达玛烷-3β,12β,20,25-四醇（25-OH-PPD）是一类原人参二醇（PPD）的衍生物，它普遍存在于人参属植物的皂苷水解产物中，为达玛烷型四环三萜类原人参二醇型苷元^{[1, 2, 3]}。1982年Wei等^[4]首次从三七叶总皂苷的酸水解产物中分离得到25-OH-PPD，并确定其化学结构。之后药学工作者也相继从三七芦头及茎叶、西洋参茎叶以及花蕾和绞股蓝总皂苷的水解物中分离得到^[1]。2008年马晓宁等^[5]及许志超等^[6]分别从绞股蓝皂苷和西洋参茎叶皂苷水解物中首次分离得到25-OH-PPD。王丹等^[7]用碱水解人参总皂苷，经过反复柱色谱最后重结晶得到25-OH-PPD。王凯等^[8]用10%醋酸水解三七芦头皂苷用硅胶柱色谱及HPLC分离得到25-OH-PPD。胡晗绯等^[9]把三七叶干燥粉碎后用70%乙醇回流提取，经大孔吸附树脂以70%乙醇洗脱，得到的浸膏经硅胶色谱柱分离得到该化合物。陶娌娜^[10]用10%的盐酸-乙醇为条件降解人参根总皂苷，再用柱色谱、萃取以及结晶等方法分离得到25-OH-PPD。

2007年Wang等^[11]首次从人参果总皂苷中发现了25-OH-PPD，发现其活性高于PPD和人参皂苷Rg₂、Rg₃。本课题组研究发现25-OH-PPD对细胞周期相关蛋白cdk4、cyclinD1、E2F1、MDM2及p21的表达均有明显的抑制作用，其对肿瘤生长的抑制活性要比目前在国内广泛使用的抗癌药物人参皂苷Rg₃高5～15倍^{[11, 12]}。Wang等^[12]在体外实验中发现25-OH-PPD能够抑制癌细胞的扩散和移植瘤细胞的增长，且无宿主毒性。Wang等^[13]用25-OH-PPD制备氨基酸衍生物，得到的产物抗癌活性比原产物提高10倍。Qu等^[14]用25-OH-PPD制备氯乙酰氯衍物，部分衍生物有很强的抗癌活性，C-20位形成双键的衍生物抗癌活性尤为明显。25-OH-PPD的C-20位为手性碳原子，其存在差向异构体，即20(S)-25-OH-PPD和20(R)-25-OH-PPD。

异构体的构型不同，通常也会有不同的药理、药动学特征以及毒性等生物学性质。异构体的拆分及其药理活性的研究在新药开发中也占有重要地位，是新药的主要来源之一。大多数化学药品是由等量的左旋和右旋2种对映体组成的外消旋体，而单一对映体或光学百分比较高的药物，同外消旋药物相比，在临床治疗以及用药中，更有利于药物动力学以及药物使用剂量的控制，且使用的药物专一，使得疗效更好，副作用小，毒副反应更容易监控。手性拆分具有结晶拆分法、化学拆分法、生物学拆分法、萃取拆分、分子印迹技术、色谱拆分、膜拆分、毛细管电泳拆分、旋转带蒸馏技术等^{[15, 16, 17, 18, 19, 20]}，而色谱拆分法是手性拆分中的主要方法，其中HPLC法拆分又以其应用广泛、操作简单、分离条件简单、分离效果好、灵敏度高等优势而备受关注。本实验利用非手性的HPLC法，通过低能高效的间隔连续进样以及稳定性、重现性好的离线制备法，对25-OH-PPD差向异构体进行分离制备，并考察不同流动相组成以及进样量对这2种分离制备方法的影响，对分离制备的结果进行了优选与评价，这不仅为接下来大规模分离制备25-OH-PPD异构体提供了方法与条件，同时也为其进一步进行抗癌活性的研究奠定了基础。

LC-3000制备型高效液相色谱，北京创新通恒科技有限公司；HPLC PUMP K-501分析高效液相色谱，德国KNAUER公司；Model 100 ELSD，美国SofTA公司；ELSD-UM3000蒸发光散射检测器，上海通微分析技术有限公司；BS-100A型自动馏分收集器，上海沪西分析仪器厂有限公司；N-1001型旋转蒸发仪，上海爱郎仪器有限公司-东京理化器械（株）独资工厂；DLSB-10/20型低温冷却循环泵，上海爱郎仪器有限公司-东京理化器械（株）独资工厂。

25-OH-PPD差向异构体混合物（R：73.1%；S：26.9%）、20(S)-25-OH-PPD、20(R)-25-OH-PPD对照品，经HPLC检测质量分数＞98%，沈阳药科大学基于靶点的药物设计与研究教育部重点实验室自制；甲醇，色谱纯，天津康科德科技有限公司；纯化水。

色谱柱为北京创新通恒Fuji-C₁₈柱（250 mm×30 mm，10 μm）；柱温为室温；进样量1 mL；体积流量20 mL/min；蒸发光散射检测器。

色谱柱为Agilent HC-C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温25 ℃；流动相为甲醇-水（87:13）；进样量20 μL；体积流量1 mL/min；蒸发光散射检测器。

分别称取25-OH-PPD差向异构体混合物41.52、60.29、81.10、123.82 mg，溶于4 mL甲醇中，配制成质量浓度分别为10、15、20、30 mg/mL的样品溶液，经0.45 μm微孔滤膜滤过后备用。分别考察了以上不同的进样质量浓度在不同比例的流动相（甲醇-水为81:19、83:17、85:15、87:13）下色谱峰的分离周期（从进样到目标物质峰结束的时间）、流动相耗损（分离周期内所用的流动相体积）、产量（是基于25-OH-PPD差向异构体混合物中的20(S)-25-OH-PPD进行计算）、转移率（制备所得样品的实际量/制备所得样品的理论量）和质量分数情况。

流动相组成为甲醇-水（81:19）时，流动相极性偏大，样品在色谱柱中的保留时间延长，峰形变宽，柱效下降，分离周期为其他比例下的2倍，流动相耗损大；流动相组成为甲醇-水（87:13）时，20(S)-25-OH-PPD与20(R)-25-OH-PPD的分离度小于1.0，因此，以上比例的流动相组成不作为最佳考虑。最终对流动相组成为甲醇-水（85:15、83:17）下的分离制备情况进行了比较，结果见表 1。以20(S)-25-OH-PPD为例（下同）。

表 1(Table 1)

表 1 流动相组成为甲醇-水（ 83 :17、85 :15 ）对20(S)-25-OH-PPD分离制备结果的影响 Table 1 Influence of moblie phase methanol-water (83:17 and 85:15) on separation and preparation of 20(S)-25-OH-PPD 样品质量浓度/ (mg∙mL−1) 甲醇-水（83:17） 甲醇-水（85:15） 分离周期/min 流动相耗损/mL 转移率/% 质量分数/% 产量/mg 分离周期/min 流动相耗损/mL 转移率/% 质量分数/% 产量/mg 10 60.67 1 213.4 97.78 100.0 2.63 47.85 897.0 96.78 99.0 2.60 15 60.89 1 217.8 90.95 100.0 3.76 48.00 960.0 78.56 99.6 3.17 20 61.26 1 225.2 87.92 99.0 4.73 49.89 997.8 75.09 98.9 4.04 30 61.98 1 239.6 80.17 98.0 6.81 50.13 1 002.6 84.39 97.0 6.81

表 1 流动相组成为甲醇-水（ 83 :17、85 :15 ）对20(S)-25-OH-PPD分离制备结果的影响 Table 1 Influence of moblie phase methanol-water (83:17 and 85:15) on separation and preparation of 20(S)-25-OH-PPD

由表 1可知，随着进样质量浓度的增大，分离周期延长，流动相的耗损增加，产量也随之增大。20(S)-25-OH-PPD的转移率随着进样质量浓度增加而降低，质量分数也有下降趋势，但不成线性关系。在相同的进样质量浓度下，流动相组成为甲醇-水（83:17、85:15）2个比例中，前者的20(S)-25-OH-PPD转移率和实际产量比后者高，虽分离周期延长，流动相耗损增加，但效率提高。综合考虑几项指标，最终确定间隔连续进样法的制备条件：流动相组成为甲醇-水（83:17），体积流量为20 mL/min，进样质量浓度为20 mg/mL，进样量为1 mL，柱温为室温，色谱柱为北京创新通恒Fuji-C₁₈柱（250 mm×30 mm，10 μm）。

按“2.1.3”项优选的最佳条件，以间隔连续进样法分离制备25-OH-PDD差向异构体混合物401.081 mg，分别连续收集1、2号峰（图 1），得到的组分经减压干燥，称定质量，用分析型HPLC-ELSD验纯，结果见图 2。连续间隔进样法制备耗时5 h得到20(S)-25-OH-PPD 91.58 mg，转移率为83.68%，制备效率为18.01 mg/h，质量分数98.32%；20(R)-25-OH-PPD 176.82 mg，转移率为60.31%，制备效率为35.36 mg/h，质量分数97.08%。

1号峰主要含20(S)-25-OH-PPD，保留时间（tR）为47.48 min；2号峰主要含20(R)-25-OH-PPD，tR为52.54 min The first peak mainly contained 20(S)-25-OH-PPD,with the retention time (tR) of 47.48 min. The second peak mainly contained 20(R)-25-OH-PPD,with the tR of 52.54 min 图 1 RP-HPLC制备色谱图Fig. 1 Preparation RP-HPLC

图 2 间隔连续进样法分离制备20(S)-25-OH-PPD (A) 和20(R)-25-OH-PPD (B) HPLC图Fig. 2 HPLC of 20(S)-25-OH-PPD (A) and 20 (R)-25-OH-PPD (B) prepared by continuous sampling interval method

色谱柱为北京创新通恒Fuji-C18柱（250 mm×30 mm，10 μm）；柱温为室温；进样质量浓度200 mg/mL，进样量2.5 mL；体积流量20 mL/min；蒸发光散射检测器。

色谱条件同“2.1.2”项。自动流分收集器参数设置：间隔1 min接样。

分别以流动相组成为甲醇-水（81:19），进样量为1.0、2.5 mL以及流动相组成为甲醇-水（79:21），进样量为2.5 mL进样，当出现第1个色谱峰时开始以离线法接取流分，后用分析型HPLC-ELSD进行检测，合并流分。考察分离条件（流动性组成及进样量）对首峰出峰时间［20(S)-25-OH-PPD的出峰时间］、流分收取时间［分析型HPLC检测到20(S)-25-OH-PPD组分出现时至20(R)-25-OH-PPD组分结束的时间］和20(S)-25-OH-PPD制备效率（制备样品所得的实际质量/制备时间）的影响，结果见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 流动相组成对25-OH-PPD差向异构体分离制备的影响 Table 2 Influence of moblie phase on separation and preparation of 25-OH-PPD epimers 分离条件 首峰出峰 时间/min 含20(S)-25-OH- PPD流分时间/min 含25-OH-PPD差向异构 体混合物流分时间/min 含20(R)-25-OH- PPD流分时间/min 流分收取 时间/min 20(S)-25-OH-PPD 制备效率/(mg∙h−1) 甲醇-水 进样量/mL 81:19 2.5 59 0～5 6～17 18～42 42 50.55 81:19 1.0 59 0～6 7～ 9 10～36 36 26.00 79:21 2.5 80 0～8 9～26 27～70 70 28.15

表 2 流动相组成对25-OH-PPD差向异构体分离制备的影响 Table 2 Influence of moblie phase on separation and preparation of 25-OH-PPD epimers

由表 2可知，流动相的极性增大时，保留时间、制备时间延长，影响制备效率；当减小进样量时，2峰间的分离度增加，柱效升高，但制备效率却大大降低，因此选择流动相组成为甲醇-水（81:19）。离线制备法的最佳制备条件：色谱柱为北京创新通恒Fuji-C₁₈柱（250 mm×30 mm，10 μm）；柱温为室温；流动相组成为甲醇-水（81:19）；体积流量20 mL/min；进样质量浓度200 mg/mL，进样量2.5 mL。

按“2.2.3”项优选的最佳条件，以离线制备法分离制备25-OH-PDD差向异构体混合物2 004.5 mg，得到的20(S)-25-OH-PPD和20(R)-25-OH-PPD经减压干燥，称定质量，用分析型HPLC-ELSD验纯，结果见图 3。离线制备法分离制备耗时5.5 h，得到20(S)-25-OH-PPD 280.81 mg，转移率51.98%，制备效率50.55 mg/h，质量分数99.81%；得到20(R)-25-OH-PPD 285.63 mg，转移率19.48%，制备效率51.93 mg/h，质量分数98.39%。

图 3 离线制备法分离制备20(S)-25-OH-PPD (A) 和20(R)-25-OH-PPD (B) HPLC图Fig. 3 HPLC of 20(S)-25-OH-PPD (A) and 20(R)-25-OH-PPD (B) prepared by off-line preparation method

间隔连续进样法即在保证2次进样之间的时间间隔使2次出峰不重叠的前提下连续重复进样，是大量制备样品的方法之一。一般的制备方法为单一的不连续的进样，这种传统的制备方法没有充分利用从进样到出峰的这一段时间，从而降低了制备效率。而通过间隔连续进样，可以节省时间、提高效率、节约流动相，减少消耗，降低废液的排放。

离线制备法即进样量超出或接近了制备柱的最大承受量，而远远超出了检测器的检测限，制备时不连接检测器，而是通过分析型HPLC作为检测器来检测不同时间段的流出液。离线法的优势在于制备量大，不受检测器检测限的限制，因此其应用范围更广，不受实验仪器的条件限制，能够很好地达到制备分离的目的。

间隔连续进样法和离线制备法制备效率等比较是在两者各自最佳的制备条件下进行比较。间隔连续进样法在比较了甲醇-水（85:15、83:17、81:19）比例和不同进样量后得到最佳制备条件：流动相比例为甲醇-水（83:17），进样量20 mg/mL，1 mL。离线制备法由于进样量大，在甲醇-水（85:15、83:17）时分离度差，2种异构体没法分开。比较了甲醇-水（81:19、79:21）比例和不同进样量后，得到最佳制备条件：流动相为甲醇-水（81:19），进样质量浓度200 mg/mL，进样量2.5 mL。

在实验中，流动相组成和进样量对整个分离制备的影响尤为显著。随着流动相中水的比例增加，极性变大，出峰延迟，导致样品在色谱柱中保留时间过长，柱效降低，峰型变宽，流动相的耗损增多，工作效率随之降低。在间隔连续进样法中流动相比例为甲醇-水85:15、83:17时，两者之间除了出峰时间其他差距不明显，但当流动相变为（81:19）时，柱效变低，峰宽为前2者的2倍。离线制备法中流动相甲醇-水比例为79:21时制备效率为28.15 mg/h，而甲醇-水81:19时制备效率为50.55 mg/h。虽在离线制备法中进样量增大，已经超出了制备柱的最大载样量，但是超量并不影响制备效率，反而在一定的流动相比例和进样量下制备效率增高。

在间隔连续进样法最佳制备条件筛选时，相同流动相比例下随着进样质量浓度增大得到的样品质量分数整体呈下降的趋势，但是在接取峰的过程为人工手动接峰，存在一定误差，导致在流动相组成为甲醇-水（85:15），进样质量浓度为10 mg/mL时，20(S)-25-OH-PPD的质量分数为99.0%。

本实验中，所用的离线制备法和间隔连续进样法未见相关文献报道。间隔连续进样法是在小浓度进样、2峰分离度很好的情况下进行分离，接取流出液时舍去交叉部分较离线制备法少，回收率比离线制备法的高，但是由于进样量小制备效率远远低于离线制备法。离线制备法中流分的接取是在线和离线相结合（出峰前和出峰快结束时连接检测器，中间制备时由于制备量大而断开检测器连接），此方法避免系统不稳定导致各个组分保留时间不确定的问题，重现性好，能高效地制备出高质量分数样品。其次，在离线制备法分离纯体的过程中结合间隔连续进样法，间隔时间虽然比低质量浓度的间隔连续进样法长，但相对单针进样可以节约时间提高制备效率。在离线制备法中进样量、流动相等影响使得2个异构体存在交叉，制备过程中为了保证纯度而舍去交叉部分，从而降低了制备效率，尤其是后出峰的20(R)-25-OH-PPD。在交叉部分20(R)-25-OH-PPD成分就已经达到最大值被冲出，而在出峰后20 min才接取的含20(R)-25-OH-PPD流出液，其成分量已经变少，而且进样量大导致的拖尾现象使20(R)-25-OH-PPD成分跨越时间长，使得20(R)-25-OH-PPD转移率只为19.48%，制备效率51.93 mg/h，而20(S)-25-OH-PPD转移率51.98%，制备效率50.55 mg/h。离线制备法中20(S)-25-OH-PPD制备效率为间隔连续进样的3倍，20(R)-25-OH-PPD制备效率为其1.5倍，优于间隔连续进样法。

本实验考察了不同流动相组成比例和进样量对间隔连续进样法与离线制备法分离制备25-OH-PPD异构体的影响，比较了2种方法的分离制备效率。最终离线制备法因其操作方法简单，制备量大，分离效率高，产品产量大的优势，确定为更理想的分离制备方法，此方法也可以用作其他成分简单的物质和异构体分离与制备。