自体神经移植修复周围神经缺损面临神经来源缺乏、供区永久性失神经等问题，不能满足周围神经长段缺损修复需要。同种异体神经与自体神经组织结构相同，来源广泛，可修复长段神经缺损，是自体神经的理想替代品，但新鲜异体神经不能满足神经缺损及时修复的需要。虽然超低温、化学萃取等方法处理的周围神经修复神经缺损取得一定进展^{[ 1,2,3,4 ]}，但对长段神经缺损的修复仍未取得突破，可能是因为这些方法破坏或清除了周围神经施万细胞（Schwann cells，SCs），而SCs能释放多种神经营养因子、黏附因子，对周围神经损伤后轴突再生极为重要。本研究应用活血化瘀中药川芎中的有效成分川芎嗪溶液冷保存（4 ℃）大鼠坐骨神经，希望能维持神经组织SCs活性，提高周围神经缺损修复效果，探索中药提取物体外保存周围神经的可能性。 1 材料

3月龄SPF级雄性Wistar大鼠及SD大鼠各40只，分别为供体和受体，由重庆医科大学实验动物中心提供，体质量（200±20）g。动物许可证号SCXK（渝）2012-0001。

盐酸川芎嗪注射液（批号H20003792，40 mg/支，北京市燕京药业有限公司），I型胶原酶（Sigma公司，美国），0.25%胰酶、FBS、低糖型DMEM（Hyclone公司，美国），Calcein-AM（东仁公司，日本），TCS-SP2型激光扫描共聚焦显微镜（Leica公司，德国），H-7500型透射电镜（Hitachi公司，日本），BL-420F型生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司）。 2 方法 2.1 神经保存液的制备

盐酸川芎嗪注射液加入DMEM（含10% FBS），制成不同质量浓度（0、50、100、200 mg/L）川芎嗪溶液，微孔滤膜（0.22 μm）抽滤，即用即配。 2.2 Calcein-AM荧光染色液制备

100 μg Calcein-AM加入100 μL无水二甲基亚砜（DMSO）中，反复吹打，涡旋振荡3 min，6 000 r/min离心2 min，再次涡旋3 min，6 000 r/min离心2 min。用前PBS配成4 μmol/L的工作液。 2.3 坐骨神经冷保存

无菌条件下，于梨状肌下缘5 mm处截取供体大鼠双侧坐骨神经各15 mm，生理盐水冲洗，立即置于盛有川芎嗪溶液的冻存管中，4 ℃冰箱保存6周。 2.4 动物模型分组

供体神经随机分为A、B、C、D组（n＝20），分别4 ℃保存于0、50、100、200 mg/L川芎嗪溶液中6周；受体动物随机分为A′、B′、C′、D′组（n＝10），对应供体A、B、C、D组。 2.5 神经移植模型制备

10%水合氯醛（0.4 mL/100 g）大鼠腹腔麻醉，以右后肢建立神经移植模型。右股后外侧纵行切口，暴露坐骨神经，距梨状肌下缘5 mm处整齐切除坐骨神经，造成10 mm神经缺损，将供体神经修成长10 mm，10倍手术显微镜下修复供体神经缺损，9～0尼龙线行神经外膜无张力间断缝合4～6针，逐层关闭切口。手术由同一人完成，术后动物未做特殊处理。 2.6 指标检测 2.6.1 冷保存神经超微结构观察

供体神经4 ℃保存6周，每组随机取2条，2.5%戊二醛4 ℃固定过夜，1%锇酸固定2 h，梯度丙酮脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸铀-柠檬酸铅双重染色，透射电镜（×5 000）观察神经超微结构。 2.6.2 冷保存神经SCs活性检测

供体神经4 ℃保存6周，每组随机取3条，0.25%胰酶-2 mg/mL胶原酶（1∶1）混合液室温消化20 min，DMEM（含10% FBS）终止消化10 min，PBS冲洗3次（每次5 min），加4 μmol/L的Calcein-AM 250 μL，室温下避光孵育15 min，再次PBS冲洗3次，防荧光淬灭剂封片。激光扫描共聚焦显微镜（×400）观察荧光强度。 2.6.3 神经移植后一般情况观察

观察移植后大鼠存活、伤口愈合及溃疡发生情况，取材检测时观察远近端吻合口有无神经纤维瘤形成、移植段神经与周围组织粘连情况等。 2.6.4 坐骨神经功能指数（sciatic functional index，SFI）测定

分别于移植后4、8、16、20周，各组随机抽取5只大鼠行足底印迹实验：自制足印行走箱（长30 cm，宽5 cm），箱底铺白纸。大鼠双后足蘸墨水后即置于行走箱的一端，自行走向行走箱的另一端留下足印。观察双后肢：①足印长度（PL），从足跟到足尖最长距离；②足趾宽度（TS），第1趾到第5趾连线距离；③中间足趾距离（IT），第2趾到第4趾连线距离。测量结果均取最大值，根据Bain公式：SFI＝−38.3 (PL_E－PL_N)/PL_N＋109.5 (TS_E－TS_N)/TS_N＋13.3 (IT_E－IT_N)/IT_N－8.8（其中N代表正常足，E代表实验足）计算SFI。以SFI＝0为正常值，SFI＝−100为神经完全断离指标。 2.6.5 神经电生理检测

移植后20周，受体组大鼠10%水合氯醛ip麻醉，沿原手术切口显露坐骨神经。刺激电极置于近端距离梨状肌下缘约3 mm神经干上，接收电极置于外踝关节上10 mm处腓肠肌上，地线刺入两电极之间股二头肌，刺激强度10 mA，刺激间隙0.25 ms。用BL-420F系统测定肌肉复合动作电位波幅、潜伏期、神经传导速度（never conduction velocity，NCV，距离/传递时间）。刺激电极不变，钝性分离大鼠腓肠肌至起点，从远端止点处切断肌腱，用4号尼龙线将其与张力感应器连接，BL-420F系统观察腓肠肌强直收缩张力。 2.6.6 再生神经图像分析

电生理检测后，每组随机选8只大鼠，截取移植神经中段约5 mm，2.5%戊二醛4 ℃固定过夜，1%锇酸固定2 h，梯度丙酮脱水，环氧树脂包埋，0.5 μm切片，甲苯胺蓝染色，光镜（×400）观察，每张切片随机取5个视野，Image-Pro Plus 6.0图像系统分析再生有髓神经纤维数目和髓鞘厚度。 2.6.7 再生神经透射电镜观察

神经电生理检测后，每组随机选2条移植神经截取中段约5 mm，观察再生神经超微结构，方法同“2.6.1”项。 2.7 统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件包进行分析。数据以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验。 3 结果 3.1 冷保存神经超微结构

供体神经4 ℃冷保存6周，各组均有不同程度神经纤维脱髓鞘变化：A组（对照组）脱髓鞘程度最严重，可见髓鞘分层，轴索萎缩变性及蜂窝状改变；B组脱髓鞘变化、轴索萎缩及蜂窝状改变程度明显轻于A组；C、D组脱髓鞘变化、轴索萎缩变性及蜂窝状改变轻于A组，但重于B组。结果见图 1。

白色箭头示轴索蜂窝状改变，黑色箭头示脱髓鞘变化 White arrow indicating change of axis cylinder,black arrow indicating demyelination 图 1 各组冷保存6周坐骨神经超微结构 Fig. 1 Ultramicro-structure of sciatic nerve preserved coldly for 6 weeks in each group

供体神经冷保存6周，Calcein-AM染色激光扫描共聚焦显微镜观察，每平方微米荧光强度：A组为108.23±6.00，B组为142.56±13.04，C组为125.18±11.61，D组为123.28±7.20。B、C、D组荧光强度高于A组，B组高于C、D组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；C、D组间荧光强度差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见图 2。

图 2 各组冷保存6周坐骨神经Calcein-AM染色Fig. 2 Calcein-AM staining of sciatic nerve preserved coldly for 6 weeks by in each group

实验期间大鼠无死亡，切口无化脓感染、足底溃疡、足趾脱落现象。移植术后1周，伤口均一期愈合，进食、饮水正常，行走时右后肢呈拖步步态；术后约8周，B′、C′、D′组可见大鼠右后肢触地行走；移植后20周取材时，A′、B′、C′、D′组移植物与周围组织均有轻微粘连、与受体神经干粗细一致，各组神经移植远近端吻合口未见神经纤维瘤。 3.4 SFI测定结果

移植后4、8、16、20周各组大鼠SFI值，B′、C′、D′组与A′组比较，B′组与C′、D′组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），但C′、D′组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 移植后不同时间各组受体大鼠SFI比较 (x±s,n=5) Table 1 Comparison on SFIof rats in each group at different time after transplantation(x±s,n=5) 组别 ρ/( mg∙L−1) SFI 4周 8周 16周 20周 A′（对照） — −92.85±3.46 −86.38±2.50 −81.24±2.29 −79.96±2.77 B′ 50 −80.06±4.53△ −70.12±3.94△ −60.87±1.51△ −56.32±2.13△ C′ 100 −86.95±3.01△# −77.79±2.52△# −69.78±3.06△# −66.57±3.05△# D′ 200 −87.07±3.46△# −78.78±1.33△# −71.07±1.70△# −68.03±1.36△# 与A′组比较：△P＜0.05，与B′组比较：#P＜0.05，下同 △P < 0.05 vs group A′,#P < 0.05 vs group B′,same as below

表 1 移植后不同时间各组受体大鼠SFI比较 (x±s,n=5) Table 1 Comparison on SFIof rats in each group at different time after transplantation(x±s,n=5)

移植后20周，动作电位振幅、潜伏期、NCV和强直张力，B′、C′、D′组与A′组比较，B′组与C′、D′组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），C′、D′组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 移植后20周各组受体大鼠神经电生理检测结果(x±s,n=10) Table 2 Electrophysiologicaltestingon nerve of rats in each group in 20 weeks after transplantation(x±s,n=10) 组别 ρ/( mg∙L−1) 振幅峰峰值/mV 潜伏期/ms NCV/(m∙s−1) 强直张力/g A′（对照） — 34.25±6.37 5.45±0.77 7.42±0.50 6.31±0.56 B′ 50 53.62±3.61△ 3.56±0.67△ 12.56±1.27△ 14.93±1.05△ C′ 100 44.01±3.76△# 4.27±0.40△# 10.44±1.02△# 9.97±0.94△# D′ 200 41.82±3.56△# 4.45±0.51△# 9.97±0.86△# 9.73±0.93△#

表 2 移植后20周各组受体大鼠神经电生理检测结果(x±s,n=10) Table 2 Electrophysiologicaltestingon nerve of rats in each group in 20 weeks after transplantation(x±s,n=10)

移植后20周，移植段神经甲苯胺蓝染色，各组再生神经有髓神经数目和髓鞘厚度分别为A′组：（184±38）个、（1.135±0.145）μm，B′组：（566±87）个、（1.658±0.130）μm，C′组：（423±42）个、（1.479±0.066）μm，D′组：（399±31）个、（1.462±0.067）μm；B′、C′、D′组与A′组比较，B′组与C′、D′组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），C′、D′组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见图 3。

图 3 移植后20周各组大鼠神经移植甲苯胺蓝染色结果Fig. 3 Nerve graft of rats in each group by toluidine blue staining in 20 weeks after transplantation

移植后20周，A′组再生有髓神经纤维分布稀疏、髓鞘薄，并有明显结缔组织增生；B′、C′、D′组再生有髓神经纤维分布密集，纤维粗、髓鞘厚，轴浆内微丝、微管和线粒体等细胞器丰富，结缔组织增生不明显，其中B′组优于C′、D′组。见图 4。

图 4 移植后20周各组大鼠神经移植超微结构Fig. 4 Ultramicro-structure of nerve graft of rats in each group in 20 weeks after transplantatio

周围神经损伤后轴突再生、髓鞘形成、神经营养因子和黏附分子的分泌，SCs发挥着重要作用，超低温保存、化学去细胞神经等在修复周围神经长段缺损方面未取得突破，原因可能是这些桥接物中缺少了SCs的促神经生长作用，而在去细胞异体神经移植物内种植SCs则能促进神经再生^{[ 5,6,7 ]}。

川芎嗪是川芎的主要成分，具有保护血管内皮细胞、抗脂质过氧化、清除氧自由基和抑制伤害性信息传递作用^{[ 8,9,10 ]}。在肝脏、肾脏等低温保存时加入川芎嗪，能减轻组织器官再灌注损伤^{[ 11,12 ]}；Chang等^{[ 13 ]}还认为川芎嗪可以通过上调Caspase-3活性来抑制凋亡的形成。本实验中，DMEM添加川芎嗪冷保存大鼠坐骨神经6周，Calcein-AM荧光染色激光扫描共聚焦显微镜检测显示，川芎嗪保存组（B、C、D组）荧光强度高于对照组（A组），透射电镜也显示B、C、D组脱髓鞘等病理变化轻于A组。Calcein-AM是一种活细胞染色剂，有良好的细胞膜穿透性，当Calcein-AM进入胞质，酯酶水解使Calcein留在细胞内，受激发后Calcein发出强绿色荧光，因此细胞内Calcein荧光强度直接反映细胞活性^{[ 14,15 ]}。本实验中，DMEM溶液加入川芎嗪，能提高冷保存坐骨神经SCs活性，有利于异体移植后神经再生。

SCs是周围神经的的主要结构和功能细胞，对周围神经损伤后轴突再生、髓鞘形成起着重要作用^{[ 16,17,18 ]}。本实验供体神经冷保存6周异体移植，术后不同时间受体SFI、电生理检测及再生神经图像分析结果，B′、C′、D′组均优于A′组，且B′组优于C′、D′组（P＜0.05）；再生神经超微结构B′、C′、D′组也优于A′组。说明大鼠坐骨神经冷保存加入一定质量浓度川芎嗪，能提高异体移植后神经再生效果。可能是通过川芎嗪提高了冷保存神经组织SCs的活性，使得在异体移植后SCs发挥促神经再生的作用。

综上所述，坐骨神经冷保存预处理时加入一定质量浓度的川芎嗪，能提高保存后神经组织SCs活性，促进异体移植后受体神经再生。至于维持周围神经SCs活性的冷保存时限，冷保存预处理溶液添加物（尤其是中药提取物）及其浓度，冷保存预处理后周围神经免疫原性等问题还需进一步研究。