2016, Vol. 47
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.02.010 |
2. 重庆市中药研究院, 重庆 400065
2. Chongqing Academy of Chinese Materia Medica, Chongqing 400065, China
补骨脂Psoraleae Fructus，又名破故纸，为豆科植物补骨脂Psoralea corylifolia L. 的干燥成熟果实，具有温肾助阳、纳气平喘、温脾止泻的功效[1]，用作大宗药材已有一千多年的历史。现代研究表明，补骨脂的指标成分主要包括香豆素类、黄酮类、萜酚类等[2, 3]。在补骨脂的众多炮制方法中，盐水炒制法能引药走肾，增强补骨脂补肾壮阳、固精缩尿的作用，且成本低廉，最为常用，被收载于《中国药典》2015年版补骨脂炮制品的制法项下。但是，该炮制方法未明确工艺参数：《中国药典》2015年版四部通则0213项下“盐炙法”和各地方性中药炮制规范中的炮制法，都简单叙述为“加盐水，以文火炒至微鼓起”。如此定性描述使各地炮制工艺参数不一致，造成市售补骨脂盐炙品质量参差不齐，影响临床用药有效性和安全性。
补骨脂炮制工艺的研究，多以HPLC检测补骨脂素、异补骨脂素、香豆素类、黄酮类、萜酚类等指标成分[4, 5]，采用均匀设计、正交设计或星点设计等实验设计方法[6, 7, 8]。D-最优设计是一种优化实验设计方法[9]，具有重复性好、预测性好、实验次数相对较少等优点，近年来在制药模型设计和工艺优化中得到越来越多的应用[10, 11, 12]。另一方面，UHPLC技术以其高速、高灵敏度和高分离度的优点，被越来越多地应用到了中药材的定量测定中[13, 14]，能在缩短分析时间的同时，通过减少溶剂用量来降低分析成本。
本实验以UHPLC检测补骨脂药材的9个主要指标成分［补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂甲素（补骨脂二氢黄酮）、补骨脂定、补骨脂乙素（异补骨脂查耳酮）、补骨脂宁、补骨脂查耳酮、补骨脂酚］炮制前后其量的变化，采用D-最优设计响应面法优化炮制工艺关键参数，建立参数明确、过程可控的补骨脂盐炙工艺，为提高补骨脂盐炙品的质量均一性和临床用药安全性提供了技术支持。
1 仪器与试药Shimadzu LC-30A超高效液相色谱仪系统，日本岛津公司，包括岛津LC-30AD送液单元、DGU-20A5在线脱气机、CTO-30A柱温箱、SIL-30AC自动进样器、SPD-20A紫外可见检测器、LabSolutions工作站；Sartorious CPA225D型电子天平，北京赛多利斯科学仪器有限公司；HCJYET HT-8830型手持式非接触红外测温仪（−50～550 ℃），广州市宏诚集业电子科技有限公司；Midea C21-SK2101多功能电磁炉，2100 W，220 V，广东美的生活电器制造有限公司。
补骨脂素（批号110739-200512）、异补骨脂素（批号110738-200309）对照品均由中国食品药品检定研究院提供；新补骨脂异黄酮（批号B0012）、补骨脂甲素（批号B0013）和补骨脂乙素（批号B0010）对照品均由上海融禾医药科技有限公司提供；补骨脂酚对照品（批号B0011）由上海盛中医药化工有限公司提供；补骨脂定（编号1208/7-2）、补骨脂宁（编号D41004/6-2）、补骨脂查耳酮（编号Z5143/4-1）对照品均由实验室分离得到，上述对照品质量分数均≥98%。乙腈和甲醇，色谱纯，由美国Fisher公司提供；其他试剂均为分析纯，由重庆川东化学品公司提供；水为超纯水，由杭州娃哈哈公司提供。
补骨脂药材产地为云南，经重庆市中药研究院秦松云研究员鉴定为豆科补骨脂属植物补骨脂Psoralea corylifolia Linn. 的干燥成熟果实。
2 方法与结果 2.1 UHPLC定量测定方法本实验采用的UHPLC定量测定方法是在文献报道[15]基础上，稍作改进得到。
2.1.1 色谱条件色谱柱为Shim-pack XR-ODS III色谱柱（50 mm×2.0 mm，1.6 μm；S/N 11122273）；检测波长246 nm；柱温45 ℃；体积流量0.4 mL/min；进样量4 μL；流动相为乙腈-0.2%冰醋酸水溶液，梯度洗脱：0～0.5 min，23%乙腈；0.5～1.2 min，23%～26%乙腈；1.2～1.9 min，26%乙腈；1.9～5.0 min，26%～35%乙腈；5.0～8.0 min，35%～40%乙腈；8.0～10.0 min，40%～55%乙腈；10.0～13.0 min，55%乙腈；13.0～13.5 min，55%～75%乙腈；13.5～15.8 min，75%乙腈；15.8～16.5 min，75%～95%乙腈；对照品、药材样品和炮制样品的UHPLC色谱图见图 1。
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1-补骨脂素 2-异补骨脂素 3-新补骨脂异黄酮 4-补骨脂甲素 5-补 骨脂定 6-补骨脂乙素 7-补骨脂宁 8-补骨脂查耳酮 9-补骨脂酚 1-psoralen 2-isopsoralen 3-neobavaisoflavone 4-bavachin 5-psoralidin 6-corylifolinin 7-corylin 8-bavachalcone 9-bakuchiol 图 1 混合对照品(A)、补骨脂药材样品(B)和炮制样品(C)的UHPLC图谱 Fig.1 UHPLC of mixed reference substances (A), Psoraleae Fructus samples (B), and samples of processed product (C) |
精密称取各对照品适量，分别用甲醇溶解配制成一定质量浓度的储备液；精密吸取各对照品储备液适量，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得含补骨脂素0.326 mg/mL、异补骨脂素0.165 mg/mL、新补骨脂异黄酮0.371 mg/mL、补骨脂甲素0.168 mg/mL、补骨脂定0.213 mg/mL、补骨脂乙素0.390 mg/mL、补骨脂宁0.743 mg/mL、补骨脂查耳酮0.032 mg/mL、补骨脂酚5.055 mg/mL的混合对照品溶液。
2.1.3 供试品溶液的制备取样品粉末（过3号筛）约0.5 g，精密称定，置索氏提取器中，加甲醇适量，加热回流提取2 h，放冷，转移至100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，再取2 mL提取液，用甲醇定容到10 mL量瓶中，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液，即得补骨脂药材和炮制样品供试品溶液。
2.2 炮制工艺优化根据D-最优设计结合响应曲面法，以影响补骨脂药材炮制的关键因素（闷润时间、炒制温度、加盐量）作为自变量，设计试验；为得到香豆素、黄酮和萜酚3类主要有效成分[2, 3]量高的优质盐炙品，以炮制前后3类主要成分的变化量作为因变量，以炮制前后3类主要成分量增量最大为优化目的，进行响应面结果分析，预测出补骨脂药材的最优炮制工艺参数；再结合单因素试验，筛选出补骨脂药材的最佳炮制时间，进而制定补骨脂药材的最佳炮制工艺。
2.2.1 D-最优设计方案选择闷润时间、炒制温度和加盐量作为自变量，设计因素水平分布为闷润时间（A）0～12 h；炒制温度（B）80～300 ℃；加盐量（C）0～4%；采用Design expert 8.0统计软件进行D-最优设计，试验安排见表 1。
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表 1 D-最优设计方案与结果(n=3) Table 1 Design and results of D-optimal response surface methodology(n=3) |
分别取同一批补骨脂药材各100 g，按表 1中试验设计进行炮制，药材及其炮制品分别按“2.1”项中UHPLC法进行测定，并将测得的9种主要成分划分为香豆素（补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂宁、补骨脂定）、黄酮（新补骨脂异黄酮、补骨脂甲素、补骨脂乙素、补骨脂查耳酮）和萜酚（补骨脂酚）3类，测得各成分的量见表 2。分别以香豆素类成分变化百分比（Y1）、黄酮类成分变化百分比（Y2）和萜酚类成分变化百分比（Y3）作为因变量，计算各类成分变化百分比［(炮制后成分量－生药材成分量)/生药材成分量］。结果见表 1。
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表 2 9种成分UHPLC测定结果(n=3) Table 2 Determination of nine constituents by UHPLC(n=3) |
应用Design expert 8.0对表 1中数据进行模型拟合，结果表明因变量Y1、Y3与自变量以2次项方程拟合时，r最大；而Y2与自变量以2项式交互作用拟合时r最大。拟合方程分别为Y1＝4.04＋1.54 A－0.08 B＋8.97 C－1.57×10−3 AB－0.10AC＋4.72×10−3BC－0.03 A2＋1.79×10−4 B2－1.86 C2，r＝0.9447；Y2＝40.52＋3.11 A＋0.03 B＋4.28 C－4.95×10−3 AB－0.37 AC－6.66×10−3 BC，r＝0.9136；Y3＝14.71＋1.30 A－0.09 B＋7.43 C＋2.89×10−3 AB－0.17 AC＋2.06×10−3 BC－0.06 A2＋1.19×10−4 B2－1.31 C2，r＝0.9373。
对各因变量进行的方差分析结果表明（表 3～5），Y1、Y2、Y3的拟合模型均具有显著性差异（P＜0.01），并且根据P值可知自变量对Y1、Y2和Y3产生影响的顺序为闷润时间（A）＞加盐量（C）＞炒制温度（B）。
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表 3 香豆素类成分量变化回归模型方差分析 Table 3 Analysis of variance for quantity variation regression model of coumarins |
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表 4 黄酮类成分量变化回归模型方差分析 Table 4 Analysis of variance for quantity variation regression model of flavonoids |
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表 5 萜酚类成分量变化回归模型方差分析 Table 5 Analysis of variance for quantity variation regression model of phenolic monoterpene |
由于3类成分均为补骨脂药材中主要指标成分，为得到其量高的优质炮制品，故均按得到Y1、Y2和Y3的最大值进行优化，并绘制三维响应面图（图 2）。预测最优条件为A＝12、B＝80、C＝2.10，即闷润时间12 h、炒制温度80 ℃、加盐量2.10%；预测结果Y1＝19.92%、Y2＝73.80%、Y3＝27.30%，即香豆素类成分量增加19.92%、黄酮类成分量增加73.80%、萜酚类成分量增加27.30%（Solution Desirability值0.878）。
 | 图 2 3D响应面图 Fig.2 3D response surface |
对筛选出的最优炮制工艺进行验证试验。精密称取6份补骨脂药材样品按筛选出的最优工艺参数进行炮制，结果测得香豆素类成分量增加平均值为19.95%、黄酮类成分量增加平均值为72.48%、萜酚类成分量增加平均值为26.73%。
验证值与预测值之间的RSD较小，分别为1.52%、1.06%、2.67%，数学模型预测性好，说明了D-最优设计响应面法适用于补骨脂的炮制工艺优化，其建立的炮制工艺稳定，重复性好，可操作性强，具有实际应用价值。
2.2.5 炮制终点的确定为规范工艺中对炮制终点的控制，在D-最优设计筛选出闷润时间、炒制温度及加盐量的最佳工艺参数后，本实验对炒制时间进行了单因素考察。分别取同一批补骨脂药材各100 g，按“2.2.3”项中所优化炮制工艺参数炒制10、20、30、40、50、60 min，按“2.1”项中UHPLC法进行定量测定，其香豆素类、黄酮类和萜酚类成分量变化百分比见图 3。结果表明，在炮制时间为30 min时，3类成分成分量增加最大，故炮制时间确定为30 min。最终炮制工艺为100 g补骨脂药材中加入2.10 g盐，闷润12 h后，在80 ℃下炒制30 min即可。
 | 图 3 炮制时间与质量分数变化曲线 Fig.3 Curves of stir-fried time and mass fraction variation |
在补骨脂的炮制工艺中，闷润时间、炒制温度、加盐量和炒制时间被视为直接影响盐炙品质量的关键参数，故本实验主要对上述4个参数进行了优化。但是，如果同时针对上述4个因素进行D-最优设计，所建立的实验模型中会包含过高温度和过长加热时间的炮制试验，导致补骨脂在炮制过程中发生焦化、碳化，致使药材中主要成分的量急剧下降（如图 3中30 min以后的量）。所以本实验首先针对闷润时间、炒制温度和加盐量3个因素进行D-最优设计，并暂以《中国药典》2015年版和各地方性中药炮制规范中对补骨脂盐炙终点的描述“炒至微鼓起”作为实验终点；再针对炮制时间进行单因素考察以确定炮制终点，完成补骨脂炮制工艺的优化。
3.2 自变量取值范围由于补骨脂的炮制工艺在《中国药典》2015年版和全国26个省、市、自治区所颁布的地方性中药炮制规范中均仅作出了描述性规定：“加盐水拌匀，闷透，以文火加热，炒至微鼓起；每100 kg待炮炙品用食盐2 kg”，并无明确的参数规定。本实验在自变量取值范围的选择上，以上述描述为依据进行设定：由预试验可知，在不同环境温湿度的影响下，补骨脂药材在闷润5～8 h后即可透心，故闷润时间选择在0～12 h来考察闷润对炮制结果的影响；规定补骨脂药材要“以文火加热”，文火应不超过200 ℃，故将炒制温度选择范围设定在80～300 ℃；《中国药典》2015年版和各地方性中药炮制规范中加盐量为“每100 kg待炮炙品用食盐2 kg”，故选择加盐量的考察范围为0～4%。
3.3 评价指标本实验采用UHPLC同时测定样品中9种成分的量，并将9种成分以3类结构类型作为评价指标；以该3类成分量变化百分比作为因变量进行响应面分析，以突出炮制前后成分量的变化，更直观有效地评价炮制工艺。
3.4 D-最优设计与结果分析D-最优设计可以使拟合模型回归系数方差最小化，从而提高回归模型的预测精度；与传统的正交设计、均匀设计等方法相比，具有实验次数少、信息量充分、参数预测精度高、能够实现多目标同步优化等特点，更适合多因素，多水平的实验设计建模分析。
同时，与正交设计、均匀设计、星点设计等方法相比，D-最优设计筛选出的炮制工艺更符合传统盐炙法、《中国药典》2015年版盐炙法以及各地方性炮制规范中补骨脂药材盐炙法的描述，并使粗略的定性描述得到了量化，可建立参数明确、过程可控、稳定性高、重复性好的补骨脂盐炙工艺，满足GMP生产要求，更有利于全国炮制标准的统一。
本实验首次将D-最优设计与响应面分析法结合，对药材的炮制工艺进行优化，有效地筛选出最佳工艺参数，提升炮制品内在质量，为提高补骨脂盐炙品的质量均一性和临床用药安全性提供了技术支持。
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