2016, Vol. 47
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.07.016 |
2. 解放军第309医院, 北京 100091;
3. 北京中医药大学中药学院, 北京 100029;
4. 北京中医药大学 糖尿病研究中心, 北京 100029
, WANG Li-li1, MA Ru-feng1, WANG Liang2, YANG Mei-juan1, TANG Yu-qing1, LIU Chen-yue3, ZHU Ru-yuan1, LIU Hai-xia1, ZHAO Dan-dan4, MO Fang-fang4, NIU Jian-zhao2, GAO Si-hua4, LI Yu2, ZHANG Dong-wei4
2. Center of Orthopedics, The 309th Hospital of PLA, Beijing 100091, China;
3. Chinese Materia Medica School, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China;
4. Diabetes Research Center, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China
绝经后骨质疏松多是因雌激素缺乏引起的骨代谢紊乱性疾病，表现为骨转换率升高、骨密度和骨质量降低、骨脆性增加，容易引发骨折。骨质疏松属于中医的“骨痿”“骨痹”“腰痛”等范畴，病因病机以肝、脾、肾亏虚为本，外邪、血瘀为标。女贞子Fructus Ligustri Lucidi为木犀科植物女贞Ligustrum lucidum Ait.的干燥成熟果实，性凉，味甘、苦，归肝、肾经，可补肝肾阴、乌须明目、清虚热，是治疗骨质疏松的常用中药之一。临床研究发现，女贞子及含有女贞子的复方可以明显改善骨质疏松患者的临床症状，升高骨密度，且耐受性强，副作用小[1,2,3,4]。但是，女贞子对去卵巢所致骨质疏松的作用机制尚不清楚。本实验拟以去卵巢诱发的骨质疏松模型大鼠为对象，研究女贞子水提液对骨质疏松大鼠骨密度、骨微结构和骨生物力学的影响，并进一步研究这种作用与钙、磷代谢和胶原蛋白及非胶原蛋白代谢的关系。
1 材料 1.1 主要仪器HOLOGIC Discovery Wi双能X线骨密度仪，美国Hologic公司；RM2255徕卡轮转式切片机，德国Leica公司；Olympus BX53倒置荧光显微镜，日本奥林巴斯有限公司；WF-4005微机控制电子万能试验机，深圳市瑞格尔仪器有限公司；VivaCT40小动物活体断层扫描仪，瑞士Scanco medical AG。
1.2 药品与试剂阿伦膦酸钠片（批号007140601），石药集团欧意药业有限公司。乙二胺四乙酸（EDTA），北京市化学试剂公司。女贞子，购于北京同仁堂药店，经北京中医药大学中药博物馆马泽新教授鉴定为木犀科植物女贞Ligustrum lucidum Ait.的干燥成熟果实。
1.3动物SPF级雌性SD大鼠，体质量220～240 g，购自斯贝福（北京）实验动物科技有限公司，许可证号SCXK（京）2011-0004，饲养于北京中医药大学科研实验中心清洁级动物实验室［合格证号SCXK（京）2011-0024，室温22 ℃，相对湿度55%，光暗周期12 h/12 h］。大鼠给予普通饲料饲养，自由饮水，适应性喂养1周后进行造模。
2 方法 2.1 女贞子水提液的制备将女贞子生药100 g加入1000 mL双蒸水，置于混悬仪上加入磁转子低温搅拌48 h，室温4000 r/min离心20 min，取上清液。将上清液在旋蒸仪上低温旋蒸浓缩至含生药0.35 g/mL的溶液，得到女贞子水提液（经HPLC-MS分析，女贞子水提液中含有红景天苷0.718 mg/g）。
2.2 去卵巢骨质疏松大鼠模型制备SD大鼠适应性喂养1周后，ip1%戊巴比妥钠（4 mL/kg）腹腔麻醉后，在脊柱旁一横指、肋骨下缘一横指处用尖头剪刀依次剪开皮肤层、筋膜层、肌肉层，分离组织，沿一侧子宫向上于子宫角末端可见脂肪团，将脂肪团拉出腹腔，可见粉红色菜花样卵巢，用止血钳将卵巢与子宫之间夹闭并结扎，然后切除，松开止血钳，然后将组织放回腹腔还原，依次缝合肌肉层、筋膜层、皮肤层。生理盐水擦拭伤口，除去血迹。用阿莫西林对伤口消炎，并注意保持25 ℃恒温。按同样的方法切除另一侧卵巢。假手术组大鼠仅切除卵巢旁边相同大小的脂肪组织。
2.3 分组与给药造模1周后，取造模成功大鼠27只，按体质量随机分为3组，每组9只，分别为模型组、阳性对照阿伦膦酸钠（用双蒸水配成混悬液，0.12g/kg相当于临床人用剂量的等效剂量）组、女贞子水提液（生药3.5 g/kg，相当于临床人常用剂量）组。另取假手术组大鼠9只作为对照。假手术组和模型组大鼠ig给予等剂量的蒸馏水，其余各组大鼠ig给予相应药物，每日1次，连续12周。
2.4 取材及组织样品处理每周测定各组大鼠体质量1次，给药12周后取生物样品。各组大鼠禁食12 h后取尿液，待测。然后用1%戊巴比妥钠（4 mL/kg）ip麻醉大鼠，分别腹主动脉取血（3 500 r/min，4 ℃离心10 min，取上清，置于−80 ℃备用）、椎骨（L）、两侧股骨。将大鼠股骨和椎骨剔除肌肉组织后，一侧股骨和整个椎骨用生理盐水浸润的湿纱布包裹，放于−80 ℃备用。另一侧股骨先置于10%中性福尔马林中固定72 h，后用15%EDTA（pH 7.4）脱钙液脱钙，脱钙液每2周换1次，连续脱钙3个月，备用。
2.5 血清和尿液生化指标的测定利用直接法-过氧化氢酶清除法，测定血清中高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平；利用胆固醇氧化酶-过氧化物酶法和甘油磷酸氧化酶-过氧化物酶法，分别测定血清中总胆固醇（TC）和三酰甘油（TG）水平，以上操作均按试剂盒（Biosino BIO-Technology and Science Inc.）说明书进行。血清钙（S-Ca）和血清磷（S-P）、尿钙（U-Ca/Cr）和尿磷（U-P/Cr）水平均按试剂盒（南京建成生物公司）说明书操作测定，其中U-P/Cr和U-Ca/Cr表示排泄1 g肌酐（Cr）时所排出的蛋白质数量，可以作为评估骨质疏松症患者骨吸收状态的生化指标。利用ELISA法，测定血清中I型胶原氨基端前肽（PINP）、I型胶原羧基端肽（CTX-I）、骨钙素（OCN）和尿液脱氧吡啶啉（DPD）水平；放免法测定血清碱性磷酸酶（ALP）活性，以上操作均按试剂盒（Cusabio BIO-Technology Co.,Ltd.）说明书进行。
2.6 骨密度（BMD）的测定使用Discovery Wi双能X线骨密度仪对大鼠的股骨和第2、4、5腰椎骨（L2、L4、L5）进行扫描，然后统一划定股骨近头端和L2、L4、L5特定的兴趣区域，进行图像分析，得到股骨头BMD和L2、L4、L5的BMD。
2.7 骨微结构的测定用VivaCT40小动物活体断层扫描仪扫描股骨（扫描股骨头下0.5 cm），分析骨体积平均密度（BD）、骨组织体积平均密度（TD）、骨表面积与体积分数比（BS/BV）、骨小梁体积分数比（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁分离度（Tb.Sp）、骨小梁数量（Tb.N）、结构模型指数（SMI）、异性程度（DA）和连接密度（Conn.D）的变化。
2.8 骨生物力学的测定骨生物力学测定采用微机控制电子万能试验机。实验时将股骨生理弯曲面向上放置，进行3点弯曲测试，参数设置如下：跨距20 mm，直径3 mm，下降速度1 mm/min，至股骨断裂后停止，得到载荷位移曲线，计算股骨的最大载荷、最大应力和弹性模量。
2.9 HE染色将脱钙后的股骨石蜡包埋、切片（5 μm），进行常规HE染色，中性树胶封片，Olympus BX53倒置显微镜下观察病理变化并拍照。
2.10 茜素红染色茜素红（Alizarin Red S，Sigma-Aldrich）染色步骤如下：将股骨石蜡切片，60 ℃烤2 h后，常规脱蜡至水；茜素红染色2 min，甩干多余染料后镜检；丙酮和丙酮-二甲苯分别反复蘸20 s，二甲苯透明，中性树胶封片；显微镜（物镜×10）下观察，拍照并进行图像分析。
2.11 统计学分析实验数据采用SPSS20.0软件系统进行统计分析，结果用x±s描述。满足正态分布时，方差齐时，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）；方差不齐时，使用Dunnett’s T3检验。不满足正态分布时，则使用非参数检验。
3 结果 3.1 对去卵巢大鼠体质量的影响实验过程中每周测定1次体质量，分别统计各组给药0、4、8、12周大鼠体质量，结果见表 1。给药前（0周），各组大鼠的体质量无明显差异。从第4周开始，模型组大鼠的体质量较假手术组明显增加（P＜0.05、0.01），这种趋势一直持续到第12周实验结束。与模型组相比，阿伦膦酸钠给药12周和女贞子水提液给药4、8、12周后，大鼠体质量均有一定程度的降低。
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表 1 女贞子水提液对去卵巢大鼠体质量的影响 Table 1 Effect of water extract fromFLL on body weight of ovariectomized rats |
钙、磷代谢在骨组织钙化中发挥重要的作用[5]。各组大鼠血清和尿液中钙、磷检测结果见表 2。与假手术组相比，模型组大鼠S-Ca和S-P均显著降低，U-Ca/Cr和U-P/Cr的量明显升高（P＜0.01）。与模型组相比，去卵巢大鼠经女贞子水提液或阿伦膦酸钠连续治疗12周后，大鼠S-Ca和S-P的量明显升高，U-Ca/Cr和U-P/Cr的量明显降低（P＜0.05、0.01）。
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表 2 女贞子水提液对去卵巢大鼠血清和尿液中钙和磷水平的影响 Table 2 Effect of water extract from FLL on Ca and P in serum and urine of ovariectomized rats |
血清脂代谢与骨代谢有密切的关系[6]。各组大鼠血清脂代谢相关指标的变化如表 3所示。与假手术组相比，模型组大鼠血清TC、TG、LDL-C水平显著升高，HDL-C水平显著降低（P＜0.05、0.01）。与模型组相比，大鼠给予女贞子水提液治疗12周后，其血清中TC、TG和LDL-C水平显著降低（P＜0.05、0.01），HDL-C水平显著升高（P＜0.05），女贞子水提液对血脂的调节作用与阿伦膦酸钠作用基本接近，但给药组血清HDL-C水平仍显著低于假手术组（P＜0.01）。
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表 3 女贞子水提液对去卵巢大鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平的影响 Table 3 Effect of water extract from FLL on levels of TC, TG,HDL, and LDL in serum of ovariectomized rats |
血清ALP、PINP和OCN是反映骨形成的生化指标，血清CTX-I和尿液中DPD是反映骨吸收的生化指标[7,8]。各组大鼠骨血清转换标志物水平比较见表 4。与假手术组相比，模型组大鼠血清中PINP水平显著降低，血清ALP、CTX-I和OCN水平显著升高，尿液中DPD水平显著升高（P＜0.05、0.01）。与模型组相比，去卵巢大鼠经女贞子水提液治疗12周后，其血清中的PINP水平显著升高，血清ALP、CTX-I、OCN水平显著降低，尿液中DPD水平显著降低（P＜0.05、0.01）。
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表 4 女贞子水提液对去卵巢大鼠血清和尿液中骨转换标志物的影响 Table 4 Effect of water extract from FLL on turnover markers content of serum in ovariectomized rats |
BMD是诊断骨质疏松的金指标[7, 9]，各组大鼠股骨头和L2、L4、L5的BMD测定结果见图 1。与假手术组相比，模型组大鼠股骨头和L2、L4、L5的BMD均显著降低（P＜0.01）。与模型组相比，去卵巢大鼠经女贞子水提液治疗12周后，股骨头和L2、L4、L5的BMD显著升高（P＜0.05、0.01）。
 | 图 1 女贞子水提液对去卵巢大鼠股骨和腰椎骨BMD的影响 (x± s , n = 7)Fig.1 Effect of water extract from FLL on changes of BMD in femur and lumbar of ovariectomized rats (x± s , n = 7) |
骨微结构的改变决定骨强度[7,8]，各组大鼠股骨微结构观察结果见图 2，相关指标测定结果见表 5。与假手术组相比，模型组大鼠的骨微结构遭到严重破坏，其BD、Tb.Sp、SMI、DA明显升高，TD、BV/TV、BS/BV、Tb.Th、Tb.N、Conn.D明显降低
 | 图 2 各组大鼠股骨微结构扫描图Fig.2 Scanning of micro structure of femur of rats ineach group |
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表 5 女贞子水提液对去卵巢大鼠骨微结构指标的影响 Table 5 Effect of water extract from FLL on changes of micro structure in ovariectomized rats |
（P＜0.01）。去卵巢大鼠经女贞子水提液或阿伦膦酸钠治疗12周后，与模型组相比，骨微结构明显得到改善，BD、Tb.Sp、SMI、DA明显降低，TD、BV/TV、BS/BV、Tb.Th、Tb.N、Conn.D明显升高（P＜0.05、0.01）。
3.7 对去卵巢大鼠股骨生物力学的影响去卵巢大鼠股骨生物力学检测结果见图 3。与假手术组相比，模型组大鼠股骨的最大载荷、最大应力、弹性模量均明显降低（P＜0.01）。去卵巢大鼠经女贞子水提液或阿伦膦酸钠治疗12周后，与模型组相比，大鼠股骨最大载荷、最大应力、弹性模量均明显升高（P＜0.05、0.01）。
 | 图 3 女贞子水提液对去卵巢大鼠股骨生物力学改变的影响 (x± s , n = 6)Fig.3 Effect of water extract from FLL on changes of femur bone biomechanics in ovariectomized rats (x± s , n = 6) |
股骨组织切片HE染色结果见图 4，光镜（×4）下观察发现，与假手术组相比，模型组大鼠股骨头部位，脂滴明显增多，骨小梁结构紊乱、变细、断裂。与模型组相比，女贞子水提液组和阿伦膦酸钠组大鼠的骨小梁排列相对整齐，骨微结构形态得到改善，脂滴明显减少，骨小梁增粗、排列整齐，但与假手术组相比，女贞子水提液组大鼠骨组织结构仍然未恢复到正常状态。
 | 图 4 大鼠股骨HE染色Fig.4 HE staining of femur in rats |
在成骨细胞分化过程中，钙离子与茜素红反应后，沉积形成钙结节。钙结节数量反映了成骨细胞的活化程度和骨形成速度。如图 5所示，茜素红染色后光镜下观察发现，与假手术组相比，模型组大鼠股骨成骨细胞钙化结节数量明显减少。与模型组比较，阿伦膦酸钠组或女贞子水提液组股骨的钙结节数量明显增加（P＜0.01），分布也相对比较均匀。
 | 图 5 大鼠股骨茜素红染色 (x± s , n = 9)Fig.5 Alizarin red S staining of femur in rats(x± s , n = 9) |
绝经后妇女骨质疏松属于高转化型骨质疏松，由于卵巢功能减退，雌激素缺乏，导致骨强度受损，BMD与骨质量下降，骨脆性增加，易于骨折，严重地影响中老年女性的身体健康和生活质量，甚至缩短寿命。去卵巢建立的骨质疏松模型是研究绝经后骨质疏松的经典方法。本实验结果显示模型组去卵巢后，大鼠体质量增加，BMD降低，骨微结构破坏，骨结构力学性能下降，骨质量和骨强度下降，表明造模成功[10]。
女贞子具有补益肝肾、清虚热、明目的功效，自古以来就被用于治疗“骨痿”“骨痹”之症，有强筋健骨的功效。《本草纲目》记载：“女贞子可补中，安五脏，养精神，除百病。久服使人肥健，轻身不老，强阴，健腰膝，明目。”有研究报道，脂肪细胞和炎症因子能间接或直接抑制成骨细胞的生成，增加破骨细胞的生成，并促进破骨细胞发挥其功能，从而造成骨丢失[11,12]。现代药理研究表明，女贞子有降血糖、调血脂、抗炎等作用，也是治疗骨质疏松的常用有效药物[13,14]。本实验结果表明，女贞子水提液连续治疗12周，可以缓解大鼠因卵巢切除后雌激素减少而引起的体质量增加；升高股骨头和L2、L4、L5的BMD，抑制去卵巢诱发的骨质量降低；升高TD、BV/TV、BS/BV、Tb.Th、Tb.N、Conn.D，降低BD、Tb.Sp、SMI、DA，改善骨微结构，增强骨强度；升高最大载荷、最大应力、弹性模量，增强骨生物力学性能；升高HDL-C，降低TC、TG、LDL-C，调节脂质代谢，以上结果同研究报道相一致。
血液和尿液的生化指标可以反映骨代谢水平，去卵巢后会引起钙、磷代谢紊乱，血钙和骨钙减少，肾脏排出的尿钙增多，引起钙缺乏；血磷和尿磷的增多也使骨形成和骨钙化能力降低，导致矿物质沉积减少，骨骼物质基础缺乏，BMD和骨量降低，骨骼脆性增加，引发骨质疏松甚至骨折[15,16,17]。此外，去卵巢还可引起骨转换率升高，骨吸收大于骨形成，使骨量增加受阻。本实验发现用女贞子水提液干预12周后，去卵巢大鼠血钙和血磷水平升高，尿钙和尿磷水平降低，钙、磷代谢改善，骨组织钙化加强。同时，茜素红染色也发现，女贞子水提液可以明显提高去卵巢大鼠骨组织的钙盐沉积，促进成骨细胞的成熟和矿化，加速骨形成。
骨钙素和胶原蛋白是构成骨组织的主要蛋白，血清PINP和OCN是作为骨形成的生化指标；CTX-I和尿DPD是作为骨吸收的生化指标。研究发现，去卵巢大鼠的骨转换率升高，骨形成和骨吸收均增强，PINP的量明显降低；OCN、CTX-I、ALP和DPD的量明显升高[18,19]。本实验研究也发现，女贞子水提液可以升高去卵巢大鼠血中PINP量，降低ALP、CTX-I、OCN和DPD量，从而调节骨胶原蛋白和非胶原蛋白的代谢，降低去卵巢诱发的高骨转换率，促进骨形成，抑制骨吸收。
综上所述，本实验研究发现，女贞子水提液能改善去卵巢诱发的骨质疏松模型大鼠的骨密度、提高其骨强度，可能是通过调节钙、磷代谢，骨组织胶原蛋白和非胶原蛋白代谢而发挥预防和治疗骨质疏松的作用。
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