华盖散出自宋•陈师文《太平惠民和剂局方》，由麻黄、紫苏子、苦杏仁、陈皮、桑白皮、茯苓、甘草共7味药物组成。方中以麻黄为君，辛温解表、宣肺平喘以祛风寒。臣以紫苏子，辛香降气化痰，苦杏仁辛苦温，化痰止咳平喘，二药共降利肺气，祛痰止咳。佐药陈皮辛温，燥湿化痰、理气行滞；桑白皮腥味甘寒，泻肺利水平喘；茯苓健脾渗湿，杜绝生痰之源；三药联用共祛湿消痰。甘草为使，调和诸药。诸药配伍，解表与化痰并用，痰湿得消，表寒得散，诸证自愈^[1]。全方主治肺感寒邪、咳嗽上气、胸膈烦满、项背拘急、声重鼻塞、头昏目眩、痰气不利、呀呷有声^[2]，广泛用于临床感冒、咳嗽、哮病、喘证等肺系疾病。

近年来经典方标准汤剂与标准颗粒的研究成为热点与趋势，已纳入“十二五”重大新药创制专项，标准汤剂及颗粒的开发及在现代临床应用的适宜性已然成为亟待解决的关键问题。目前对华盖散的质量控制研究主要体现在对盐酸麻黄碱、苦杏仁苷、甘草酸、甘草苷等指标成分的定量测定方面^{[3, 4, 5]}，而从中药本身多组分、多靶点作用特点而言，对指标成分的控制无法全面反映复方中药制剂有效成分总体特征及内在质量特征。由于能较为科学、全面反映中药所含化学成分的特征，中药指纹图谱已成为中药及其复方制剂质量控制有效方法之一。本研究首次采用HPLC-DAD建立华盖散指纹图谱，对特征峰进行指认，并与单味药材指纹图谱进行谱峰匹配等溯源研究，以获得专属、整体的化学特征综合信息，为指导标准颗粒的研制及其质量的系统评价提供了理论基础。

Agilent1200-DAD高效液相色谱仪，Agilent科技有限公司；BP211D型电子分析天平，梅特勒-托利多仪器有限公司。

对照品盐酸麻黄碱（批号110749-200714，质量分数99.8%）、盐酸伪麻黄碱（批号110715-200212，质量分数99.9%）、甘草酸铵（批号110731-201317，质量分数93.1%）、甘草苷（批号111610-201106，质量分数93.7%）、橙皮苷（批号110796-200310，质量分数95.3%）和绿原酸（批号110753-201314，质量分数96.2%），均购于中国食品药品检定研究院；对照品柚皮芸香苷（批号1345-110116，质量分数98.0%）购于江西本草天工科技有限责任公司；药材购于重庆桐君阁大药房，经成都中医药大学马逾英教授鉴定，分别为麻黄科植物草麻黄Ephedrasinica Stapf的干燥根和根茎、唇形科植物紫苏Perillafrutescens (L.) Britt. 的干燥成熟果实、蔷薇科植物山杏Prun.usarmemaca L. var. ansu Maxim. 的干燥成熟种子、芸香科植物橘Citrusreticulata Blanco的干燥成熟果皮、桑科植物桑Morusalba L. 的干燥根皮、多孔菌科真菌茯苓Poriacocos (Schw.) Wolf的干燥菌核、豆科植物甘草Glycyrrhizauralensis Fisch. 的干燥根和根茎，每味药材3批。乙腈、磷酸为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为三重水。

Inertsil ODS-3 C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；流动相为乙腈-0.2%磷酸水溶液，梯度洗脱程序为0～60 min，5%～50%乙腈，线性梯度洗脱。检测波长为280 nm；体积流量0.6 mL/min，柱温30 ℃，进样量20 μL。

精密称取上述各对照品适量，分别置100 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容，作为对照品溶液。各对照品的质量浓度分别为盐酸麻黄碱103.8 μg/mL、盐酸伪麻黄碱124.0 μg/mL、绿原酸369.6 μg/mL、甘草苷411.2 μg/mL、甘草酸铵304.6 μg/mL、柚皮芸香苷122.8 μg/mL、橙皮苷107.9 μg/mL。

按每服剂量取华盖散处方，依《太平惠民和剂局方》记载加入适量纯化水，以“先文火后武火”方式煎煮一定时间后，放冷，即得华盖散标准汤剂。精密量取标准汤剂样品溶液适量，冷冻干燥后加甲醇溶解，0.45 μm滤膜滤过，即得供试品溶液。选取符合《中国药典》2010年版要求的不同批次单味药材组方，依前法得S1～S12不同批次华盖散样品溶液。每个样品平行处理3份。组成12批样品的各味药材的具体批次及来源见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 不同批次样品中单味药材批号及来源 Table 1 Batch numbers and origins of herbs in different batch samples 样品 麻黄 紫苏子 苦杏仁 茯苓 桑白皮 陈皮 甘草 编号 来源 编号 来源 编号 来源 编号 来源 编号 来源 编号 来源 编号 来源 S1 001 内蒙古包头 001 河北安国 001 甘肃平凉 001 云南丽江 001 四川凉山 001 湖南怀化 001 甘肃庆阳 S2 001 内蒙古包头 001 河北安国 001 甘肃平凉 001 云南丽江 001 四川凉山 001 湖南怀化 001 甘肃庆阳 S3 001 内蒙古包头 001 河北安国 001 甘肃平凉 001 云南丽江 001 四川凉山 001 湖南怀化 001 甘肃庆阳 S4 001 内蒙古包头 001 河北安国 001 甘肃平凉 001 云南丽江 001 四川凉山 001 湖南怀化 001 甘肃庆阳 S5 002 内蒙古鄂尔多斯 002 河南禹县 002 河南洛阳 002 云南腾冲 002 广西玉林 002 湖北宜昌 002 甘肃盐池 S6 002 内蒙古鄂尔多斯 002 河南禹县 002 河南洛阳 002 云南腾冲 002 广西玉林 002 湖北宜昌 002 甘肃盐池 S7 002 内蒙古鄂尔多斯 002 河南禹县 002 河南洛阳 002 云南腾冲 002 广西玉林 002 湖北宜昌 002 甘肃盐池 S8 002 内蒙古鄂尔多斯 002 河南禹县 002 河南洛阳 002 云南腾冲 002 广西玉林 002 湖北宜昌 002 甘肃盐池 S9 003 内蒙古鄂托克前 003 安徽亳州 003 河北承德 003 云南瑞丽 003 云南禄丰 003 重庆江津 003 甘肃中卫 S10 003 内蒙古鄂托克前 003 安徽亳州 003 河北承德 003 云南瑞丽 003 云南禄丰 003 重庆江津 003 甘肃中卫 S11 003 内蒙古鄂托克前 003 安徽亳州 003 河北承德 003 云南瑞丽 003 云南禄丰 003 重庆江津 003 甘肃中卫 S12 003 内蒙古鄂托克前 003 安徽亳州 003 河北承德 003 云南瑞丽 003 云南禄丰 003 重庆江津 003 甘肃中卫

表 1 不同批次样品中单味药材批号及来源 Table 1 Batch numbers and origins of herbs in different batch samples

分别取上述总方对应的各单味药材，粉碎成细粉，取细粉适量，并按其在总方中对应的处方量取样，加水适量，按华盖散复方煎煮方式煎煮一定时间，取滤液按“2.3”项下制备方法，制得单味药材供试品溶液。

取S1样品按“2.1”项色谱条 件连续进样6次，以橙皮苷峰为参照，考察各主要色谱峰相对保留时间及峰面积的一致性，结果表明，色谱图中各主要色谱峰的相对保留时间的RSD均小于1.3%，相对峰面积的RSD均小于2.2%，结果表明该法精密度良好。

取S1样品按“2.1”项色谱条件分别在0、2、4、6、12、24 h依次进行检测，考察各主要色谱峰相对保留时间及峰面积的一致性，结果表明，色谱图中各主要色谱峰的相对保留时间的RSD均小于1.5%，峰面积的RSD均小于3.4%，结果表明样品在24 h内稳定。

取S1处方按“2.3”项平行制备样品6份，按“2.1”项色谱条件进样，考察各主要色谱峰相对保留时间及峰面积的一致性，结果表明，色谱图中各主要色谱峰的相对保留时间的RSD均小于2.1%，峰面积的RSD均小于3.0%，结果表明该法重复性良好。

12批华盖散S1～S12按照“2.3”项平行制备供试品溶液，按照“2.1”项色谱条件测定对照品溶液和供试品溶液，并记录60 min内的色谱图，将12批样品色谱图导入药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（版本2004A）”软件，见图 1。12批样品共有26个共有峰，通过与对照品色谱图中的保留时间比对，可指认7个共有峰，其中4、5、10、17、18、20、21号共有峰分别为盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、绿原酸、甘草苷、甘草酸、柚皮芸香苷和橙皮苷。

4-盐酸麻黄碱 5-盐酸伪麻黄碱 10-绿原酸 17-甘草苷 18-甘草酸 20-柚皮芸香苷 21-橙皮苷 4-ephedrine hydrochloride 5-pseudoephedrine hydrochloride 10-chlorogenic acid 17-liquiritin 18-glycyrrhizic acid 20-narirutin 21-hesperidin 图 1 12 批华盖散样品的指纹图谱叠加图Fig.1 Fingerprints of 12 batches of Huagai San

在各批次样品图谱中，橙皮苷峰的色谱峰（21号峰）均分离良好，保留时间稳定，峰面积较大且为所有样品图谱所共有，所以确定橙皮苷为参照峰。

将所得指纹图谱导入药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（版本2004A）”软件，计算得12批样品的相似度值依次为0.978、0.965、0.979、0.990、0.992、0.988、0.998、0.982、0.998、0.984、0.990、0.995，12批样品与对照图谱比较相似度均大于0.960。结果由整体化学谱峰信息可以看出，12批次华盖散样品质量相对稳定。

系统聚类分析是在分类情况未知时对数据结构进行分析，根据相似程度的统计量把样品或指标进行归类，目前已广泛应用于中药的真伪鉴别、质量评价等方面^{[6, 7, 8, 9]}。本研究分别以华盖散指纹图谱中标定的26个共有峰的相对峰面积为变量，运用SPSS19.0统计软件，采用组间均连法，以欧氏距离的平方（squared euclidean distance）为测度，进行系统聚类分析，结果见图 2。

图 2 12 批华盖散样品的系统聚类分析Fig.2 Hierarchical cluster analysis of 12 batches of Huagai San

可见，12批样品可以分为3类，即S3～S10被聚为第1类，S1、S11、S12被聚为第2类，S2被聚为第3类，可能与药材批次间差异及产地不同有关。该系统聚类分析结果与样品的相似度分析结果基本一致。

按照“2.1”项色谱条件测定各麻黄、桑白皮、陈皮、苦杏仁、甘草、茯苓、紫苏子等药材饮片样品溶液，记录0～60 min色谱图，并在同纬度与华盖散复方色谱图进行叠加，见图 3。根据华盖散样品指纹图谱及对照品出峰源数据，比较各单味药材样品色谱峰的相对保留时间，结合紫外光谱信息，并在多波长下寻找匹配峰。结果显示麻黄、桑白皮、陈皮、苦杏仁、甘草、紫苏子分别有6、3、6、1、4、1个色谱峰与华盖散样品共有峰匹配。经过色谱图比对，峰3来自麻黄、陈皮、桑白皮、紫苏子，峰4、5、8、11、26来自麻黄药材，峰10、15来自桑白皮药材，峰2、14、20、21、24来自陈皮药材，峰9来自苦杏仁药材，峰13、17、18、25来自甘草药材。

图 3 华盖散与麻黄、桑白皮、陈皮、苦杏仁、甘草、茯苓、紫苏子谱峰匹配图 Fig.3 Peak matching fingerprints of Huagai San with Ephedrae Herba, Mori Cortex, Citri Reticulatae Pericarpium, Armeniacae Semen Amarum, Glycyrrhizae Radix et Rhizoma, Poria and Perillae Fructus

本实验建立了华盖散指纹图谱检测方法，12批华盖散图谱有26个共有特征峰，并初步对主要谱图的特征峰进行了指认，4、5、10、17、18、20、21号峰分别为盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、绿原酸、甘草苷、甘草酸、柚皮芸香苷和橙皮苷。麻黄、桑白皮、陈皮、苦杏仁、甘草、紫苏子与华盖散模式指纹图谱分别有6、3、6、1、4、1个色谱峰相匹配。

本实验尝试了乙腈-水系统、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%磷酸等不同流动相系统，结果以乙腈-0.2%磷酸系统得到的色谱峰峰形好且稳定。通过DAD检测器在200～400 nm扫描，结果280 nm波长下色谱图的色谱出峰信息最多，各成分分离情况相对较佳，故本研究选择280 nm作为检测波长。

通过对样品HPLC指纹图谱的相似度计算和聚类分析，12批样品相似度均大于0.960，根据共有峰面积比可被聚为3类，不同批次的样品图谱无明显差别，主要成分十分接近，这也验证了华盖散制剂所用原药材的基原一致性。

本实验首次建立华盖散HPLC-DAD指纹图谱，出峰数目、出峰强度及共有峰整体分离度等图谱评价信息均较佳，可较全面反映样品整体化学成分信息特征。进一步采用相似度计算及聚类分析对华盖散指纹图谱进行综合评价，结合药材与制剂指纹图谱谱峰匹配及指标成分的测定等控制标准汤剂质量，使得结果更为科学合理。本项目建立的成熟、稳定的华盖散标准汤剂质量控制方法将运用于华盖散标准颗粒的质量表征，为评价汤剂与颗粒的一致性提供依据。该法对中药复方制剂质量控制提供了一种新的思路。