皂角刺Gleditsiae Spina为皂荚Gleditsia sinensis Lam. 的干燥棘刺，具有多种药理活性。据记载有抗癌杀菌作用，功效显著^{[1, 2]}。皂角刺作为我国传统抗癌药物之一，国内外文献报道其含有的三萜皂苷和黄酮成分，是抗癌作用的主要活性物质^{[3, 4]}。为阐明河南伏牛山皂角刺的抗肿瘤活性成分，本实验对其化学成分进行了研究，从醋酸乙酯抗癌活性部位中分离得到12个二氢黄酮醇类及黄酮类化合物，其中化合物1为一新化合物，鉴定为 (2R,3R)- 5,3′,4′-三甲氧基-7-羟基二氢黄酮醇 [(2R,3R)-5,3′,4′- trimethoxyl-7-hydroxyl-flavanonol，1]。通过波谱分析和与文献数据对照，化合物2～12分别被确定为5,7,3′,4′-四羟基二氢黄酮醇（5,7,3′,4′-tetrahydroxyl- flavanonol，2）^[5]、5-甲氧基-3′,4′,7-三羟基二氢黄酮醇（5-methoxyl-3′,4′,7-trihydroxyl-flavanonol，3）^[6]、二氢山柰酚（dihydrokaempferol，4）^[5]、表儿茶素（epicatechin，5）^[5]、5,7,3′,5′-四羟基二氢黄酮醇（5,7,3′,5′-tetrahydroxyl-flavanonol，6）^[5]、黄颜木素（fustin，7）^[7]、(2R,3R)-7,3′,5′-三羟基二氢黄酮醇[(2R,3R)-7,3′,5′-trihydroxyl-flavanonol，8]^[8]、(2R,3R)- 5,7,3′-三羟基-4′-甲氧基二氢黄酮醇 [(2R,3R)-5,7,3′- trihydroxyl-4′-methoxyl-flavanonol，9]^[9]、槲皮素（quercetin，10）^[7]、5,7,4′-三羟基黄酮-8-C-葡萄糖苷（5,7,4′-trihydroxylflavone-8-C-glucopyranose，11）^[9]和2,7-二甲基-氧杂蒽酮（2,7-dimethyl-xanthone，12）^[10]。所有化合物的结构见图 1。

图 1

Fig. 1

图 1 皂角刺中分离的二氢黄酮醇类和黄酮类化合物的结构 Fig. 1 Separation of flavanonols and flavone compounds from G. sinensis

对肿瘤细胞株的细胞毒活性检测结果显示，化合物1、2、3、7和10对肺癌（A549）、肝癌（HepG2）和食管癌（EC109）3种癌细胞株均呈较强的细胞毒活性，并且细胞毒作用呈浓度依赖性关系，但它们对正常人肺成纤维细胞的增殖无抑制作用。

高效液相-离子阱-飞行时间质谱仪（LC-MS- IT-TOF，日本岛津公司）；Avance 400 MHz超导核磁共振仪（瑞士Bruker公司）；UV-2401紫外光谱仪（日本岛津公司）；RP-HPLC 半制备色谱仪（美国Waters公司）；HoribaSEPA-300型数字式旋光仪（日本Hofiba公司）；X-4显微熔点测定仪（上海精科实业有限公司）；Chirascan圆二色CD光谱仪（英国应用光物理公司Applied Photophysics）；Sephadex LH-20凝胶（日本三菱公司）；薄层色谱硅胶GF₂₅₄和柱色谱用硅胶（80～100、200～300目，青岛海洋化工厂）；其他试剂均为分析纯。

实验用皂角刺于2013年9月购自河南洛阳嵩县九店乡基地提供的出口原产地品种，经河南科技大学农学院侯典云博士鉴定为豆科植物皂荚Gleditsia sinensis Lam. 的干燥棘刺。植物标本（编号ZJ-TCB-201309）存放于河南科技大学伏牛山天然产物资源标本馆。将采收的皂角刺风干后并粉碎为40目，备用。

干燥皂角刺10.9 kg，粉碎后用90%乙醇水溶液提取3次，每次用量10.0 L，室温浸渍并超声3次以辅助提取。滤过，合并提取液减压浓缩，得皂角刺乙醇浸膏共1.13 kg。浸膏中加水搅拌，冷沉滤去不溶物后，先用石油醚除色素，再用环己烷-醋酸乙酯（2∶8）萃取。萃取液减压浓缩后得到浸膏267 g。浸膏经硅胶柱色谱分离，采用环己烷-醋酸乙酯（100∶0、80∶20、60∶40、50∶50、40∶60、20∶80、0∶100）梯度洗脱，共得到8个组分Fr. 1～8。经HPLC检测分析，采用柱色谱和半制备高效液相色谱法对环己烷-醋酸乙酯部位进行分离纯化。首先将Fr. 2～3合并制成浸膏后溶解，采用环己烷-丙酮（10∶1、8∶2、6∶4、1∶1、4∶6、2∶8）梯度洗脱，收集馏份。检查有固体析出的馏份，并通过重结晶方法分离纯化，分别得到化合物7（46 mg）、10（80 mg）和12（61 mg）；Fr. 4分别采用半制备RP-HPLC分离，甲醇-水（100∶10、80∶20、60∶40、50∶50、40∶60、20∶80）梯度洗脱并富集，得到化合物1（16 mg）和3（13.4 mg）；Fr. 5进一步用硅胶柱色谱反复纯化，再次用三氯甲烷-丙酮（9∶1、7∶3、5∶4、1∶1、4∶5、3∶7、1∶9）梯度洗脱分离，收集9∶1和7∶3馏份分别有沉淀析出，富集滤过后分别得到化合物4（71.3 mg）和5（84 mg）；滤液浓缩2次固体析出，滤过并用三氯甲烷-甲醇重结晶，分别得化合物2（24.1 mg）和6（13.9 mg）；Fr. 6通过HPLC分离，采用ODS C₁₈柱，276 nm紫外检测，甲醇-水（40∶60）洗脱，体积流量8 mL/min，得化合物8（t_R＝21 min，17 mg）和9（t_R＝29 min，15 mg）；Fr. 7用Sephadex LH-20凝胶进行柱色谱分离，用三氯甲烷-丙酮体系分离纯化得到化合物11（97 mg）。

化合物1：淡黄色固体粉末。${\text{UV}} \lambda _{\max }^{{\text{MeOH}}}$(nm): 214 (4.09),280 (3.62),326 (2.91)。$[\alpha ]_{\text{D}}^{20}$ +98.4^o。HR-ESI- MS给出准分子离子峰m/z 347.109 0 [M＋H]⁺（计算值347.108 6），提示化合物1的分子式为C₁₈H₁₈O₇。计算不饱和度为10，推测化合物为芳烃结构。化合物1的¹H-NMR谱显示在低场区有5个芳氢信号：在δ_H6.96 (1H,d,J = 1.8 Hz),6.79 (1H,d,J = 8.1 Hz),6.84 (1H,dd,J = 8.1,1.8 Hz) 提示存在ABX耦合系统质子信号；质子信号δ_H5.92 (1H,d,J = 2.1 Hz),5.87 (1H,d,J = 2.1 Hz) 为苯环上处于间位的2个质子信号。在含氧区可以观察到其他2个相关质子信号δ_H 4.90 (1H,d,J = 11.5 Hz) 和4.50 (1H,d,J = 11.5 Hz)。另有3个甲氧基信号δ_H 3.76 (6H,s) 和3.81 (3H,s)。化合物1的¹³C-NMR谱结合其DEPT谱数据显示有18个碳信号，包括1个羰基碳信号δ_C 190.3，7个季碳信号在δ_C 165.0,164.5,163.7,162.6,159.7,130.8和108.1；5个次甲基信号δ_C 128.5,121.2,115.6,95.8,93.7，以及位于高场的2个与氧相连的亚甲基信号δ_C 82.7,72.9，另有3个甲氧基碳信号在δ_C 56.2×2和55.7。以上所述的波谱学特征具有典型的二氢黄酮醇骨架结构^{[11, 12]}。

该化合物的平面结构通过2D-NMR来确定，如图 2所示，分析其¹H-¹H COSY及HSQC相关图谱确定3个结构片段：C-2-C-3、C-6-C-7-C-8、C-2′-C-1′-C-6′-C-5′。HMBC谱中，H-6与C-10 (δ_C 108.1)、甲氧基H-11与C-5 (δ_C165.0) 的相关信号表明C-5直接和1个甲氧基相连。通过比较已知该结构类型的化学位移也发现，化合物1显示C-5 (δ_C 165.0) 化学位移比C-7 (δ_C164.5) 移向更低场，是因为C-5上的氢被甲氧基或烷氧基取代后，受邻位 C-4羰基和C-3羟基影响形成的取代基数目的增加效应，导致C-5的化学位移移向低场。由此推测化合物1为C-5甲氧基取代。采用NOESY实验确证，NOESY谱可以看到甲氧基上的H-11 (δ_H 3.81) 只和H-6 (δ_H 5.87) 有NOE相关信号，因此甲氧基不可能连接在C-7位（化合物1的NOESY相关见图 3）。在HMBC谱中，还可以看到另外2个甲氧基的H-12与C-12 (δ_C 56.2) 和C-3′ (δ_C 159.7) 相关，揭示C-3′连有1个甲氧基；甲氧基H-13与C-4′ (δ_C 159.7) 相关信号证实C-4′连接C-13甲氧基；同样可以解释为因为相邻取代烷基数目的增加，如包括环上的3′和4′位都被甲氧基取代后，造成烷基或取代基拥挤效应导致的C-3′和C-4′化学位移明显移向低场。HMBC谱揭示的H-2分别与C-2′ (δ_C 128.5) 和C-1′ (δ_C 130.8) 信号相关，表明二氢黄酮醇类化合物结构的存在。

图 2

Fig. 2

图 2 化合物1的主要1H-1H COSY (▁) 及HMBC (→)相关 Fig. 2 Key 1H-1H COSY (▁) and HMBC (→) correlations of compound 1

图 3

Fig. 3

图 3 化合物1的NOESY相关 Fig. 3 NOESY correlations of compound 1

综上分析，基本可推测化合物1为5,3′,4′-三甲氧基-7-羟基二氢黄酮醇。然而根据大量文献报道^{[11, 12, 13]}，含有多甲氧基的二氢黄酮醇化合物有2类异构体，即7-甲氧基或5,7-二甲氧基的结构。该化合物为5-甲氧基-7-羟基二氢黄酮醇，未见文献报道，因此化合物1结构不同于前者任何一类，为1个新的二氢黄酮醇类化合物。

化合物1的立体结构相对构型可进一步通过它的NOESY谱信息（图 3）以及¹H-NMR谱中其H-2和H-3耦合常数的对比分析确定。基于J_邻2-3 = 11.5 Hz，判断2个氢H-2和H-3可能处于反式。根据其圆二色谱，化合物1在320 nm出现正的Cotton效应，且在210 nm出现负的Cotton效应，表明这个化合物是2R,3R-构型。故确定化合物1为 (2R,3R)- 5,3′,4′-三甲氧基-7-羟基二氢黄酮醇。经文献查阅对照和SciFinder检索，该化合物未见文献报道，确定化合物1为1个新的二氢黄酮醇化合物，命名为皂角刺二氢黄酮醇A。详细的核磁数据归属见表 1。

本实验分离的其他11个化合物的结构鉴定，通过理化性质检验和测得的波谱数据与文献报道数据对照确定。经鉴定这些化合物的NMR数据与相应的文献报道基本一致，故确定为5,7,3′,4′-四羟基二氢黄酮醇（2）^[5]、5-甲氧基-3′,4′,7-三羟基二氢黄酮醇（3）^[6]、二氢山柰酚（4）^[5]、表儿茶素（5）^[5]、5,7,3′,5′-四羟基二氢黄酮醇（6）^[5]、黄颜木素（7）^[7]、(2R,3R)-7,3′,5′-三羟基-二氢黄酮醇（8）^[8]、(2R,3R)- 5,7,3′-三羟基-4′-甲氧基-二氢黄酮醇（9）^[9]、槲皮素（10）^[7]、5,7,4′-三羟基黄酮-8-C-葡萄糖苷（11）^[9]和2,7-二甲基-氧杂蒽酮（12）^[10]。

表 1 (Table 1)

表 1 化合物1的1H-NMR和13C-NMR数据 (400/100 MHz,CD3OD) Table 1 1H-NMR and 13C-NMR data assigned of compound 1 (400/100 MHz,CD3OD) 碳位 δH δC (DEPT） 2 4.90 (1H,d,J = 11.5 Hz) 82.7 (CH) 3 4.50 (1H,d,J = 11.5 Hz) 72.9 (CH) 4 190.3 (C) 5 5.87 (1H,d,J = 2.1 Hz) 165.0 (C) 6 95.8 (CH) 7 5.92 (1H,d,J = 2.1Hz) 164.5 (C) 8 93.7 (CH) 9 162.6 (C) 10 108.1 (C) 1′ 6.96 (1H,d,J = 1.8 Hz) 130.8 (C) 2′ 128.5 (CH) 3′ 159.7 (C) 4′ 163.7 (C) 5′ 6.84 (1H,dd,J = 8.1,1.8 Hz) 115.6 (CH) 6′ 6.79 (1H,d,J = 8.1 Hz) 121.2 (CH) 5-OCH3 3.81 (3H,s) 55.7 (CH3) 3′-OCH3 3.76 (3H,s) 56.2 (CH3) 4′-OCH3 3.76 (3H,s) 56.2 (CH3)

表 1 化合物1的1H-NMR和13C-NMR数据 (400/100 MHz,CD3OD) Table 1 1H-NMR and 13C-NMR data assigned of compound 1 (400/100 MHz,CD3OD)

细胞毒活性检测参照文献报道改良的MTT测定法^[14]。所测试的3种细胞株肝癌HepG2、肺癌A549和食管癌EC109均购于上海复祥生物科技有限公司。阳性对照药为顺氯氨铂（Cisplatin）。细胞实验以相同配制的药物浓度对3株细胞系半数抑制浓度值（IC₅₀）来反映各化合物对不同细胞株的抑制作用。受试药物的不同质量浓度溶液的配制，采用100 μg/mL以PBS稀释至6个所需质量浓度，阳性对照顺氯氨铂以50 μg/mL稀释至6个所需质量浓度。体外筛选试验重复3次。当待测的12个化合物作用于肿瘤细胞48 h，观察其抑制肿瘤细胞增殖活性。结果表明，化合物1、2、3、7和10对肝癌 HepG2、肺癌A549和食管癌EC109细胞增殖均有明显的抑制活性。测得的各单体化合物对不同癌细胞株的IC₅₀值结果见表 2。表中显示，化合物1、3主要作用于肝癌HepG2和食管癌EC109细胞株，化合物2主要作用于食管癌EC109细胞株，而化合物7则对3种细胞株均有较强的增殖抑制活性。

表 2 (Table 2)

表 2 化合物1～12对3种肿瘤细胞的IC50值 Table 2 IC50 of compounds 1—12 to three kinds of tumor cells 化合物 IC50/(μg·mL−1) HepG2 A549 EC109 1 14.11 23.82 17.24 2 20.03 29.20 16.89 3 15.67 24.98 17.91 4 20.82 26.29 18.30 5 19.76 27.63 21.32 6 22.44 19.86 21.99 7 11.56 18.33 18.79 8 19.25 16.56 21.79 9 20.36 35.85 23.25 10 26.33 22.52 19.31 11 ＞35.00 ＞35.00 ＞35.00 12 29.60 41.22 37.93 顺氯氨铂 6.71 5.32 10.56

表 2 化合物1～12对3种肿瘤细胞的IC50值 Table 2 IC50 of compounds 1—12 to three kinds of tumor cells

分析比较它们的构效关系可知，二氢黄酮醇类结构中的羟基或甲氧基的数目和位置以及2-取代苯环的顺、反构型的不同，都可能会影响到它们的活性和活性强度。取代的二氢黄酮醇类化合物的进一步的构效关系和机制还有待深入研究。

上述测试结果揭示，与一般黄酮类化合物不同，二氢黄酮醇类化合物对3种肿瘤细胞株A549、EC109和HepG2增殖均有较明显地抑制作用，尤其对肝癌HepG2和食管EC109癌细胞株抑制效果显著。因此，该研究揭示二氢黄酮醇类化合物对肿瘤细胞的毒性作用，证明其可能是皂角刺中一类重要的、具抗癌药理活性骨架的成分。天然二氢黄酮醇类化合物是广泛存在于药用植物的一类功效化学成分，然而从药用植物皂角刺中首次分离纯化得到二氢黄酮醇活性成分和筛选抗癌活性，尚属首次报道。值得关注的是，从所有单体化合物的IC₅₀的测试结果可以看出，它们的IC₅₀值均小于50 μg/mL。且二氢黄酮醇化合物IC₅₀值均小于相应黄酮类化合物的IC₅₀值。另一方面它们对人体正常肺组织纤维细胞（HLF）的细胞毒性均远远小于其对3种癌细胞的毒性，因此该类二氢黄酮醇化合物极具深入研究的价值。