调经丸是由当归、酒白芍、熟地黄、益母草、炒白术、醋香附、阿胶等21味中药组成，具有理气活血、养血调经的功效，用于气滞血瘀所致月经不调、痛经，症见月经延期、经期腹痛、经血量少、或有血块、或见经前乳胀、烦躁不安、崩漏带下^[1]。文献报道该中成药可用于治疗闭经^[2]。该中成药收载于《中国药典》2015年版^[3]与卫生部药品标准中药成方制剂第9册^[4]。

关于该中成药的文献报道较少^{[2, 5]}，没有关于其定量测定的文献报道，只有《中国药典》中采用HPLC法测定芍药苷的量来控制其质量。由于该中成药由21味中药组成，单指标控制有一定的片面性，多指标控制能更好地反映中成药的质量^{[6, 7]}。因此，根据本组方中的中药组成与《中国药典》2015年版，酒白芍的指标性成分为芍药苷，熟地黄的指标性成分为毛蕊花糖苷，当归与川芎的指标性成分为阿魏酸，益母草的指标性成分为盐酸益母草碱，陈皮的指标性成分为橙皮苷，牡丹皮的指标性成分为丹皮酚，黄芩的指标性成分为黄芩苷，续断的指标性成分为川续断皂苷Ⅵ，吴茱萸的指标性成分为柠檬苦素，炒白术的指标性成分为白术内酯Ⅰ与白术内酯Ⅲ^[8]，茯苓的指标性成分为茯苓酸^[9]。本实验首次采用梯度洗脱变波长RP-HPLC法建立了同时测定调经丸中芍药苷、毛蕊花糖苷、阿魏酸、盐酸益母草碱、橙皮苷、丹皮酚、黄芩苷、川续断皂苷Ⅵ、柠檬苦素、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅲ^[8]、茯苓酸^[9]12种成分的方法。

Agilent 1100系列四元梯度泵高效液相色谱仪，美国Agilent公司；梅特勒ME204E型电子分析天平，十万分之一，瑞士梅特勒公司；KQ-1000DV智能超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

对照品芍药苷（批号110736-201438，质量分数96.4%）、阿魏酸（批号110773-201313，质量分数99.6%）、橙皮苷（批号110721-201316，质量分数95.3%）、丹皮酚（批号110708-201407，质量分数99.1%）、盐酸益母草碱（批号111823-201303，质量分数95.2%）、毛蕊花糖苷（批号111530- 201309，质量分数92.9%）、白术内酯Ⅰ（批号111975- 201501，质量分数99.9%）、白术内酯Ⅲ（批号111978-201501，质量分数99.9%）、黄芩苷（批号110715-201402，质量分数91.7%）、柠檬苦素（批号110800-201505，质量分数88.5%）均购于中国食品药品检定研究院；茯苓酸（批号20150217，质量分数98%）、川续断皂苷Ⅵ（批号20150111，质量分数98%）购于上海永叶生物科技有限公司；调经丸（规格：每丸质量9 g），西安正大制药有限公司，批号20150201、20150202、20150203、20150611、20150612、20150613；山西广誉远国药有限公司，批号20150111、20150112、20150113、20150418、20150419、20150420。甲醇与乙腈为色谱纯，均购自天津康科德科技有限公司。流动相用水为纯水（自制），其余试剂均为分析纯。

色谱柱为Venusil MP-C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流动相为乙醇-乙腈（40∶60，A）和0.2%磷酸水溶液（B）；体积流量0.8 mL/min；梯度洗脱：0～10.0 min，5%～15% A；10.0～40.0 min，15%～50% A；40.0～50.0 min，50% A；50.0～75.0 min，50%～95% A；75.0～80.0 min，95%～5% A；分段变波长测定：0～15.0 min为230 nm，15.0～22.0 min为320 nm，22.0～40.0 min为280 nm，40.0～75.0 min为220 nm；柱温45 ℃；进样量10 μL。

取芍药苷、毛蕊花糖苷、阿魏酸、盐酸益母草碱、橙皮苷、丹皮酚、黄芩苷、川续断皂苷Ⅵ、柠檬苦素、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅲ、茯苓酸对照品适量，精密称定，用70%甲醇配制成含芍药苷50 μg/mL、毛蕊花糖苷10 μg/mL、阿魏酸20 μg/mL、盐酸益母草碱30 μg/mL、橙皮苷400 μg/mL、丹皮酚20 μg/mL、黄芩苷60 μg/mL、川续断皂苷Ⅵ 150 μg/mL、柠檬苦素700 μg/mL、白术内酯Ⅰ 50 μg/mL、白术内酯Ⅲ 50 μg/mL、茯苓酸100 μg/mL的混合对照品溶液，即得。

取本品剪碎，混匀，取约1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入80%乙醇25 mL，称定质量，加热回流处理60 min，取出放冷，称定质量，用80%乙醇水溶液补足减失的质量，摇匀，用0.45 μm滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液作为供试品溶液。

依照调经丸标准，由相关辅料制得调经丸阴性对照样品，取阴性对照样品约1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，按“2.3”项下方法制得阴性对照样品溶液。

按照“2.2～2.4”项下方法制得待测溶液，精密吸取适量，按照“2.1”项下色谱条件进行检测，结果供试品溶液中目标分析物的理论板数和分离度均较好，阴性对照样品对供试品溶液检测无干扰。对照品、供试品及阴性对照样品溶液的色谱图见图 1。

图 1

Fig. 1

精密吸取按“2.2”项下方法制备的芍药苷、毛蕊花糖苷、阿魏酸、盐酸益母草碱、橙皮苷、丹皮1-芍药苷 2-毛蕊花糖苷 3-阿魏酸 4-盐酸益母草碱 5-橙皮苷 6-丹皮酚 7-黄芩苷 8-川续断皂苷Ⅵ 9-柠檬苦素 10-白术内酯Ⅰ 11-白术内酯Ⅲ 12-茯苓酸 1-paeoniflorin 2-acteoside 3-ferulic acid 4-eonurine hydrochloride 5-hesperidin 6-paeonol 7-baicalin 8-asperosaponin Ⅵ 9-limonin 10-atractylenolide Ⅰ 11-atractylenolide Ⅲ 12-pachymic acid 图 1 混合对照品 (A)、调经丸样品 (B) 与阴性对照 (C)的HPLC图 Fig. 1 HPLC of mixed reference substances (A),Tiaojing Pills sample (B),and negative sample (C)

酚、黄芩苷、川续断皂苷Ⅵ、柠檬苦素、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅲ、茯苓酸混合对照品储备溶液0.1、0.5、1.0、3.0、5.0、10.0 mL，分别置于10 mL量瓶中，以80%乙醇水溶液稀释至刻度，摇匀，即得系列对照品溶液。分别吸取上述混合对照品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪进行测定，记录色谱峰面积。以峰面积积分值为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X）绘制标准曲线，进行线性回归，得回归方程和各待测成分的r值分别为芍药苷：Y＝124.35 X－23.581 1，r＝0.999 5，线性范围为0.5～50.0 mg/L；毛蕊花糖苷：Y＝23.891 X－3.579 3，r＝0.999 1，线性范围为0.1～10.0 mg/L；阿魏酸：Y＝2.648 9 X－456.231，r＝0.999 2，线性范围为0.2～20.0 mg/L；盐酸益母草碱：Y＝2 891.2 X＋12.631，r＝0.999 3，线性范围为0.3～30.0 mg/L；橙皮苷：Y＝78.258 X－16.387，r＝0.999 8，线性范围为4.0～400.0 mg/L；丹皮酚：Y＝21.846 X－10.222，r＝0.999 1，线性范围为0.2～20.0 mg/L；黄芩苷：Y＝2.351 1 X－243.81，r＝0.999 4，线性范围为0.6～60.0 mg/L；川续断皂苷Ⅵ：Y＝176.3 X－0.128，r＝0.999 8，线性范围为1.5～150.0 mg/L；柠檬苦素：Y＝7.365 X－4.267，r＝0.999 9，线性范围为7.0～700.0 mg/L；白术内酯Ⅰ：Y＝5.269 X－12.784，r＝0.999 3，线性范围为0.5～50.0 mg/L；白术内酯Ⅲ：Y＝23.564 X－87.642，r＝0.999 4，线性范围为0.5～50.0 mg/L；茯苓酸：Y＝44.223 X－0.394 5，r＝0.999 6，线性范围为1.0～100.0 mg/L。

精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液（芍药苷50 μg/mL、毛蕊花糖苷10 μg/mL、阿魏酸20 μg/mL、盐酸益母草碱30 μg/mL、橙皮苷400 μg/mL、丹皮酚20 μg/mL、黄芩苷60 μg/mL、川续断皂苷Ⅵ 150 μg/mL、柠檬苦素700 μg/mL、白术内酯Ⅰ 50 μg/mL、白术内酯Ⅲ 50 μg/mL、茯苓酸100 μg/mL）10 μL，连续进样6次，按照“2.1”项下色谱条件测定峰面积。结果芍药苷、毛蕊花糖苷、阿魏酸、盐酸益母草碱、橙皮苷、丹皮酚、黄芩苷、川续断皂苷Ⅵ、柠檬苦素、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅲ、茯苓酸峰面积RSD分别为0.45%、0.69%、0.88%、0.81%、0.74%、0.94%、0.49%、0.76%、0.46%、0.97%、0.89%、0.61%，结果表明仪器精密度良好。

取供试品溶液（批号为20150201），分别在0、2、4、6、8、10、12、16、18、24 h，按照“2.1”项下色谱条件进行测定，结果供试品溶液中芍药苷、毛蕊花糖苷、阿魏酸、盐酸益母草碱、橙皮苷、丹皮酚、黄芩苷、川续断皂苷Ⅵ、柠檬苦素、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅲ、茯苓酸峰面积RSD分别为1.05%、0.95%、0.89%、0.78%、1.09%、0.84%、0.95%、0.88%、1.01%、0.97%、0.81%、0.83%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定。

取同一批号样品（批号为20150201）6份，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按照色谱条件依次测定，计算各待测物质量分数。结果芍药苷、毛蕊花糖苷、阿魏酸、盐酸益母草碱、橙皮苷、丹皮酚、黄芩苷、川续断皂苷Ⅵ、柠檬苦素、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅲ、茯苓酸的平均质量分数分别为4.328、0.033、0.084、0.182、0.256、0.055、1.163、0.046、0.098、0.134、0.164、0.327 mg/g，RSD分别为1.25%、1.06%、0.99%、0.97%、0.89%、0.91%、1.12%、0.91%、1.13%、1.00%、0.87%、1.06%。

取同一批样品（批号为20150201）6份，每份约1.0 g，精密称定，分成3组，每组3份，分别加入“2.2”项下混合对照品溶液1、3、5 mL，按“2.3”项下方法制得供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱峰峰面积，计算回收率。结果芍药苷、毛蕊花糖苷、阿魏酸、盐酸益母草碱、橙皮苷、丹皮酚、黄芩苷、川续断皂苷Ⅵ、柠檬苦素、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅲ、茯苓酸的平均回收率分别为101.2%、100.8%、101.5%、103.5%、99.7%、98.8%、102.9%、103.1%、98.5%、102.7%、101.8%、98.9%，RSD分别为0.76%、0.84%、0.94%、1.02%、1.01%、0.89%、1.11%、1.24%、1.03%、0.98%、0.90%、0.85%。

取12批调经丸，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进行测定，采用外标一点法进行计算，结果见表 1。由表 1数据可知，12批次供试品中芍药苷、毛蕊花糖苷、阿魏酸、盐酸益母草碱、橙皮苷、丹皮酚、黄芩苷、川续断皂苷Ⅵ、柠檬苦素、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅲ、茯苓酸质量分数分别为4.328～4.688、0.033～0.054、0.073～0.091、0.177～0.199、0.243～0.283、0.043～0.069、1.144～1.173、0.037～0.061、0.094～0.126、0.127～0.157、0.155～0.179、0.285～0.327 mg/g。结果表明本品各批次之间差异较小，上述12种成分可以作为该品种质量控制指标。

表 1 (Table 1)

表 1 调经丸中指标性成分的质量分数 (n = 3) Table 1 Contents of index components in Tiaojing Pills (n = 3) 批号 质量分数/(mg∙g−1) 芍药苷 毛蕊花糖苷 阿魏酸 盐酸益母草碱 橙皮苷 丹皮酚 黄芩苷 川续断皂苷Ⅵ 柠檬苦素 白术内酯Ⅰ 白术内酯Ⅲ 茯苓酸 20150201 4.328 0.033 0.084 0.182 0.256 0.055 1.163 0.046 0.098 0.134 0.164 0.327 20150202 4.541 0.054 0.079 0.185 0.265 0.065 1.164 0.057 0.108 0.137 0.158 0.315 20150203 4.593 0.042 0.091 0.183 0.255 0.062 1.144 0.055 0.096 0.142 0.164 0.306 20150611 4.634 0.043 0.081 0.197 0.242 0.063 1.153 0.039 0.094 0.154 0.159 0.288 20150612 4.623 0.053 0.076 0.177 0.283 0.064 1.152 0.043 0.112 0.127 0.155 0.294 20150613 4.475 0.037 0.073 0.198 0.244 0.043 1.146 0.037 0.115 0.153 0.161 0.285 20150111 4.465 0.043 0.081 0.184 0.276 0.045 1.173 0.047 0.111 0.154 0.174 0.307 20150112 4.514 0.051 0.078 0.180 0.245 0.057 1.154 0.051 0.118 0.157 0.178 0.315 20150113 4.524 0.047 0.088 0.193 0.267 0.052 1.164 0.052 0.126 0.152 0.174 0.302 20150418 4.611 0.046 0.082 0.191 0.262 0.043 1.158 0.053 0.124 0.154 0.179 0.298 20150419 4.688 0.050 0.086 0.187 0.243 0.069 1.151 0.060 0.122 0.157 0.165 0.290 20150420 4.495 0.048 0.083 0.199 0.264 0.049 1.147 0.061 0.117 0.154 0.169 0.295

表 1 调经丸中指标性成分的质量分数 (n = 3) Table 1 Contents of index components in Tiaojing Pills (n = 3)

首次建立变波长HPLC法同时测定调经丸中12种活性成分的方法，方法简便、结果可靠，可作为调经丸多指标定量测定方法，可用于调经丸的质量控制。

本实验考察了超声、回流和索氏提取的3种提取方式，结果表明采用加热回流提取时提取收率最高。另对回流提取条件包括提取溶剂、提取时间、提取次数、提取温度进行考察，实验结果表明，采用80%乙醇回流提取1 h时，提取收率最高。

本实验同时考察了多个流动相体系，甲醇-乙酸水体系，甲醇-磷酸水体系、甲醇-甲酸水体系、甲醇-三氟乙酸体系、优选甲醇-三氟乙酸体系；同时对有机相体系进行了筛选，优选甲醇-乙腈-三氟乙酸体系，梯度洗脱，此时各色谱峰的分离度和峰形达到最佳。

检测波长的选择是非常重要的。根据《中国药典》和相关文献报道^{[8, 9]}，芍药苷、毛蕊花糖苷、阿魏酸、盐酸益母草碱、橙皮苷、丹皮酚、黄芩苷、川续断皂苷Ⅵ、柠檬苦素、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅲ、茯苓酸的检测波长分别为230、334、321、277、283、274、280、212、225、220、220、210 nm；由于检测波长都略有差异，最终选取230、320、280、220 nm 4个检测波长检测，在230 nm检测芍药苷，在320 nm检测毛蕊花糖苷与阿魏酸，在280 nm检测盐酸益母草碱、橙皮苷、丹皮酚、黄芩苷，在220 nm检测川续断皂苷Ⅵ、柠檬苦素、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅲ、茯苓酸。