水提物对模型大鼠体外血栓质量影响最显著。结果见表 1。

表 1 (Table 1)

表 1 茜草炭不同提取物对体外血栓质量的影响 (x±s,n = 10) Table 1 Effect of different extracts from carbonized RRR on weight of in vitrothrombos (x±s,n = 10) 组别 剂量/ (g∙kg−1∙d−1) 血栓湿质量/g 血栓干质量/g 对照 — 0.520 1±0.081 5 0.095 3±0.016 8 模型 — 0.607 5±0.043 2# 0.116 7±0.018 5# 云南白药 0.5 0.542 4±0.081 5 0.108 7±0.009 3 茜草炭醇提物 5.0 0.516 2±0.054 8** 0.098 2±0.010 2 茜草炭醇提加水提物 5.0 0.514 1±0.063 1** 0.094 9±0.011 4** 茜草炭醇提后水提物 5.0 0.488 6±0.053 6** 0.106 9±0.009 2 茜草炭水提物 5.0 0.541 4±0.059 8 0.112 1±0.015 5 与对照组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01；与模型组比较：P＜0.05 **P＜0.01，下同 #P < 0.05 ##P < 0.01 vs control group; P < 0.05 **P < 0.01 vs model group,same as below

表 1 茜草炭不同提取物对体外血栓质量的影响 (x±s,n = 10) Table 1 Effect of different extracts from carbonized RRR on weight of in vitrothrombos (x±s,n = 10)

与对照组比较，模型组大鼠全血各切变率下黏度均显著增加（P＜0.01）；与模型组比较，云南白药和茜草炭醇提物均可降低模型大鼠低切黏度（P＜0.05）；茜草炭醇提加水提物显著降低模型大鼠各切变率下黏度（P＜0.01）；除了茜草炭水提物能够有效改善模型大鼠5 s⁻¹切变率下黏度，茜草炭醇提后水提物和茜草炭水提物均有降低模型大鼠全血黏度趋势，但均无统计学差异；其中茜草炭醇提加水提物降低模型大鼠全血黏度最为显著（P＜0.01）。结果见表 2。

表 2 (Table 2)

表 2 茜草炭不同提取物对血瘀模型大鼠全血黏度的影响 (x±s,n = 10) Table 2 Effect of different extracts from carbonized RRR on hemorheology of blood stasis rats (x±s,n = 10) 组别 剂量/(g∙kg−1∙d−1) 全血黏度/(mPa·s) 200 s−1 30 s−1 5 s−1 1 s−1 对照 — 4.54±0.44 5.75±0.53 9.16±0.89 19.29±2.09 模型 — 5.47±0.36## 7.16±0.54## 12.10±0.94## 26.33±2.41## 云南白药 0.5 5.36±0.28 6.87±0.61 10.81±1.02 22.68±2.64 茜草炭醇提物 5.0 5.37±0.25 6.95±0.48 11.01±0.88 23.01±2.43 茜草炭醇提加水提物 5.0 3.60±0.66** 4.97±0.83** 9.23±1.49** 20.78±1.92** 茜草炭醇提后水提物 5.0 5.24±0.53 6.91±0.57 11.28±0.99 24.91±1.57 茜草炭水提物 5.0 4.95±0.47 6.48±0.55 10.70±1.00 23.67±2.93

表 2 茜草炭不同提取物对血瘀模型大鼠全血黏度的影响 (x±s,n = 10) Table 2 Effect of different extracts from carbonized RRR on hemorheology of blood stasis rats (x±s,n = 10)

与对照组比较，模型组大鼠TT、PT、APTT显著延长，FIB水平增加，ADP诱导的血小板聚集率显著增加（P＜0.05、0.01）。与模型组比较，云南白药显著缩短TT、增加FIB的量（P＜0.05）；茜草炭醇提物和醇提加水提物显著缩短TT、PT、APTT（P＜0.05、0.01），对FIB量影响不大，两组间作用效果无统计学差异；茜草炭醇提后水提物与水提物显著缩短APTT、增加FIB的量（P＜0.05），有缩短TT、PT趋势；茜草炭醇提物与水提物有增加ADP诱导的血小板聚集率趋势，而醇提加水提物与醇提后水提物显著升高ADP诱导的血小板聚集率（P＜0.01）。茜草炭醇提物与醇提加水提物对TT、PT、APTT作用效果优于醇提后水提物与水提物；醇提后水提物对FIB量、血小板聚集率的影响最显著（P＜0.05、0.01），而醇提物与水提物作用效果弱。结果见表 3。

表 3 (Table 3)

表 3 茜草炭不同提取物对血瘀模型大鼠凝血四项、血小板聚集率的影响 (x±s,n = 10) Table 3 Effect of different extracts from carbonized RRR on TT,PT,APTT,FIB,and platelet aggregation rate induced by ADP of blood stasis rats (x±s,n = 10) 组别 剂量/(g∙kg−1∙d−1) TT/s PT/s APTT/s FIB/(g∙L−1) 血小板最大聚集率/% 对照 — 26.30±3.15 18.50±1.19 19.21±1.90 2.24±0.38 13.42±2.49 模型 — 34.04±2.77## 21.64±3.68# 22.86±4.52# 7.02±0.55## 20.77±3.90## 云南白药 0.5 28.68±4.73 20.37±3.42 20.35±3.34 8.02±0.95 23.60±4.33 茜草炭醇提物 5.0 29.46±5.18 16.23±2.53** 16.43±1.43** 6.73±0.83 25.36±6.49 茜草炭醇提加水提物 5.0 29.81±4.33 16.64±2.22** 16.91±2.57** 7.34±0.86 33.38±4.45** 茜草炭醇提后水提物 5.0 34.06±2.14 20.30±1.39 19.09±1.71 8.27±0.95 35.61±3.81** 茜草炭水提物 5.0 33.28±4.04 20.99±2.09 18.72±2.57 7.83±0.83 24.33±5.39

表 3 茜草炭不同提取物对血瘀模型大鼠凝血四项、血小板聚集率的影响 (x±s,n = 10) Table 3 Effect of different extracts from carbonized RRR on TT,PT,APTT,FIB,and platelet aggregation rate induced by ADP of blood stasis rats (x±s,n = 10)

与对照组比较，模型组大鼠PAI-1、TXB₂水平升高，6-keto-PGF_1α水平降低（P＜0.05、0.01），有降低t-PA的量趋势。与模型组比较，云南白药显著降低PAI-1、TXB₂的量，升高6-keto-PGF_1α的量（P＜0.01），具有升高t-PA量的趋势；茜草炭醇提物与醇提加水提物显著降低TXB₂的量，升高PAI-1、6-keto-PGF_1α的量（P＜0.05、0.01），醇提物亦可降低t-PA的量（P＜0.05），而醇提加水提物升高t-PA 量（P＜0.01）；茜草炭醇提后水提物与水提物显著升高6-keto-PGF_1α的量（P＜0.01），有升高PAI-1、TXB₂的量，降低t-PA量的趋势。与对照组比较，模型组t-PA/PAI-1值下降、TXB₂/6-keto-PGF_1α值升高；与模型组比较，云南白药与茜草炭醇提加水提物可升高t-PA/PAI-1，降低TXB₂/6-keto-PGF_1α，而其他各给药组降低t-PA/PAI-1、TXB₂/6-keto-PGF_1α。综合茜草炭不同提取物对t-PA/PAI-1与TXB₂/6-keto- PGF_1α作用趋势，可见茜草炭醇提加水提物对t-PA/PAI-1、TXB₂/6-keto-PGF_1α作用效果最显著。结果见表 4。

表 4 (Table 4)

表 4 茜草炭不同提取物对急性血瘀模型大鼠PAI-1、t-PA、TXB2及6-keto-PGF1α的影响 (x±s,n = 10) Table 4 Effect of different extracts from carbonized RRR on PAI-1,t-PA,TXB2,and 6-keto-PGF1α of blood stasis rats 组别 剂量/ (g∙kg−1∙d−1) PAI-1/ (ng∙L−1) t-PA/ (μg∙L−1) t-PA/ PAI-1 TXB2/ (ng∙L−1) 6-keto-PGF1α/ (ng∙L−1) TXB2/6-keto- PGF1α 对照 — 486.14±30.18 12.49±1.26 25.40±3.57 182.50±20.12 223.94±13.00 0.82±0.11 模型 — 528.67±35.10# 12.22±0.78 22.90±1.19 206.53±12.70## 184.23±14.76## 1.13±0.11## 云南白药 0.5 462.25±51.73** 12.39±1.48 27.03±3.95** 185.84±18.12** 231.68±18.19** 0.81±0.10** 茜草炭醇提物 5.0 642.39±49.10** 10.97±1.15 17.13±1.92** 191.61±15.77 241.25±25.80** 0.81±0.13** 茜草炭醇提加水提物 5.0 579.37±41.36 14.19±1.04** 24.60±2.30 165.05±13.05** 219.25±20.55** 0.76±0.07** 茜草炭醇提后水提物 5.0 554.08±58.71 11.93±0.97 21.73±2.75 208.33±15.54 250.69±19.74** 0.84±0.10** 茜草炭水提物 5.0 572.07±68.82 10.29±0.92 18.30±3.37** 219.34±19.90 297.22±26.10** 0.74±0.11**

表 4 茜草炭不同提取物对急性血瘀模型大鼠PAI-1、t-PA、TXB2及6-keto-PGF1α的影响 (x±s,n = 10) Table 4 Effect of different extracts from carbonized RRR on PAI-1,t-PA,TXB2,and 6-keto-PGF1α of blood stasis rats

全血黏度是反映血液流变学基本特征的参数，也是反映血液黏滞程度的重要指标。肾上腺素联合冰水刺激可造成大鼠急性血液高黏滞模型^[8]，血液黏稠度增加，机体形成血栓的趋势增大。通过考察茜草炭不同提取物对急性血瘀模型大鼠的全血黏度与体外血栓湿质量、干质量的影响，比较各提取物化瘀作用强弱。茜草炭4种提取物均可不同程度改善血瘀模型大鼠全血高黏状态、降低体外血栓湿质量与干质量，其中茜草炭醇提物与醇提加水提物作用效果优于醇提后水提物与水提物，醇提加水提物效果最佳。

中医理论认为，瘀阻经脉，血行不畅，溢于脉外，形成离经之血，故瘀血常伴随着出血。造模过程中观察到大鼠足肿胀、耳后出现瘀斑，耳后、眼睛、鼻子等处可见出血点。本实验选择TT、PT、APTT、FIB 4个指标研究茜草炭不同提取物对凝血系统的作用。TT反映内、外源性凝血途径的共同凝血途径；PT是外源性凝血途径常测指标；APTT是内源性凝血途径常测指标；FIB表示纤维蛋白原的量，反映是否有足量的纤维蛋白原生成纤维蛋白。除了茜草炭醇提后水提物对TT无作用效果，以及茜草炭醇提物降低模型大鼠FIB的量外，其余茜草炭提取物均可以缩短TT、PT、APTT，升高FIB的量，其中茜草炭醇提物与醇提加水提物对TT、PT、APTT作用效果强于茜草炭醇提后水提物与水提物，醇提后水提物对FIB的量影响最显著，醇提加水提物与水提物作用效果次之。可见茜草炭提取物可通过影响内、外源性凝血途径发挥止血作用。

本实验亦考察了茜草炭不同提取物对血小板系统与纤溶系统的影响。通过测定ADP诱导的血小板聚集率、TXB₂、6-keto-PGF_1α 3个指标，探讨茜草炭不同提取物如何影响血小板系统达化瘀止血之效。茜草炭提取物均能提高ADP诱导的血小板聚集率，其中茜草炭醇提后水提物与醇提加水提物作用效果强于醇提物与水提物。TXB₂由血小板释放，具有收缩血管、促进血小板聚集作用，6-keto-PGF_1α是TXB₂抑制物，具有舒张血管、抑制血小板聚集作用。模型组大鼠TXB₂的量增加，6-keto-PGF_1α的量下降，符合瘀血模型特征。较其他提取物而言，茜草炭醇提加水提物对TXB₂、6-keto-PGF_1α作用效果最显著，亦可显著降低模型大鼠TXB₂/6-keto-PGF_1α，降低瘀血模型大鼠血小板聚集，扩张血管，降低血栓形成趋势。t-PA是纤溶系统激活物，可促进纤维蛋白溶解，PAI-1是t-PA抑制物，可降低纤溶功能、促进末梢微循环瘀滞、增加血栓形成趋势^{[9, 10]}，模型组大鼠PAI-1的量增加，t-PA的量有降低趋势，符合瘀血模型特征，茜草炭提取物均可升高PAI-1的量，除了醇提加水提物可升高t-PA的量，升高t-PA/PAI-1，其他提取物均降低t-PA的量与t-PA/PAI-1。综上茜草炭醇提加水提物对血瘀模型大鼠血小板系统和纤溶系统作用强。

UPLC分析茜草炭不同提取物发现，醇提加水提物含有醇提后水提物与水提物中不含有的大叶茜草素，研究表明，大叶茜草素对血小板聚集有一定的抑制作用^[11]；醇提加水提物中亦含有羟基茜草素、1,3,6-三羟基-2-甲基蒽醌，其量明显高于其他提取物，羟基茜草素可抑制了PHBP对凝血因子VIII的激活^[12]，本课题组发现炒炭后1,3,6-三羟基- 2-甲基蒽醌的量升高，该物质对人脐静脉损伤细胞有一定保护作用，推测大叶茜草素、羟基茜草素、1,3,6-三羟基-2-甲基蒽醌可能为茜草炭醇提加水提物发挥化瘀止血作用的有效成分。结合药理数据初步推测化学成分种类及量的差异是导致茜草炭不同提取物化瘀止血作用差异的主要原因。综上所述，醇提加水提是茜草炭化瘀止血作用的最佳提取方式，但茜草炭发挥化瘀止血作用的活性成分（群）以及化学成分与药效关联性还有待进一步研究。