2016, Vol. 47
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.20.018 |
槟榔是棕榈科（Palmae）植物槟榔Areca catechu Linn. 的干燥成熟种子，位居我国四大南药（槟榔、益智、砂仁、巴戟）之首，是54种棕榈科植物中唯一含生物碱的植物。槟榔嚼块是仅次于烟草、酒精和咖啡因的世界第4种被广泛使用的嗜好品。嚼食槟榔与口腔癌、肥胖、糖尿病、高血压、高脂血症、肝硬化和肝细胞癌等相关[1-2]，这与槟榔所含的主要生物碱成分可诱导DNA分子单链断裂，姊妹染色单体交换频率与基因突变密切相关[3-4]。槟榔碱是槟榔所含的主要生物碱，占干质量的0.1%～0.5%[5]。
近年来国内外众多学者对槟榔碱药理、毒理等方面进行了深入研究，发现槟榔碱对口腔黏膜[6]、神经系统[7]、内分泌系统[8-10]、生殖细胞[11]等均存在一定毒副作用。此外，槟榔碱还能导致广泛的肝脏代谢影响，诱导肝脏代谢酶活性升高[12-14]。
CYP2B6是人体一个重要的药物代谢酶，参与了许多药物、毒物及内源性神经递质的代谢清除。大鼠与人CYP2B6基因高度同源的是CYP2B1/2[15]。研究表明，大鼠、小鼠肝脏中CYP2B活性的升高，与肝纤维化及肝肿瘤形成有密切关系[16-17]。前期研究表明，氢溴酸槟榔碱在大鼠体内代谢产生了4个I相代谢物和2个II相代谢物[18]，且氢溴酸槟榔碱短期给药诱导了大鼠肝脏CYP2B1/2活性[14]。但氢溴酸槟榔碱体内对大鼠肝脏CYP2B1/2的调控机制目前尚不清楚。本实验研究氢溴酸槟榔碱ig给药对大鼠肝脏CYP2B1/2表达的影响及其机制，为阐明槟榔碱的毒性及药物相互作用提供参考。
1 材料 1.1 实验动物SPF级6周龄Wistar雄性大鼠，体质量200～250 g，购自湖北省实验动物研究中心，许可证号SCXK（鄂）2015-0018。
1.2 药品与试剂氢溴酸槟榔碱（Sigma，美国）；安非他酮、羟基安非他酮（Cayman Chemical，美国）；TRIzol试剂（Invitrogen，美国）；PVDF膜（millipore，美国）；蛋白酶抑制剂cocktail（Roche，瑞典）；RIPA裂解液、超敏ECL化学发光试剂盒（碧云天生物技术公司，南京）；BCA蛋白测定试剂盒（Thermo Scientific，美国）；小鼠抗β-actin单克隆抗体、兔抗组成型雄甾烷受体（CAR）单克隆抗体（Santa Cruz，美国）；小鼠抗CYP2B1/2单克隆抗体（Abcam，美国）；兔抗Lamin B抗体（武汉博士德生物工程有限公司）；山羊抗小鼠/兔辣根过氧化物酶标记二抗（KPL，美国）；定量PCR引物（Sunny，上海）；逆转录试剂盒及SYBR qPCR Mix（Toyobo，日本）；NE-PER核蛋白提取试剂盒（Thermo Fisher，美国）。
1.3 主要仪器8040型高效液相色谱质谱联用仪（岛津，日本）；组织匀浆器（IKA，德国），核酸蛋白测定仪（eppendorf，德国）；CFX ConnectTM实时荧光定量PCR仪（Bio-Rad，美国）；DYY-6C型电泳仪、DYC-40A型垂直电泳槽及DYC-40A型电转仪（北京六一生物科技有限公司）。
2 方法 2.1 实验动物分组与给药雄性Wistar大鼠随机分为氢溴酸槟榔碱（溶解于生理盐水中）低、中、高剂量［4、20、100 mg/(kg·d)］组和对照组（等体积生理盐水），每组6只。饲养温度保持在20～25 ℃，相对湿度在40%～70%，自由取食、进水，昼夜交替时间为12 h/12 h。给药前大鼠禁食12 h，每天于同一时间ig给药（给药体积小于2.0 mL），连续给药7 d。末次给药后1 h颈椎脱臼处死大鼠，取肝脏组织，用预冷生理盐水冲洗后擦干，液氮中保存备用。
2.2 荧光定量PCR检测肝脏组织CYP2B1 mRNA的表达每只大鼠取肝组织约100 mg，按TRIzol试剂盒说明书分别提取总RNA，用0.7%的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，用分光光度法检测260 nm和280 nm处吸光度比值检测总RNA的纯度。取2 μg RNA按逆转录试剂盒说明书逆转录成cDNA，cNDA再经实时荧光定量PCR扩增检测CYP2B1 mRNA的表达量。定量PCR引物序列如下，大鼠GAPDH：正向5’-AGGGCTGCCTTCTCTTGTGAC-3’，反向5’-TGGGTAGAATCATACTGGA- ACATGTAG-3’；大鼠CYP2B1：正向5’-AAGCACAGGGCCACCTTA- GAC-3’，反向5’-AAGCACAGGGCCACCTTAG- AC-3’。定量PCR实验条件为94 ℃变性15 s，58.4 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，38个循环，反应体系为20 μL。基因表达水平采用2−ΔΔCt法计算[19]。
2.3 Western blotting检测肝脏组织CYP2B和细胞内总CAR蛋白的表达取适量（约100 mg）肝组织加入800 μL裂解液中冰浴匀浆，离心取上清，用BCA试剂盒检测蛋白量。取60 μg蛋白样品经SDS-PAGE（10%分离胶与5%浓缩胶）后转移到PVDF膜上，经5%脱脂奶粉封闭1.5 h后与一抗（小鼠抗β-actin单克隆抗体，小鼠抗CYP2B1/2单克隆抗体，兔抗CAR单克隆抗体，用一抗稀释液按1∶1 000稀释）4 ℃孵育过夜。用TBST洗涤后加二抗（用脱脂牛奶按1∶5 000稀释）37 ℃温孵1 h，再用TBST洗涤，加超敏 ECL化学发光液，经显影、定影后，根据扫描条带的大小与强度分析各蛋白的表达情况。
2.4 Western blotting检测细胞核内CAR蛋白的表达取20 mg大鼠肝组织，用PBS洗涤后，500×g离心5 min，弃上清，按照核蛋白提取试剂盒说明书进行如下操作：加入预冷的CER I 200 μL，匀浆，剧烈涡旋15 s，于冰上静置10 min，然后加入预冷的CER II 11 μL，涡旋5 s，冰上静置1 min，再涡旋5 s，16 000×g离心5 min，弃上清，沉淀用预冷的NER 100 μL溶解。剧烈涡旋15 s，冰上静置10 min，再涡旋15 s，静置10 min，如此40 min（4次）。16 000×g离心10 min取上清，即为核蛋白溶液。用BCA试剂盒检测蛋白的量，取60 μg蛋白样品经SDS-PAGE（10%分离胶与5%浓缩胶）后转移到PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭1.5 h后与一抗（兔抗Lamin B抗体，用一抗稀释液按1∶400稀释；兔抗CAR多克隆抗体，用一抗稀释液按1∶1 000稀释）4 ℃ 孵育过夜。用TBST洗涤后加二抗（用脱脂牛奶按1∶5 000稀释）37 ℃温孵1 h，再用TBST洗涤，加超敏ECL化学发光液，经显影、定影后，根据扫描条带的大小与强度分析核内CAR的表达情况。
2.5 LC-MS/MS法检测CYP2B 1/2活性采用CaCl2沉淀低速离心法分别制备每只大鼠的肝微粒体（RLM），并用BCA法测定RLM中蛋白量。以安非他酮的羟基化作用表示RLM中CYP2B1/2活性（即每毫克微粒体蛋白每分钟催化探针底物产生的代谢物量）[18]。
2.6 统计学分析采用ANOVA统计学软件，数据以x±s表示，组间差异采用t检验。
3 结果 3.1 对大鼠肝脏CYP2B表达与活性的影响连续给大鼠ig 4、20、100 mg/kg氢溴酸槟榔碱7 d后，定量荧光PCR检测大鼠肝脏CYP2B1 mRNA的表达量，结果见图 1，Western blotting检测大鼠肝脏CYP2B1/2的蛋白表达量结果见图 2。结果表明，与对照组相比，给药后肝脏CYP2B1 mRNA的表达量有剂量依赖性上调趋势（P＜0.05）；对大鼠肝脏CYP2B1/2的表达量无明显影响（P＞0.05）；对大鼠肝脏CYP2B1/2活性的诱导作用随剂量增大而减弱，对照组及氢溴酸槟榔碱低、中、高剂量组CYP2B的相对活性分别为（100.0±25.7）%、（169.5±23.8）%（P＜0.01）、（151.4±11.2）%（P＜0.01）、（121.6±12.3）%（P＞0.05）。
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与对照组比较：P＜0.05 P < 0.05 vs control group 图 1 氢溴酸槟榔碱对大鼠肝脏CYP2B1 mRNA表达的影响(x±s,n = 6) Fig.1 Effect of AH on CYP2B1 mRNA expression in liver tissue of rats (x±s,n = 6) |
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图 2 氢溴酸槟榔碱对大鼠肝脏CYP2B蛋白表达的影响(x±s,n = 6) Fig.2 Effect of AH on CYP2B protein expression in liver tissue of rats (x±s,n = 6) |
3.2 对大鼠肝脏总CAR及核内CAR蛋白表达水平的影响
大鼠肝脏细胞内总CAR与核内CAR的蛋白表达量结果见图 3。结果表明，氢溴酸槟榔碱给药后，胞内总CAR蛋白表达量较对照组几乎无变化；核内CAR的蛋白表达量呈明显的上调趋势（P＜0.05）。
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图 3 氢溴酸槟榔碱对肝细胞总CAR (A) 及肝细胞核内CAR(B) 蛋白表达的影响(x±s,n = 6) Fig.3 Effect of AH on protein expression of hepatic total CAR (A) and hepatic cell intranucleus CAR (B) (x±s,n = 6) |
4 讨论
CYP2B6是重要的外源性毒物代谢酶之一，参与代谢杀虫剂（如甲氧滴滴涕）、前致癌物（如黄曲霉毒素B1、烟草中的亚硝胺类物质），以及抗肿瘤药物（如环磷酰胺、异环磷酰胺）的活化[20]，其活性可以被许多外源性物质诱导[21-26]。外源物对大鼠肝脏CYP2B1/2和小鼠肝脏CYP2B9/10的转录激活是通过CAR的核移位实现的[27-28]，CAR受体由胞浆向核内转移被认为是诱导CYP2B转录的起始步骤[29]，CAR在核内与维甲酸X受体RXR形成异二聚体CAR-RXR，然后异二聚体结合到CYP2B基因上游的苯巴比妥反应增强原件PBREM上，启动CYP2B基因的转录[30]。本研究表明，给大鼠连续ig氢溴酸槟榔碱（4、20、100 mg/kg）7 d后，肝脏中CYP2B1 mRNA表达水平与CYP2B1/2活性上调，肝细胞核内CAR蛋白量增加，且肝脏总CAR蛋白量不变，结果表明，氢溴酸槟榔碱对大鼠肝脏CYP2B的诱导作用类似于苯巴比妥及其类似物，也是通过CAR的核移位实现的。
本研究还发现，氢溴酸槟榔碱对大鼠肝脏CYP2B mRNA表达及酶活的诱导作用存在相反的剂量关系，即CYP2B1 mRNA的表达量随氢溴酸槟榔碱的给药剂量增加而增加，而酶活性虽被诱导，但却随给药剂量增加而减弱。另外，氢溴酸槟榔碱给药对肝脏CYP2B1/2蛋白表达量无明显影响，提示槟榔碱对肝脏CYP2B1/2的调控可能存在翻译后修饰和/或RNA转运和/或mRNA降解，具体是何种原因导致的，将在接下来的实验中做进一步探究。对于CYP2B酶活上调而蛋白的量无变化，可能是槟榔碱增加了底物与CYP2B的亲和力。
本研究表明，低剂量（4 mg/kg）氢溴酸槟榔碱是大鼠肝脏CYP2B活性的诱导剂，提示槟榔咀嚼嗜好者在接受CYP2B底物治疗时，存在一定的代谢相互作用风险。
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