近年来，中药材及饮片染色问题比较严重^[1-3]。其中，蒲黄、栀子、黄柏、延胡索、石斛、黄连、黄芩、红花、丹参等中药易被黄色染料染色。迄今为止，已报道有检测方法的黄色染料有20多种，包括金橙Ⅱ（酸性橙Ⅱ、橙黄Ⅱ、酸性艳橙、金黄粉）^[4-11]、金橙Ⅰ^[8-11]、金橙Ⅳ^[9-11]、金胺O（碱性嫩黄、碱性荧光黄、金丝雀黄）^{[4, 6-9, 11]}、橙黄G（金橙G、橙黄G、耐光橙G、酸性耐光桔黄）^{[4, 9-11]}、碱性橙Ⅱ（王金黄、块黄）^{[4, 10]}、碱性橙21^{[8, 10]}、碱性橙22^{[8, 10]}、皂黄（间苯胺黄AT、酸性黄R、胺基苯磺酸黄、金莲橙G）^{[4, 9, 11]}、柠檬黄^[5-8]、日落黄^{[5-9, 11]}、冻黄（直接冻黄G、直接黄12）^[6]、络黄^[6]、亮黄（纸黄3G、灿烂黄、直接黄4）^{[8-9, 11]}、酸性橙10^[8]、酸性橙17^[8]、苏丹黄^[8]、苏丹橙G^[8]、色酚黄S^[8]、姜黄^[3]、甲基橙^[9-11]以及二甲基黄^{[9, 11]}等。因这些染料有的对皮肤黏膜有轻微的刺激，可引起结膜炎、皮炎和上呼吸道感染等症状；有的会引起中毒反应，属于接触性致癌物；有的为可疑致癌物，对肾脏有毒性等，对人体均可造成不同程度的危害^[9]，故禁止用于中药材或饮片的染色。

目前国家食品药品监督管理局虽批准了蒲黄及延胡索的补充检验方法（编号分别为2007007、2010006）^[12-13]，但仅针对这2种药材中金胺O和金橙Ⅱ非法染色进行筛查。另外，检测中药材或饮片中非法染色的文献报道较多，大多用TLC和HPLC法^{[4-6, 8, 10-11]}，未见同时检测金胺O、金橙Ⅱ、碱性橙21、碱性橙、柠檬黄、日落黄和亮黄7种常见染料的检测方法，也未见这7种色素的HPLC-MS确认方法的报道。本实验以少腹逐瘀丸［由当归、蒲黄、延胡索（醋制）等10味药组成］为研究对象，建立了用HPLC法的初筛方法和HPLC-MS法的确认方法，用于检测中药中非法添加的7种黄色染料，为监管部门的监管提供技术支撑。

Agilent1260液相色谱仪，美国Agilent公司；Waters Acquity UPLC高效液相色谱仪，美国Waters公司；TSQ QUANTUM ACCESS MAX高效液相色谱-质谱联用仪，美国Thermo fisher公司。

对照品金胺O（批号201302，供检查用）、金橙Ⅱ（批号200701，供检查用）、日落黄（批号201301，供检查用）均购自中国食品药品检定研究院；碱性橙21（批号MKBP1548V，质量分数95%）购自天津希恩思生化科技有限公司；碱性橙（柯衣定R，批号BCBD5284V，质量分数90%）购自天津化学有限公司；柠檬黄（批号GBW(E)10001a-13001，0.5 mg/mL）购自中国计量科学研究院；灿烂黄（批号A2689A，质量分数95%）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其余试剂均为国产分析纯，水为超纯水。

实验样品少腹逐瘀丸均抽自国内10个省（市、自治区），样品来源于国家计划抽验品种，共21批次，涉及6家生产企业，其中最多的为内蒙古自治区12批次，吉林5批次，天津4批次；4份蒲黄、4份延胡索药材均由相应生产企业提供；蒲黄及延胡索经山西省食品药品检验所中药室崔宇宏教授鉴定为《中国药典》2015年版收载的品种，即蒲黄为香蒲科香蒲属植物水烛香蒲Typha angustifolia L.的干燥花粉；延胡索为罂粟科植物延胡索Cordydalis yanhusuo W. T. Wang的干燥根茎。

十八烷基硅烷键合硅胶柱，DAD检测器，检测波长432 nm。以乙腈-0.05 mol/L乙酸铵水溶液，流动相系统梯度洗脱：0～12 min，10%～45%乙腈；12～20 min，45%～70%乙腈；20～40 min，70%～80%乙腈；40～41 min，80%～10%乙腈；41～46 min，10%乙腈；进样量20 μL；体积流量1 mL/min。

取日落黄、金橙Ⅱ、金胺O、柠檬黄、灿烂黄、碱性橙21、碱性橙共7种对照品适量（约10 mg），精密称定，加乙醇制成含10 μg/mL的混合对照品溶液。HPLC-MS法所用对照品溶液加70%乙醇稀释10倍。

取供试品5 g，加70%乙醇20 mL，超声处理30 min，滤过，取续滤液，即得。

取少腹逐瘀丸处方中除去蒲黄与延胡索的空白样品及处方中全部药味，按其处方比例、工艺同供试品溶液的制备方法制备去蒲黄、延胡索及处方中全部药味但色素未检出阳性的2种阴性供试品溶液。

取“2.2.1”项对照品溶液和“2.2.3”项下阴性样品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件测定。结果表明，在日落黄与碱性橙21对照品保留时间处有色谱峰出现，见图 1；但与相应对照品光谱图不一致，见图 2；2种阴性供试品溶液均无干扰，专属性良好。

1-柠檬黄2-日落黄3-灿烂黄4-金橙Ⅱ 5-金胺O 6-碱性橙21 7-碱性橙 1-tartrazine 2-sunset yellow 3-brilliant yellow 4-orange Ⅱ 5-auramine O 6-astrazon orange 21 7-basic orange 图 1 7种黄色素对照品(A)及缺蒲黄与延胡索阴性样品(B)和处方中全部药味但色素未检出阳性的阴性样品(C)的HPLC图 Fig.1 HPLC for seven kinds of yellow pigments (A) and negative sample without Typhae Pollen and Corydalis Rhizoma (B), and negative sample of pigments not checked out (C)

图 2 日落黄(A)和碱性橙21 (B)对照品(Ⅰ)以及样品中与对照品相同保留时间处色谱峰(Ⅱ)的光谱图 Fig.2 Spectrac of reference substance (Ⅰ) and chromatographic peaks with same retention time (Ⅱ) of sunset yellow (A) and astrazon orange 21 (B)

精密称取未检出7种黄色素的阴性样品，共6份，分别精密加入对照品溶液适量，按“2.2.2”项下方法进行提取制成质量浓度均为10 μg/mL的溶液，作为供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算各成分的保留时间及其RSD。结果柠檬黄、日落黄、灿烂黄、金橙Ⅱ、金胺O、碱性橙21、碱性橙的平均保留时间分别为2.5、6.7、10.5、13.6、16.5、18.8、20.5 min（图 1），RSD分别为0.3%、0.4%、0.6%、1.1%、1.2%、1.4%、0.8%。

取混合对照品溶液（均为100 μg/mL）在拟定的液相条件下连续测定6次，根据峰面积测定仪器精密度，结果显示柠檬黄、日落黄、灿烂黄、金橙Ⅱ、金胺O、碱性橙21、碱性橙的RSD分别为0.8%、1.6%、1.2%、1.8%、0.4%、1.1%、0.9%。

精密称取未检出7种黄色素的阴性样品，分别精密加入对照品溶液适量，按“2.2.2”项下方法进行提取制成质量浓度为10 μg/mL的溶液，作为供试品溶液，分别于0、4、8、12、18、24 h进样测定，根据峰面积计算RSD，结果显示柠檬黄、日落黄、灿烂黄、金橙Ⅱ、金胺O、碱性橙21、碱性橙的RSD分别为1.3%、0.6%、1.4%、0.9%、1.2%、1.6%、1.9%。

精密吸取混合对照品溶液适量，加入到未检出染色的阴性样品中，按“2.2”项方法分别制备不同质量浓度的供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进行测定，计算回收率，结果见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 7种黄色素平均回收率(x±s, n=3) Table 1 Average recovery rates of seven kinds of yellow pigments (x±s, n=3) 化合物 回收率/% 1.6 μg·g−1 2.0 μg·g−1 2.4 μg·g−1 柠檬黄 95.1±3.5 96.9±4.4 102.9±3.4 金胺O 96.6±4.2 98.1±3.5 99.8±1.3 日落黄 99.6±2.8 100.2±1.5 98.8±2.8 金橙Ⅱ 97.4±5.6 96.8±2.9 97.4±3.6 碱性橙21 98.0±3.3 97.2±3.7 100.8±2.9 灿烂黄 96.3±4.1 95.4±2.7 97.7±3.2 碱性橙 101.6±4.3 100.7±4.6 98.2±2.8

表 1 7种黄色素平均回收率(x±s, n=3) Table 1 Average recovery rates of seven kinds of yellow pigments (x±s, n=3)

使用不同液相色谱仪及不同色谱柱进行考察，Agilent 1260液相色谱仪与岛津Intersil C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，Waters Acquity UPLC高效液相色谱仪和Waters Acquity UPLC C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色谱柱，两者色谱图均具有良好的分离度，说明本方法耐用性良好。

以不同质量浓度的对照品溶液加入到未检出染色的阴性样品中，按“2.2.2”项下方法制备，以信噪比3:1时计算各色素成分的检测限，结果柠檬黄、金胺O、日落黄、金橙Ⅱ、碱性橙21、灿烂黄、碱性橙的LOD分别为2、11、31、28、14、15、11 μg/kg。结果表明，7种成分的LOD均在0.04 mg/kg以下，表明方法具有较高的灵敏度，完全能满足非法添加的检测要求。

Waters十八烷基硅烷键合硅胶柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流动相同“2.1”项，柱体积流量0.2 mL/min，电喷雾离子源，质谱检测器，ESI⁺扫描，扫描范围m/z：105～1 000，进样量1 μL，柱温30 ℃。各成分监测离子见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 7种黄色素的质谱采集参数 Table 2 LC-MS/MS parameters for seven kinds of yellow pigments 序号 色素 分子式 相对分子质量 母离子(m/z) 子离子(m/z) 碰撞能量/eV 1 柠檬黄 C16H9N4O9S2Na3 534.36 469 200 15 2 金胺O C17H21N3·HCl 303.84 268 147 30 3 日落黄 C16H10N2Na2O7S2 452.36 409 236 20 4 金橙Ⅱ C16H11N2NaO4S·5H2O 350.32 327 156 30 5 碱性橙21 C22H23ClN2 350.88 314 299 30 6 灿烂黄 C26H18N4Na2O8S2 624.55 571 346 15 7 碱性橙 C13H14N4 226.28 213 121 15

表 2 7种黄色素的质谱采集参数 Table 2 LC-MS/MS parameters for seven kinds of yellow pigments

根据上述方法对企业提供的4份蒲黄药材、4份延胡索药材进行测定。8份药材中，只有1批次蒲黄检出金胺O，并进行了质谱确认，色谱图及质谱图见图 3。其余色素均未检出。

图 3 样品(批号120114)中金胺O的色谱及质谱图 Fig.3 HPLC and LC-MS/MS of auramine O in samples

按照上述方法对国家评价性抽验抽取的21批次少腹逐瘀丸样品进行检验，结果发现未检出金胺O的有18批次，占85.7%；检出金胺O的有3批次，占14.3%，涉及3个企业。检出金胺O的样品均通过HPLC-MS方法进行了确认。其余色素均未检出。

中药及保健食品中的非法添加问题已引起学者及监管机构的密切关注^[14-19]。目前国家食品药品监督管理局虽批准了蒲黄及延胡索非法染色的补充检验方法（编号分别为2007007、2010006）^[12-13]，但仅针对这2种药材分别检测金胺O和金橙Ⅱ的非法染色，没有其他黄色类染料的检测标准，虽然本次实验未发现其他黄色类染料添加，但不排除存在隐患。经方法学研究发现，7种染料或色素的HPLC检测方法及HPLC-MS确认方法专属性及耐用性等都较好，操作简便、适用范围广、灵敏度高，适合用于中药及中药制剂中黄色染料或色素非法染色的检测。

流动相曾考察甲醇-水、甲醇-乙酸铵水溶液以及乙腈-乙酸铵水溶液，结果发现乙腈-乙酸铵水溶液洗脱，各成分分离以及峰形较好，故选择此流动相。在测定波长选择上，由于各色素的最大吸收波长不同，但均在350～480 nm有较大的吸收，故选择432 nm进行监测，对于供试品中的共有峰可以用DAD光谱图进行比对。

提取色素的方法有聚酰胺吸附法、液液萃取法、固相萃取法，超声提取法等。考虑到前几种方法较繁琐、溶剂消耗大，不利于用于快速检测，故选择超声提取法。曾比较了乙醇、甲醇、水3种提取溶媒及其不同比例的溶液提取效率，结果表明70%乙醇提取30 min，提取效率最高，且色谱图中杂峰少，峰形较好，故选择70%乙醇提取。

亮黄仅见文献有TLC鉴别及HPLC法检测^[4]，未见液质联用方法检测的报道。另外，碱性橙检测未见文献报道。本实验提供了此2种色素的检测供参考。建议今后关注食品用合成色素的使用及检测，尤其是价格低廉的水溶性色素，易被用于中药的非法染色，需进一步研究和建立更多成分的检测方法。