红芪为豆科植物多序岩黄芪Hedysarum polybotrys Hand. -Mazz.的干燥根^[1]，是甘肃的道地药材。具有补气固表、利尿排毒、敛疮生肌等功效^[2]。现代药理研究表明，红芪具有提高免疫功能的作用^[3]。《中国药典》2010年版关于红芪的质量控制只有常规的鉴别和浸出物的检查，中药指纹图谱能表征中药所含的物质成分，符合中医理论的整体性和中药作用机制的模糊性，本课题组前期曾进行红芪指纹图谱的研究^[4]。然而，中药作为一个多组分、多靶点综合作用的复杂整体，其药效的体现与指纹图谱中化学指标成分的体现并不是完全一致的，因此仅仅研究药材的化学指纹图谱是远远不够的。只有将中药指纹图谱中化学成分的变化跟中药药效结果联系起来建立起有实际意义的中药谱-效关系，才能为中药的质量控制和药效评价标准提供规律性的科学依据^{[5, 6, 7]}。偏最小二乘回归（partial least-squares regression，PLS）是一种由数据样本进行建模的统计回归方法，集多元线性回归、主成分分析和典型相关分析的基本功能为一体，可以较好地解决自变量之间多重相关性、样本点容量少于变量个数等一般回归分析方法无法解决的问题^[8]。

本课题组在探讨红芪药材（甘肃宕昌野生）中不同极性部位提高机体免疫功能作用的同时，发现红芪水提部位作用最显著，进而研究了另外12批不同产地、不同生长年限红芪药材水提部位的指纹图谱和提高机体免疫功能的作用，通过PLS法研究其谱效关系，为全面评价红芪药材的质量提供技术支持，也为进一步指导临床合理用药奠定基础。

SPF级昆明小鼠，体质量18～22 g，由兰州大学动物实验中心提供，许可证号SYXK（甘）2014-0005。

红芪药材为甘肃各地采集或购买的种植或野生红芪，共13批，经兰州大学药学院周印锁教授鉴定均为红芪Hedysarum polybotrys Hand. -Mazz.正品；对照品腺苷（购自中国食品药品检定研究院，批号110819-200202）、芒柄花苷（购自上海顺勃生物工程有限公司，批号201206）、金雀异黄酮（购自上海源叶生物科技有限公司，批号20130412）、芒柄花素（购自中药国体制剂制造技术国家工程中心，批号1054-090402）、美迪紫檀素（购于上海一林生物科技有限公司，批号130120），质量分数均大于98%；乙腈为色谱纯（德国默克公司）；水为超纯水；二硝基氟苯（DNFB，西亚反应研究中心）；硫化钠（天津市恒兴化学试剂有限公司）。

2695高效液相色谱仪，美国Waters公司（包括717自动进样器、2996二极管阵列检测器、Millennium32色谱管理站）；数据处理软件：SIMCA13.0软件（Umetrics公司）。

称取红芪药材（甘肃宕昌野生）300 g，用6倍量的95%乙醇回流提取，共提取3次，每次1 h，合并提取液，将提取液减压浓缩至无醇味，取出50 mL作为总提取物（出膏率6.110%）；其余用石油醚萃取，重复3～5次，分出上层，合并，萃取液浓缩成浸膏，得到石油醚部位（出膏率0.775%）；下层溶液用醋酸乙酯萃取，重复3～5次，分出上层，合并，萃取液浓缩成浸膏，得到醋酸乙酯部位（出膏率0.204%）；下层溶液浓缩至干，加乙醇超声溶解10 min，得到乙醇部位（出膏率0.649%）；乙醇不溶解部分加水溶解，得水提部位（出膏率3.433%）；其余12批药材样品处理过程相同。根据各提取部位出膏率，按原生药20 g/kg给药，称取浸膏，加聚山梨酯80（0.3%）制成混悬液。

取小鼠60只，雌雄各半，随机分为6组：对照组，红芪总提取物、石油醚部位、醋酸乙酯部位、乙醇部位、水提部位组，每组10只。对照组ig给予生理盐水，红芪各提取部位（均来自甘肃宕昌野生红芪）组分别ig给予相应部位浸膏混悬液20 g/kg（生药剂量），每天1次，连续给药15 d。给药第10天，小鼠腹部皮肤用硫化钡脱毛，范围3 cm×3 cm，用1% DNFB溶液50 μL均匀涂抹致敏，5 d后，用DNFB溶液10 μL均匀涂抹于小鼠右耳（两面）进行攻击。攻击后24 h颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳，用打孔器取下直径6 mm的耳片，称质量。用左右耳片质量差值表示DTH的程度^[9]。结果见表 1。水提部位组左右耳片质量差值最大，表明其提高免疫功能作用最强，与对照组比较，差异显著（P＜0.05）。故后续实验研究另12批红芪药材水提部位的谱效关系。

表 1(Table 1)

表 1 红芪不同提取部位对DNFB诱发小鼠DTH的影响 $\left( {\bar x \pm s,n = 10} \right)$ Table 1 Effects of different extract fractions from Hedysari Radix on DTH of mice induced by DNFB (±s,n = 10) $\left( {\bar x \pm s,n = 10} \right)$ 组别 剂量/(g∙kg−1) 耳片质量差值/mg 对照 — 1.35±1.37 总提取物 1.222 0 1.83±1.72 石油醚提取部位 0.155 0 1.99±1.12 醋酸乙酯部位 0.040 8 3.24±2.10 乙醇部位 0.129 8 2.24±1.42 水提部位 0.686 6 3.89±3.04 与对照组比较：P＜0.05，表 2同 P < 0.05 vs control group,Table 2 is same

表 1 红芪不同提取部位对DNFB诱发小鼠DTH的影响 $\left( {\bar x \pm s,n = 10} \right)$ Table 1 Effects of different extract fractions from Hedysari Radix on DTH of mice induced by DNFB (±s,n = 10) $\left( {\bar x \pm s,n = 10} \right)$

2.1.3 12批红芪药材水提部位对DNFB诱发小鼠DTH的影响

取小鼠130只，雌雄各半，随机分为对照组和12批红芪药材水提部位给药组，每组10只，给药组分别给予12批不同产地红芪药材水提部位的混悬液，其余操作与“2.1.2”项下方法相同。12批不同产地红芪药材水提部位组左右耳片质量差值不同，表明红芪药材提高免疫功能的能力也不尽相同，结果见表 2。其中来自甘肃武都1、武都米仓山和陇西县首阳镇红芪药材的水提部位组耳片质量差值与对照组比较明显增加（P＜0.05）。

表 2(Table 2)

表 2 12批红芪药材水提部位对DNFB诱发小鼠DTH的影响 $\left( {\bar x \pm s,n = 10} \right)$ Table 2 Effects of aqueous extract from 12 batches of Hedysari Radix on DTH of mice induced by DNFB $\left( {\bar x \pm s,n = 10} \right)$ 样品编号 样品来源 耳片质量差值/mg 对照 — 0.83±0.56 S1 甘肃武都1（野生） 2.17±1.12 S2 甘肃武都5年（野生） 1.47±1.08 S3 甘肃陇南西河3年（野生） 1.45±0.72 S4 甘肃武都米仓山（种植） 1.43±0.52 S5 甘肃宕昌哈达铺镇（种植） 1.27±0.79 S6 甘肃陇西县菜子乡（种植） 1.30±0.53 S7 甘肃岷县（野生） 1.49±0.80 S8 甘肃宕昌官亭（种植） 0.82±0.44 S9 甘肃宕昌（野生） 1.30±0.27 S10 甘肃宕昌将台（种植） 0.51±0.56 S11 甘肃陇西县首阳镇（野生） 2.17±1.24 S12 甘肃武都2（种植） 1.09±0.69

表 2 12批红芪药材水提部位对DNFB诱发小鼠DTH的影响 $\left( {\bar x \pm s,n = 10} \right)$ Table 2 Effects of aqueous extract from 12 batches of Hedysari Radix on DTH of mice induced by DNFB $\left( {\bar x \pm s,n = 10} \right)$

2.2 HPLC指纹图谱测定 2.2.1 色谱条件

色谱柱为Hypersil ODS C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈和0.1%甲酸，梯度洗脱：0～10 min，4%～10%乙腈；10～30 min，10%～40%乙腈；30～65 min，40%～60%乙腈；65～66 min，60%～100%乙腈；66～70 min，100%乙腈；体积流量为1.0 mL/min，柱温为30 ℃，检测波长为275 nm。

精密称取腺苷、芒柄花苷、金雀异黄酮、芒柄花素、美迪紫檀素对照品适量，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释制成一定质量浓度的对照品溶液。

将提取所得的各批红芪水提部位浸膏干燥，分别取2.0 g，精密称定，加甲醇超声溶解转移至10 mL量瓶中，定容至刻度，摇匀，即得供试品溶液。用微孔滤膜（0.45 μm）滤过后备用。按“2.2.1”项下色谱条件进样20 μL，得HPLC图（图 1）。

4-腺苷 18-芒柄花苷 21-金雀异黄酮 22-芒柄花素 24-美迪紫檀素 4-adenosine 18-ononin 21-genistein 22-formononeti24-medicarpin图 1 12批红芪水提部位HPLC色谱图 Fig.1 HPLC ofaqueous extract from 12 batches of Hedysari Radix

2.2.4 HPLC图谱峰的归属

按“2.2.1”项下色谱条件，所得12批药材水提部位指纹图谱，根据国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004年A版进行相似度评价。以12批红芪药材的相对峰面积的均值作为对照模板，由中药色谱图分析和数据管理软件自动进行峰匹配，确定26个共有峰（表 3）。其中4、18、21、22、24号峰分别与对照品腺苷、芒柄花苷、金雀异黄酮、芒柄花素、美迪紫檀素的保留时间和紫外光谱图一致。利用夹角余弦法计算指纹图谱的相似度，结果见表 4。可知，12批红芪药材的相似度在0.8以上，相似度较高。以腺苷对应的4号峰为参照峰（相对保留时间为1.00），计算色谱图中各共有峰的相对保留时间，结果见表 5。

表 3(Table 3)

表 3 共有峰峰面积 Table 3 Peakareas of common peaks 样品 共有峰峰面积 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 S1 2 766 318 1 467 744 43 828 156 896 12 026 524 2 682 946 359 324 375 651 303 376 1 409 736 99 091 146 402 639 877 S2 954 314 537 865 58 213 85 923 1 244 800 78 220 33 415 94 433 170 182 1 480 250 312 051 97 005 218 075 S3 1 039 184 779 417 60 867 101 972 1 425 937 49 653 92 824 176 954 454 676 527 514 370 160 122 837 168 160 S4 1 063 269 716 711 59 368 188 893 2 436 358 122 886 70 437 124 753 455 752 451 130 268 926 147 830 258 477 S5 865 301 692 251 68 844 261 083 2 770 823 55 135 229 631 230 062 228 663 1 165 567 391 443 295 854 258 430 S6 558 744 412 178 35 752 128 639 1 687 676 57 975 105 487 56 694 440 891 1 246 456 94 616 126 296 119 098 S7 2 241 759 1 706 353 70 654 245 693 12 058 180 464 225 107 657 915 947 166 299 1 253 381 750 885 185 564 1 093 355 S8 1 540 769 936 077 42 475 196 154 7 477 300 699 345 21 803 707 820 6 771 819 030 814 805 119 041 605 511 S9 954 302 536 163 38 608 171 989 7 665 860 186 332 75 230 109 408 29 200 59 276 135 343 43 122 94 206 S10 1 084 179 682 741 72 891 107 683 2 102 510 146 236 181 220 96 515 223 976 868 223 233 630 85 461 109 064 S11 1 818 422 792 084 41 854 60 776 7 027 934 1 511 735 80 815 397 011 92 319 282 720 336 519 362 445 353 S12 983 019 784 200 54 937 196 743 1 848 157 77 346 40 054 148 762 264 569 1 188 210 359 542 138 686 253 822 样品 共有峰峰面积 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 S1 254 564 215 661 77 208 224 093 674 731 98 913 32 432 3 836 58 675 12 424 9 849 42 753 3 195 S2 141 775 128 060 142 455 123 662 1 130 915 186 770 115 554 32 756 688 747 134 126 234 713 37 667 50 207 S3 103 767 169 419 79 879 92 821 777 404 242 901 119 122 30 670 575 832 61 767 100 992 30 468 18 050 S4 132 765 257 670 103 303 141 951 1 238 276 224 380 62 853 44 106 301 046 83 461 71 695 44 744 20 706 S5 157 322 637 686 329 103 246 244 2 692 366 104 626 38 957 160 298 388 434 26 155 48 717 51 172 31 622 S6 103 657 314 697 280 628 126 692 1 455 124 136 448 26 451 62 555 257 020 62 337 118 003 40 669 50 208 S7 179 115 236 471 63 306 199 872 2 072 554 359 835 34 848 46 956 528 090 175 035 68 680 47 935 29 787 S8 63 778 54 434 42 390 116 609 3 147 080 360 264 21 110 69 754 887 007 225 306 569 391 52 647 76 263 S9 13 271 34 189 7 045 589 76 254 2 157 638 0 10 494 177 987 68 890 0 5 093 70 928 47 539 S10 22 859 183 940 229 118 133 695 1 474 237 233 605 42 491 46 552 500 144 203 219 328 474 71 014 80 980 S11 15 262 17 762 51 883 24 039 7 042 65 480 22 773 542 2 545 1 806 27 260 51 805 1 539 S12 162 380 181 434 146 170 135 286 1 147 693 157 931 18 579 35 669 429 545 73 152 46 112 68 354 66 323

表 3 共有峰峰面积 Table 3 Peakareas of common peaks

表 4(Table 4)

表 4 12批红芪水提部位指纹图谱相似度 Table 4 Fingerprint similarity of aqueousextract from 12 batches of Hedysari Radix 样品 相似度 样品 相似度 样品 相似度 S1 0.96 S5 0.88 S9 0.80 S2 0.80 S6 0.82 S10 0.93 S3 0.89 S7 0.97 S11 0.94 S4 0.96 S8 0.97 S12 0.91

表 4 12批红芪水提部位指纹图谱相似度 Table 4 Fingerprint similarity of aqueousextract from 12 batches of Hedysari Radix

表 5(Table 5)

表 5 各共有峰相对保留时间 Table 5 Relative retention time of each common peaks 样品 相对保留时间 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 S1 0.66 0.77 0.90 1.00 1.51 2.22 2.91 3.02 3.36 3.82 4.44 4.59 4.70 S2 0.67 0.77 0.89 1.00 1.50 2.20 2.87 3.02 3.41 3.83 4.43 4.59 4.70 S3 0.67 0.77 0.89 1.00 1.51 2.21 2.89 3.04 3.43 3.87 4.48 4.63 4.75 S4 0.67 0.77 0.89 1.00 1.51 2.21 2.88 3.04 3.42 3.86 4.47 4.62 4.74 S5 0.66 0.77 0.88 1.00 1.49 2.19 2.84 2.99 3.39 3.80 4.40 4.54 4.66 S6 0.67 0.77 0.89 1.00 1.51 2.31 2.89 3.04 3.43 3.86 4.48 4.63 4.75 S7 0.67 0.78 0.89 1.00 1.52 2.24 2.90 3.05 3.39 3.86 4.48 4.63 4.75 S8 0.67 0.78 0.89 1.00 1.51 2.22 2.90 3.06 3.46 3.88 4.50 4.65 4.77 S9 0.67 0.77 0.89 1.00 1.51 2.21 2.83 2.94 3.34 3.45 4.48 4.63 4.74 S10 0.66 0.77 0.87 1.00 1.46 2.13 2.84 3.12 3.37 3.79 4.4 4.56 4.66 S11 0.67 0.75 0.89 1.00 1.50 2.20 2.80 3.03 3.37 3.80 4.46 4.63 4.72 S12 0.67 0.77 0.88 1.00 1.50 2.20 2.88 3.03 3.42 3.85 4.46 4.61 4.73 平均值 0.67 0.77 0.89 1.00 1.50 2.21 2.87 3.03 3.40 3.80 4.46 4.61 4.72 RSD/% 0.78 1.08 0.71 0 1.00 1.73 1.16 1.37 1.06 3.07 0.75 0.73 0.74 样品 相对保留时间 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 S1 4.79 4.83 5.58 6.15 7.02 7.63 8.12 8.21 9.29 9.76 10.12 11.66 12.26 S2 4.80 4.85 5.59 6.16 7.05 7.66 8.09 8.23 9.32 9.80 10.15 11.70 12.30 S3 4.85 4.90 5.65 6.23 7.12 7.74 8.17 8.32 9.42 9.90 10.26 11.75 12.43 S4 4.84 4.89 5.64 6.21 7.10 7.71 8.15 8.29 9.39 9.87 10.23 11.79 12.40 S5 4.75 4.81 5.54 6.10 6.98 7.58 8.01 8.15 9.23 9.70 10.05 11.58 12.18 S6 4.84 4.90 5.65 6.22 7.11 7.73 8.17 8.31 9.41 9.89 10.25 11.81 12.42 S7 4.85 4.89 5.65 6.22 7.11 7.72 8.23 8.31 9.40 9.88 10.24 11.80 12.41 S8 4.87 4.91 5.67 6.24 7.14 7.76 8.29 8.35 9.45 9.93 10.29 11.86 12.47 S9 4.83 4.89 5.55 6.17 7.11 0 8.17 8.31 9.41 0 10.25 11.81 12.42 S10 4.76 4.85 5.59 6.17 7.06 7.68 8.11 8.25 9.34 9.82 10.18 11.72 12.33 S11 4.82 4.86 5.55 6.05 7.04 7.68 8.18 8.26 9.35 9.82 10.06 11.74 12.32 S12 4.83 4.87 5.62 6.19 7.08 7.69 8.13 8.27 9.37 9.85 10.20 11.76 12.36 平均值 4.82 4.87 5.61 6.17 7.08 7.05 8.15 8.27 9.36 9.02 10.19 11.75 12.36 RSD/% 0.74 0.62 0.81 0.92 0.68 2.51 0.85 0.66 0.67 0.69 0.78 0.66 0.69

表 5 各共有峰相对保留时间 Table 5 Relative retention time of each common peaks

2.3 谱效相关研究

以指纹图谱中代表化学成分各峰的峰面积为自变量（X），以表 2中耳片质量差值的均数作为因变量（Y），采用PLD法，进行谱效相关性分析。结果得到X关于Y的回归方程：Y＝0.0781 X₁＋0.027 7 X₂－0.102 5 X₃－0.060 0 X₄＋0.071 1 X₅＋0.100 5 X₆－0.033 3 X₇＋0.046 5 X₈－0.025 8 X₉－0.020 7 X₁₀－0.019 8 X₁₁－0.038 2 X₁₂＋0.074 2 X₁₃＋0.060 1 X₁₄－0.030 8 X₁₅－0.002 7 X₁₆－0.056 5 X₁₇－0.116 1 X₁₈－0.097 9 X₁₉＋0.073 3 X₂₀－0.049 3 X₂₁－0.099 6 X₂₂－0.165 0 X₂₃－0.138 7 X₂₄－0.176 5 X₂₅－0.231 9 X₂₆。在此回归模型中，26个自变量X对Y的回归系数有正也有负，即存在正相关和负相关性。其中1、2、5、6、8、13、14、20号峰所对应的化合物对红芪水提部位提高免疫功能有贡献，而4、18、21、22、24号峰所分别对应的腺苷、芒柄花苷、金雀异黄酮、芒柄花素、美迪紫檀素均表现为负相关，其他自变量对应的化合物结构有待确定。

比较红芪各提取部位提高正常小鼠机体免疫功能作用，发现水提部位组提高免疫功能的能力最强，这也与文献报道相一致^[10]。进而对12批不同产地或不同生长年限的红芪水提部位进行药效学考察和HPLC分析，对提取方法、流动相及洗脱梯度、检测波长等色谱条件进行了优化，构建了红芪药材水提部位HPLC指纹图谱，并指认了腺苷、芒柄花苷、金雀异黄酮、芒柄花素、美迪紫檀素指纹峰的位置。不同来源红芪水提部位提高免疫功能的能力不尽相同，其中只有甘肃武都1批、武都米仓山和陇西县首阳镇药材与对照组比较具显著性差异。中药药效的不稳定性与其有效成分，乃至有效部位的量是息息相关的，这也更加说明了谱效关联作为寻找评价中药药效有效成分或部位的有效手段是很有必要的。

采用PLS法对红芪水提部位化学组成与提高免疫功能作用进行相关分析，结果表明HPLC图中1、2、5、6、8、13、14、20号峰所对应的化学成分为对提高免疫功能药效有贡献的药效成分组，应通过进一步的实验对这些成分进行确认。而常用于表征红芪质量的腺苷、芒柄花苷、金雀异黄酮、芒柄花素、美迪紫檀素等指标化合物均表现为负相关，即这些指标化合物的量越高提高免疫功能药效可能越低，这也对应用于提高免疫功能药效时，以上述成分控制红芪药材的质量提出了质疑和参考。PLS法分析既可以得到红芪水提部位对提高免疫功能起主要作用的色谱峰，又可以获得各色谱峰之间相互作用的信息，为研究药物组分间相互关系提供可能，同时为中药药效物质快速筛选，合理选择质量控制指标及谱效关系研究提供了参考。