膏方是传统中药的特色剂型，具有良好的应用前景，但基础研究较为薄弱。膏方讲究对症开方、一人一方。不同膏方的收膏辅料不同，其制备工艺不同，质量控制标准不同^{[1, 2, 3]}。目前，随着人们对膏方认识的提高，对优质膏方的需求与日俱增。这要求基层医院及一线工作人员及时、准确地建立拟制备膏方的工艺参数，保证膏方质量在一个合理的控制范围内。目前，已有相关研究针对4种不同辅料（红糖、鹿角胶、龟甲胶、阿胶）熬制膏方，进行系统研究^[4]，但考察因素和控制指标较繁琐，权重系数不够准确。本实验拟在此基础上，加强膏方成型性以及定量指标的检测，进一步研究以黄明胶结合蜂蜜共同作为收膏辅料膏方的制备及其质量控制方法，完善基层医院膏方生产及其质量控制的方法。

Agilent 1200高效液相色谱仪，Agilent公司；BP211D、BP310P电子天平，德国Sartorius公司。

实验所用药材饮片地黄、当归、玄参、炒枳实、厚朴、大黄、炒杏仁、延胡索、草豆蔻、炒栀子、炒槟榔、炒白术均购自亳州中药材市场，经山西省食品药品检验所高天爱教授鉴定依次为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch. 的干燥块根、伞形科植物当归Angelica sinensis (Oliv.) Diels的干燥根、玄参科植物玄参Scrophularia ningpoensis Hemsl. 的干燥根、芸香科植物酸橙Citrus aurantium L. 的干燥幼果的麸炒制品、木兰科植物厚朴Magnolia officinalis Rehd. et Wils. 的干燥干皮、蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L. 的根和根茎、蔷薇科植物山杏Prunus armeniaca L. var. ansu Maxim. 的干燥成熟种子的炒黄制品、罂粟科植物延胡索Corydalis yanhusuo W. T. Wang的干燥块茎、姜科植物草豆蔻Alpinia katsumadai Hayata. 的成熟种子、茜草科植物栀子Cardenia jasminoides Ellis. 成熟果实的炒黄制品、棕榈科植物槟榔Areca catechu L. 的成熟果实的炒黄制品、菊科植物白术Atractylodes macrocephala Koidz. 的根茎的麸炒制品。各味中药饮片均符合《中国药典》2015年版规定。

橙皮苷（批号110721-200613）、大黄素（批号110756-200211）、和厚朴酚（批号110729-200411），均为色谱级别（质量分数99%），由中国食品药品检定研究院提供。其余试剂为分析纯或色谱纯。黄明胶（批号140621），购自山东省东阿阿胶集团有限公司。蜂蜜为山花蜜（生产日期2015年3月3～5日），购自淮安甜蜜人生蜂产品有限公司。

润肠通便方：地黄、当归、玄参、炒枳实、厚朴、大黄、炒杏仁、延胡索、草豆蔻、炒栀子、炒槟榔、炒白术等。单剂汤剂处方量126 g。本方源自山西省中医院临床经验方，临床应用广泛，疗效显著。考虑到此方选用膏方剂型更为方便，且配合黄明胶（无文献研究）作为收膏辅料，增强疗效，故选择润肠通便方为模型药物作为研究对象。

黄明胶，收载于《部颁标准》，标准编号：WS3-B- 3337-98，是牛科动物黄牛Bos Taurus domesticus Gmelin的皮经熬制并佐以黄酒、豆油等而成的胶，味甘、性平，主入肺、大肠经。其具有滋阴润燥、养血止血、活血消肿、解毒的作用；常用于体虚便秘。黄明胶与阿胶功能相似，阿胶善于补血，黄明胶长于止血养血、润肠通便^[5]。蜂蜜，味甘、性平，归脾、胃、肺、大肠经，具有调补脾胃、缓急止痛、润肺止咳、润肠通便、解毒的功效^[5]。

大黄素具有泻下作用，与糖结合成苷类，泻下作用更稳定，且大黄素经水提取后转移率相对较高。故以出膏率和大黄素转移率为综合评价指标［总指标＝(出膏率＋大黄素转移率)/2］。以浸泡时间（A）、加水倍数（B）、煎煮时间（C）、煎煮次数（D）为因素。各因素水平设计通过单因素试验结果确定。使用L₉(3⁴) 正交试验优化最佳提取工艺参数，试验设计及结果见表 1，方差分析见表 2。

表 1 (Table 1)

表 1 L9(34) 正交试验设计与结果 Table 1 Design and results of L9(34) orthogonal test 序号 A/h B/倍 C/h D/次 出膏率/ % 大黄素转 移率/% 总指标 1 0.5 (1) 6 (1) 0.5 (1) 1 (1) 0.215 0.413 0.314 2 0.5 (1) 8 (2) 1.0 (2) 2 (2) 0.246 0.489 0.367 3 0.5 (1) 10 (3) 2.0 (3) 3 (3) 0.356 0.524 0.441 4 1.0 (2) 6 (1) 1.0 (2) 3 (3) 0.365 0.569 0.467 5 1.0 (2) 8 (2) 2.0 (3) 1 (1) 0.245 0.456 0.350 6 1.0 (2) 10 (3) 0.5 (1) 2 (2) 0.281 0.487 0.384 7 2.0 (3) 6 (1) 2.0 (3) 2 (2) 0.296 0.574 0.435 8 2.0 (3) 8 (2) 0.5 (1) 3 (3) 0.321 0.512 0.416 9 2.0 (3) 10 (3) 1.0 (2) 1 (1) 0.235 0.455 0.345 K1 1.122 1.216 1.114 1.009 K2 1.201 1.133 1.179 1.186 K3 1.196 1.170 1.226 1.324 R 0.079 0.083 1.122 0.315

表 1 L9(34) 正交试验设计与结果 Table 1 Design and results of L9(34) orthogonal test

表 2 (Table 2)

表 2 方差分析 Table 2 Analysis of variance 误差来源 偏差平方和 自由度 F值 显著性 A 1.304 7×10−3 2 1.132 无 B (误差) 1.152 7×10−3 2 1.000 C 2.108 7×10−3 2 1.829 无 D 1.662 2×10−2 2 14.420 P＜0.1 F0.1(2,2) = 9.00 F0.05(2,2) = 19.00

表 2 方差分析 Table 2 Analysis of variance

称取单剂处方用量约126 g，精密称定，按照正交设计工艺，回流提取，滤过，得提取液，水浴蒸干，于100 ℃烘干至恒定质量，得浸膏，计算出膏率（出膏率＝浸膏/处方取样量）。

（1）色谱条件：色谱柱为Agilent Zorbax SB-C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温30 ℃，甲醇- 0.1%磷酸溶液（85∶15）为流动相，检测波长为254 nm，体积流量为0.8 mL/min，进样量10 μL。

（2）对照品溶液的制备：精密称取大黄素5 mg，甲醇溶解，得含大黄素4.132 μg/mL的对照品溶液。

（3）供试品溶液的制备：取浸膏3 g，精密称定于蒸发皿中，加适量硅藻土研磨至颗粒状，置100 mL锥形瓶中，精密加甲醇40 mL，称定质量，加热回流30 min，放冷，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密取续滤液20 mL至锥形瓶中，挥去溶剂，加8%盐酸20 mL超声处理2 min，再加三氯甲烷20 mL回流30 min，分层，留取氯仿层，酸层再用氯仿洗涤2次，合并氯仿层，蒸干，转移至10 mL量瓶中，定容，即得。

（4）样品测定：按照供试品制备方法，每个样品平行制备并检测3次，取平均值。同法检测大黄饮片中大黄素的量。

大黄素转移率＝浸膏中大黄素质量/处方中大黄饮片中大黄素质量

方差分析结果显示，当P＜0.1时，因素D有显著性差异，其他无显著性差异。考虑到节约资源，首次提取药材会吸取一定提取溶剂，故首次加8倍量水。最终确定提取工艺为A₁B₁C₁D₃，首次提取加水8倍，其他遵循中药饮片传统煎煮方法。

按照星点设计的方案收膏，取各处方药材饮片20份，每份为5日汤药方剂量，按优选的提取工艺提取，滤过，得提取液。加热浓缩提取液，随时除去浮沫，待药液稍转浓时（80 ℃相对密度在1.10～1.15均可），不断搅拌，转用文火加热，按方案将适量前处理好的黄明胶和蜂蜜加入药液，不断搅拌。稍转浓时，转最小火，抽样检测相对密度，转文火再浓缩，转最小火再检测，直至调整浓缩到设定的相对密度范围内，停火，收膏完成。

取适量膏滋，精密称定，精密加入2倍量新鲜蒸馏水，搅匀，移入比重瓶，于80 ℃水浴恒温5 min，冷却，称定质量，计算相对密度。

（1）色谱条件：色谱柱为Agilent Zorbax SB-C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温30 ℃，流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱：0～5 min，10%乙腈；5～15 min，10%～35%乙腈；15～30 min，35%～85%乙腈；检测波长238、280 nm，体积流量0.8 mL/min，进样量10 μL^{[9, 10, 11]}。

（2）供试品溶液的制备^[12]：分别取按星点设计方案制备的膏方约4 g，精密称定于蒸发皿中，加适量硅藻土研磨至颗粒状，放入锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，滤过，取续滤液25 mL浓缩至10 mL，即得。

（3）共有峰和参比峰：指纹图谱（图 1）选择12个共有峰，其中7、8号峰分别与和厚朴酚和橙皮苷对照品有相同保留时间，分别指认为和厚朴酚和橙皮苷。7号峰分离度相对较大，干扰较少，同时和厚朴酚具有行气消积的作用，主治腹胀便秘，与膏方主要作用一致，宜作为对照峰（S）。其他共有峰用相对保留时间表示（括号中为相对保留时间）：峰1（0.279）、峰2（0.351）、峰3（0.805）、峰4（0.817）、峰5（0.859）、峰6（0.876）、峰7（1.000）、峰8（1.026）、峰9（1.043）、峰10（1.069）、峰11（1.169）、峰12（1.282）。

图 1

Fig. 1

7-和厚朴酚 8-橙皮苷 7-honokiol 8-hesperidin 图 1 膏方指纹图谱 (A、C) 及对照图谱 (B、D) Fig. 1 Paste fingerprint (A,C) and control (B, D)

相对峰面积（f_n）＝实际检测峰面积 (f)/膏方取样量 (m)，n＝1～12

指纹图谱得分（Z_n）＝(f₁f₂……f₁₂)^1/12

（4）精密度试验：取同一供试品溶液（星点设计试验号15），连续进样10次，测定指纹图谱，结果各色谱峰相对保留时间RSD为0.09%～0.42%，相对峰面积的RSD为0.24%～1.97%，仪器精密度符合规定。

（5）重复性试验：取同一批药材制备膏方，同法制备供试品溶液10份，进行测定，结果各峰的相对保留时间RSD为0.34%～0.65%，相对峰面积的RSD为2.03%～2.85%，重复性较好。

（6）稳定性试验：取同一供试品溶液（星点设计试验号15），分别于第0、0.5、1、2、3、6、9、12、18、24 h测定，结果未出现新的色谱峰，各色谱峰相对保留时间RSD为0.03%～0.05%，相对峰面积的RSD为0.68%～1.24%。

根据预试验结果，选择黄明胶使用量（A′）、蜂蜜使用量（B′）和成品膏相对密度（C′）为自变量，因素水平见表 3。以膏方的成型性［成型性（1分）评分方法：口感：要求味苦微甜，无焦臭、异味（0.2分）；流动性：要求适宜，室温下可以用竹板挂起（0.4分）；于2～8 ℃冷藏后不结冻，可以用药勺盛起，轻松下咽（0.4分）］和指纹图谱［指纹图谱（1分）评分方法：同时监测238 nm和280 nm双波长下的紫外吸收峰，共收集特征峰12个，计算相对峰面积f_n，得分Z_n＝(f₁f₂……f₁₂)^1/12，所有得分通过归一化法得最后评分］为控制指标^{[4, 14]}，每个指标的评分均标准化为0～1的归一值（d），各指标的总评归一值（OD）按下式计算几何平均数，得OD。结果见表 4。

OD＝(d₁d₂……d_k)^1/k

k为指标数对取值越小越好的指标和取值越大越好的指标，分别采用Hassan方法进行数学转换求归一值d_min和d_max。

d_min＝(Y_max－Y_i)/(Y_max－Y_min)

d_max＝(Y_i－Y_min)/(Y_max－Y_min)

表 3 (Table 3)

表 3 收膏工艺-星点设计因素水平 Table 3 Preparation of paste-factor and level for central composite design 水平 A′/% B′/% C′ −1.732 2.6 11.6 1.17±0.01 −1 6.0 15.0 1.21±0.01 0 11.0 20.0 1.26±0.01 1 16.0 25.0 1.31±0.01 1.732 19.5 28.5 1.35±0.01

表 3 收膏工艺-星点设计因素水平 Table 3 Preparation of paste-factor and level for central composite design

表 4 (Table 4)

表 4 润肠通便膏收膏工艺星点设计及结果 Table 4 Central composite design and results in paste collection technology of Runchang Tongbian Cream 试验号 A′/% B′/% C′ 成型性 指纹图谱 OD 试验号 A′/% B′/% C′ 成型性 指纹图谱 OD S1 −1 −1 −1 0.51 1.00 0.71 S11 0 −1.732 0 0.91 0.14 0.35 S2 1 −1 −1 0.92 0.20 0.42 S12 0 1.732 0 0.81 0.42 0.58 S3 −1 1 −1 0.59 0.80 0.69 S13 0 0 −1.732 0.39 0.53 0.46 S4 1 1 −1 0.89 0.39 0.59 S14 0 0 1.732 0.71 0.16 0.33 S5 −1 −1 1 1.00 0.76 0.87 S15 0 0 0 0.91 0.35 0.56 S6 1 −1 1 0.52 0.00 0.00 S16 0 0 0 0.90 0.37 0.58 S7 −1 1 1 0.91 0.54 0.69 S17 0 0 0 0.92 0.38 0.59 S8 1 1 1 0.58 0.18 0.33 S18 0 0 0 0.91 0.41 0.61 S9 −1.732 0 0 0.00 0.13 0.00 S19 0 0 0 0.92 0.33 0.55 S10 1.732 0 0 0.61 0.46 0.52 S20 0 0 0 0.92 0.31 0.53

表 4 润肠通便膏收膏工艺星点设计及结果 Table 4 Central composite design and results in paste collection technology of Runchang Tongbian Cream

文献报道，胶类单独用量为膏方处方量的15%左右，糖类和蜜类为20%左右。由于各类收膏辅料黏性不同，经前期研究发现，阿胶适宜用量为5%～8%、红糖为18%～23%、鹿角胶为14%～16%、龟板胶为12%～15%^{[4, 15]}。综合考虑以上因素，结合黄明胶和蜂蜜用量单因素考察以及2种收膏辅料共同使用需酌情减少用量的原则，确定黄明胶和蜂蜜用量最大值和最小值（即1和−1）。成品膏相对密度通过单因素实验结果确定。

根据结果，用minitab 7.0统计数据，以OD值为因变量对各因素进行多元线性回归和2项式方程拟合，模型的好坏通过R-Sq（R-Sq是衡量回归方程解释观测数据变异的能力，是回归平方和占总离差平方和的比率，其数值越接近于1，代表模型拟合越好）进行判断。拟合方程式Y＝0.53－0.26 X₁＋0.085 X₂－0.091 X₃（R-Sq＝0.421），二项式拟合方程Y＝0.56－0.33 X₁＋0.085 X₂－0.091 X₃＋0.26 X₁²－0.11 X₂²－0.18 X₃²＋0.25 X₁X₂－0.30 X₁X₃（R-Sq＝0.931）。多元2项式回归方程的R-Sq较高，拟合度高，预测性较好，故选择为最佳模型。

根据所拟合的二项式方程，应用minitab 7.0统计软件绘制出总OD值对3个因素中任意2个因素的效应面三维图，结果见图 2。利用效应面分析各因素的相互作用，响应曲线陡则说明交互作用较强。由图 2可知，A′、B′、C′各因素间交互作用显著，A′相对低好，B′相对高好，C′相对低好，但彼此相互制约。根据效应面预测，3个因素较佳范围为A′ 8%～12%；B′ 22%～28%，C′ 1.20～1.25（80 ℃测定）。

图 2

Fig. 2

图 2 星点设计-效应曲面图 Fig. 2 Central composite design-response surface

取15剂处方量药材制备膏方进行试验验证。在膏方最佳制备工艺参数范围内选择3个不同的参数制备膏方（A′ 8%、B′ 22%、C′1.25；A′ 10%、B′ 28%、C′ 1.25；A′ 12%、B′ 28%、C′ 1.23），计算偏差［偏差＝(预测值－实测值)/预测值］，结果见表 5。偏差绝对值均小于3%，说明模型可靠。

表 5 (Table 5)

表 5 放大试验验证结果 Table 5 Validation of enlarge experiment 序号 参数 OD 偏差绝 对值/% 预测值 实测值 1 A′ 8%、B′ 22%、C′ 1.25 0.128 0.130 1.6 2 A′ 10%、B′ 28%、C′ 1.25 0.119 0.122 2.6 3 A′ 12%、B′ 28%、C′ 1.23 0.119 0.116 2.2

表 5 放大试验验证结果 Table 5 Validation of enlarge experiment

最终确定润肠通便膏方制备工艺：① 提取：取处方适量，加6倍量水（首次用8倍量水浸泡1 h）加热提取3次，每次1 h，滤过合并得提取液。②辅料前处理：黄明胶在加入膏前先打碎，加入适量黄酒浸泡过夜，另炖使熔化；蜂蜜应选取无浮沫、死蜂等杂质的优质蜂蜜，入锅内加热，炼至中蜜，备用。③ 收膏：加热浓缩提取液，及时除去浮沫，待药液稍转浓时（相对密度在1.10～1.20均可），不断搅拌，转用文火加热，将前处理好的处方用量8%～12%的黄明胶和22%～28%的蜂蜜加入药液，不断搅拌，浓缩至相对密度在1.20～1.25（80 ℃测定），停火，收膏完成。

前期实验将膏方的成型性（包括外观、口感、流动性、黏度、水溶性、收膏感觉等），服药情况（包括体积和质量），薄层检出情况，定量检出情况均列为控制指标。课题组考虑到各项控制指标评分的复杂性、权重系数的准确性、贡献的重复性、检测及评分标准的精确性以及全面性，重新优化了各项控制指标。例如，流动性和黏度有相关，外观和收膏感觉难定义，服药质量和体积有相关且评分标准难把握，定量测定与薄层有相关等。最终确定控制指标为包括膏方口感（适量使用辅料，保证膏方原有药味的基础上微甜）、流动性（控制收膏终点，保证膏方的成型性以及合理的出膏量）、成型性和指纹图谱（体现整个收膏过程中化学成分的保留和转移情况，中药膏方是中药处方药味连同收膏辅料共同起作用，不宜以单一成分或几个成分的量作为膏方质量的评价指标）。

黄明胶在《部颁标准》中的药效剂量为3～9 g。膏方用量一般为1/3～1/2汤剂用量，按照本实验胶类最佳用量8%～12%计算，该膏方的药学剂量为3～7.5 g。药学剂量和药效剂量基本相符。蜂蜜的常用剂量为15～30 g，考虑到蜂蜜作用的平和性，药效剂量不作太大要求，旨在调整膏方成型性方面进行考察。

实验中发现，在不同考察因素的情况下制备的膏方成型性和化学成分的检出情况并不呈正相关，甚至呈反相关。考虑到膏方中各化学成分对药效贡献的不明确性，将2项指标的权重比暂定义为1∶1，但同等情况下，评分过程侧重于成型性。

（1）星点设计各因素水平下制备的膏方，辅料使用量和膏方最终浓度不同，导致需要加热浓缩的程度和加热时间有差异；（2）本方所含药味炒枳实、厚朴、大黄、草豆蔻、炒白术等含有较多挥发性及酯类成分，其次其他部分中药化学成分也会随着持续加热有一定的变化；（3）本评分采用“归一化”法，实测值最大得分为“1”，最小为“0”，其他得分随着实测值分布情况依次换算。本评分法只体现各指标评分差异，不具体计算差异大小。