2. 绵阳师范学院生命科学与技术学院, 四川 绵阳 621000
2. College of Life Science & Biotechnology, Mianyang Normol University, Mianyang 621000, China
半夏Pinelliae Rhizoma为天南星科(Araceae)植物半夏Pinellia ternate (Thunb.)Bteit.的干燥块茎,具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结等功效[1]。四川为半夏主产区之一,古今皆有记载,其中以南充、武胜、安岳、达州等地产量大、质量较优[2]。近年来,由于过度采挖,半夏野生资源遭受严重破坏。人工栽培成为解决半夏资源枯竭问题、满足市场需求的有效途径之一。半夏含有多种化学成分,主要包括生物碱类、有机酸类、核苷类、挥发油类等,其中核苷类成分是生物细胞维持生命活动的基本组成元素,参与DNA代谢过程,具有抗肿瘤、抗病毒、基因治疗等多种生物活性[3],是半夏药材中含有的很重要的一类有效成分,量较高的有鸟苷、尿苷,国内外均有学者以鸟苷及尿苷为指标对半夏的水溶性成分的量进行检测[4-5]。
主成分分析法是将众多指标性状转化为少数综合指标的一种统计分析方法,将复杂问题通过降维方式变得简单直观,目前已被广泛应用于果蔬品质评价因子的筛选和品质的综合评价。前人主要对半夏施肥[6-8]、种植密度[9-11]、种茎规格[12-15]、生长调节剂[16-17]、播种期[18]及采收期[19]等栽培措施对其产量和质量的影响进行了研究,对主要农艺性状与产量、质量的相关性研究甚少,仅见张君毅等[20-22]的报道,且由于所考察性状、研究材料、栽培环境等有所差异,各自的结论不尽相同。目前,尚未见采用主成分和聚类分析方法综合研究四川产半夏产量和品质的报道。本实验以22份川产半夏作为研究对象,通过主成分及聚类分析方法对其产量和品质性状进行综合评价,以寻求川产半夏产量与品质评价的主要因素,为构建川产半夏的产量和质量综合评价体系提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 1.1材料供试材料来自于四川阆中、乐山、宜宾等地,共22份,除材料1为栽培居群外,其余均为野生居群,经四川省中医药科学院舒光明研究员鉴定为半夏Pinellia ternate (Thunb.)Bteit.。样品来源见表 1。
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表 1 样品编号及来源 Table 1 Accession numbers and its sources of tested samples |
1.2 仪器与试剂
Agilent 1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司),UV-1800紫外可见分光光度计(日本岛津公司),电子分析天平(德国Sartorius BS110S型十万分之一),KQ2200型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司),DHG-9140电热鼓风干燥箱,尿苷对照品(成都瑞芬思生物科技有限公司,批号N-025-150730),鸟苷对照品(成都瑞芬思生物科技有限公司,批号N-021-150730),质量分数均大于98%。甲醇(色谱纯,Tediacompany,Inc.,905900),水为超纯水其他试剂均为分析纯。
1.3 农艺性状试验于2015年3月在四川省乐山市犍为县五四村半夏试验地进行。试验地前作为玉米,地势平坦,肥力均匀,壤土,土壤养分如下:pH值7.53,全钾、全氮、全磷、有机质质量分数分别为36.77、0.62、0.10、82.40 g/kg,速效氮、有效磷及速效钾量分别为141.40、51.27、179.33 mg/kg。用随机区组设计,3次重复,小区面积3 m2(3 m×1 m),株行距3 cm×7 cm,每3行播种100粒(株),每平方米播种500粒(株),栽培及田间管理同大田生产。9月下旬取样3行(100株),室内考察100株种茎产生的大(块茎直径≥1.5 cm)、中(1.0 cm≤块茎直径<1.5 cm)、小(块茎直径<1.0 cm)块茎粒数及其块茎总鲜质量,取平均值得到大、中、小粒单粒质量及其所占比例,并结合播种量及实收产量折算得到单株产量、增产率及增殖率。另随机取样10株,考察株高、单株叶质量,大、中、小粒直径,并以平均值进行统计分析。
1.4 尿苷及鸟苷的测定 1.4.1 色谱条件色谱柱为Zorbax Eclipse C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相为甲醇-水(2∶98);体积流量0.8 mL/min;检测波长260 nm;柱温35℃;进样量10μL。
1.4.2 混合对照品溶液的制备取尿苷和鸟苷对照品适量,精密称定,加水配制成每1 mL含尿苷114 mg、鸟苷0.115 mg混合对照品溶液I。精密吸取对照品溶液I 1 mL于10 mL量瓶中,用水定容至刻度,摇匀,即得混合对照品溶液Ⅱ。
1.4.3 供试品溶液的制备取各产地的半夏粉末约1 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加水20 mL,精密称定质量,超声处理(功率100 W,频率40 kHz)30 min,放冷,用水补足减失质量,滤过,即得。
1.4.4 线性关系考察分别精密吸取混合对照品溶液0.1、0.5、1、3、5、10、15、20、25、30μL,注入液相色谱仪,按“1.3.2”项下色谱条件测定尿苷和鸟苷峰面积,以对照品进样量为横坐标(X),以峰面积为纵坐标(Y)进行回归分析,得回归方程为尿苷:Y=2 471.5 X-3.674 7,r=0.999 9;鸟苷:Y=2 031.2 X-4.181 6,r=0.999 9;尿苷在2.9~855.0 ng、鸟苷在2.9~862.5 ng内呈良好的线性关系。
1.4.5 样品测定取供试材料样品适量,按“1.4.2”项下的方法制备供试品溶液,同时按“1.4.1”项下色谱条件测定,采用外标一点法计算川产半夏药材中尿苷及鸟苷量。
1.5 数据统计分析利用Excel进行数据平均值、标准差及变异系数的分析;利用DPS 7.05软件[23]进行相关、主成分及聚类分析;依据方差累计贡献率≥90%的标准提取主成分,以各主成分对应的方差贡献率作为权重,对主成分得分和相应的权重进行线性加权,构建川产半夏居群的评价函数;主成分聚类分析按欧式距离类平均法进行系统聚类。
2 结果与分析 2.1 主要农艺性状、尿苷及鸟苷量表现及方差分析各材料主要农艺性状、尿苷及鸟苷量表现及变异分析结果见表 2。从表 2可以看出,半夏不同居群间14个农艺性状、尿苷及鸟苷量的变异幅度较大,存在极显著的差异。各个性状的峰度均小于1,分布频率大致接近正态分布,表明可对这17个性状进行相关分析。
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表 2 主要农艺性状、尿苷及鸟苷量的表现及方差分析 Table 2 Performance and variance analysis of main agronomic characters and contents of uridine and guanosine of P. ternata from Sichuan |
在22份川产半夏中,材料2的株高、单株叶质量最高,其单株产量、尿苷量、鸟苷量、尿苷及鸟苷总量均较高;材料4单株产量最低;材料6的大粒直径、中粒直径、中粒单粒质量、小粒单粒质量、单株产量和增殖率均最高,但其尿苷量、鸟苷量、尿苷及鸟苷总量均最低;材料11的大粒直径最小;材料13的株高、单株叶质量、中粒直径、小粒单粒质量、小粒率均最低,但其小粒率最高,其单株产量亦很低;材料16的中粒率、尿苷量、鸟苷量、尿苷及鸟苷总量均最高;材料20的小粒直径最高。
变异系数是衡量性状表现的差异程度、变异范围的量。供试材料17个性状的变异系数存在明显差异,变异系数由大到小依次为增产率>单株叶质量>增殖率>大粒率>小粒单粒质量>单株产量>中粒率>大粒单粒质量>小粒率>中粒单粒质量>株高>鸟苷量>尿苷量>尿苷及鸟苷总量>小粒直径>中粒直径>大粒直径。增产率、单株叶质量、增殖率、大粒单粒质量、小粒单粒质量、大粒率、中粒率、单株产量的变异系数较大,均在30%以上,说明这些性状选择的潜力大,受环境影响较大。大粒直径、中粒直径、小粒直径、尿苷量、鸟苷量、尿苷及鸟苷总量的变异系数相对较小,均在25%以下,说明这些性状受本身内在因素决定,受环境因素的影响较小。因此,改善环境,提高单株叶质量、大粒单粒质量、小粒单粒质量,进而提高单株产量、增产率和增殖率是实现川产半夏高产的有效途径。
2.2 主要农艺性状、尿苷及鸟苷量的相关分析相关分析表明,其他性状与单株产量的相关系数绝对值由大到小依次为增殖率>中粒单粒质量>中粒直径>小粒单粒质量>小粒直径>大粒直径>大粒单粒质量>单株叶质量>大粒率>增产率>小粒率>株高>中粒率。即以增殖率与单株产量间的相关系数最大,中粒率与单株产量的相关系数最小,见表 3。
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表 3 主要农艺性状、尿苷及鸟苷量的相关分析 Table 3 Correlation analysis on main agronomic characters and contents of uridine and guanosine in P. ternata |
尿苷量与单株叶质量、大粒直径等14个农艺性状均相关而不显著,但与鸟苷量、尿苷及鸟苷总量呈极显著正相关。鸟苷量与大粒直径、大粒单粒质量、中粒直径、中粒单粒质量呈显著或极显著的负相关。尿苷及鸟苷总量与大粒直径、大粒单粒质量呈显著或极显著的负相关。
在各性状中,单株产量与中粒直径、中粒单粒质量、小粒直径、小粒单粒质量、增殖率等呈极显著的正相关,但与小粒率、增产率呈负相关;小粒单粒质量与大粒单粒质量、中粒直径、中粒单粒质量、小粒直径等呈显著或极显著的正相关,株高与单株叶质量、中粒率呈极显著的正相关,大粒单粒质量与中粒直径、中粒单粒质量、小粒单粒质量呈显著或极显著正相关,中粒单粒质量与中粒直径呈极显著正相关,小粒直径却与中粒直径及中粒单粒质量呈极显著正相关。大粒单粒质量、中粒直径、中粒单粒质量、小粒单粒质量和大粒直径呈极显著正相关。此外,大粒率与中粒率、单株产量呈的正相关外,与株高、单株叶质量及增殖率等其他12个性状均呈负相关,且与小粒率的相关系数达到极显著水平;小粒率亦与除大粒单粒质量、小粒直径、增产率及增殖率等4个性状之外的其余9个性状呈负相关,且与大粒率、中粒率达极显著负相关。因此,在性状选择时,要充分考虑性状间的相互制约,注重对大、中、小粒单粒质量及增殖率的选择,放宽对大、中、小粒直径的选择,适当控制大粒直径、中小粒率,只有各性状互相协调,才能选出高产川产半夏品种。
2.3 主要农艺性状、尿苷及鸟苷量的主成分分析对川产半夏的主要性状进行主成分分析,结果显示前6个主成分的累积贡献率为89.829%>85%(表 4),表明前6个主成分已基本包含了川产半夏性状的全部信息,可用前6个主成分对其进行综合评价。第1主成分的特征值为5.546,贡献率为32.623%。决定第1主成分的主要是大粒直径、大粒单粒质量、中粒直径、中粒大粒重、小粒直径、小粒单粒质量,其载荷值均为正值,称为块茎形态因子。第2主成分的特征值为3.396,贡献率为19.977%,决定第2主成分的主要是中粒率,其次为株高、单株叶质量,其载荷值均为正值,尿苷量、鸟苷量、尿苷及鸟苷总量的载荷值亦为较大正值,称之为株型品质因子。第3主成分的特征值为2.319,贡献率为13.640%,起决定作用的是增殖率,称为增殖率因子。第4主成分的特征值为1.776,贡献率为10.450%,起决定作用的为大粒率,其载荷值为较大负值,称为大粒率因子。第5主成分的特征值为1.339,贡献率为7.877%,起决定作用的是增产率和增殖率,其中,增产率载荷值为正值,增殖率载荷值为负值,称为增产低殖因子。第6主成分的特征值为0.895,贡献率为5.263%,起决定作用的是增产率,称为增产率因子。
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表 4 6个主成分的特征值、贡献百分率、累计贡献率及其特征向量 Table 4 Eigen values, contribution, accumulative contribution, and eigen vector of six principal components |
2.4 不同川产半夏居群的综合评价
以各主成分对应的方差贡献率作为权重,对主成分得分和相应的权重进行线性加权,构建川产半夏评价函数:F=0.322 6 F1+0.199 8 F2+0.136 4 F3+0.104 5 F4+0.078 8 F5+0.052 6 F6,计算各居群的综合评价分值,分值越高表示该居群综合评价越好。
在主成分综合统计结果基础上计算出供试的22份川产半夏的产量和品质的综合评价得分(表 5)。结果表明,在所有的供试材料中,来自成都市大邑县王泗镇文笔村的样品6评价得分最高(1.231),其次为样品1和16,样品2、5、16、20综合评分均在0.700以上,样品3、7、9、10、13的评价得分均在-1.000以下,样品4、8、12、15、17和21等6份的评价得分在-0.700~0内,来自乐山市犍为县金石井镇五四村2组的样品13的评价得分最低(-1.846)。
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表 5 22份川产半夏的产量与品质的综合评价得分 Table 5 Comprehensive evaluation of 22 P. ternata from Sichuan province for yield and quality |
2.5 川产半夏产量与品质性状的聚类分析
根据不同产地川产半夏居群产量与品质性状,可将22份种质资源分成4类,聚类图详见表 6及图 1。从图 1可以看出,第1类由3、4、7及17等8份材料组成,该类大粒直径、大粒单粒质量、中粒直径、中粒及大粒重、小粒直径、小粒单粒质量、单株产量均最低,但增产率、增殖率、尿苷量、鸟苷量、尿苷及鸟苷总量较高,属于低产优质型材料。材料6单独组成,该类大粒直径、大粒单粒质量、中粒直径、中粒单粒质量、小粒直径、小粒单粒质量、大粒率均最高,增产率、单株产量亦较高,但其小粒率、增殖率、尿苷量、鸟苷量、尿苷及鸟苷总量均最低,属于高产劣质型材料。第3类由材料2和16组成,此类材料株高、单株叶质量、中粒率、增产率、尿苷量、鸟苷量、尿苷及鸟苷总量最高,但大粒直径、大粒率最低,属于高杆增产优质型材料。第4类由材料1、5、11及22等11份材料组成,该类材料株高、中粒直径、中粒率及增产率最低,小粒率、增殖率及单株产量最高,尿苷量、鸟苷量、尿苷及鸟苷总量亦较高,属于矮杆高增殖型材料。
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表 6 基于主要农艺性状及尿苷和鸟苷量的分类 Table 6 Classification based on main agronomic characters and contents of uridine and guanosine |
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图 1 22份川产半夏产量与品质性状的聚类图 Fig.1 Cluster diagram based on yield and quality characters of 22 P. ternata from Sichuan province |
3 讨论
各供试材料的单株产量性状变化较大,在所有的供试材料中,就产量而言,6号材料表现最优,其单株产量、增殖率、小粒单粒鲜质量均最高,大、中、小粒直径较大且其比例适中,增产率亦较高,值得进一步选育推广。本试验是通过各农艺性状对单株产量的分析结果,对于群体产量结果如何,还值得进一步探讨。
在各种问题的多指标分析中,指标的个数多,又有相互关联,分析工作比较困难。多元统计的主成分分析是指在不损失或很少损失原有信息的前提下,将原来个数较多而且彼此相关的指标转换为新的个数少而彼此独立或不相关的综合指标,从而简化多指标分析[24]。很多研究表明,主成分分析方法进行综合评价是一种有效的方法[25, 26]。川产半夏数量大、质量好,是我国半夏药材的主要生产区之一。同时,四川野生半夏也是我国半夏栽培的主要种源之一,特别是甘肃、云南、贵州、重庆几个省市栽培半夏种源的主要来源之一。但目前生产上存在栽培品种单一、混杂、种质资源退化现象,严重制约其产量和品质的提高。由于半夏育种程序较复杂,不仅要考虑其产量,而且要考虑到有效成分量,这使得其品种选育进展缓慢,优良品种品系少。本实验采用主成分分析方法,将22份川产半夏种质资源的14个农艺性状和3个质量性状简化为彼此不相关的综合指标(主成分):即块茎形态因子、株型品质因子、增殖率因子、大粒率因子、增产低殖因子和增产率因子,这6个主成分对总变异的累积贡献率约达85%以上。从主成分综合质量评价结果可以看出,4类川产半夏质资源均有各自不同的优良特性,可从中选择优质种质资源加以推广,加快川产半夏优良品种的选育工作。
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