六味地黄方是中医“滋阴补肾”的经典名方，由熟地黄、山药、山茱萸、泽泻、茯苓、牡丹皮6味中药组成，除了丸剂，还有胶囊等剂型^[1]。中医用于治疗因肾阴不足、虚火上炎所致的头晕、耳鸣、腰膝酸软、盗汗、遗精、手足心热等证。现代研究该方有改善肾功能、保肝、抗衰老、抗疲劳、抗低温、耐缺氧、调血脂、降血压、降血糖、增强免疫、促进新陈代谢等作用^[2]。

经研究证明方中6味药均含有多糖，均具有增强免疫、抗肿瘤、抗衰老等作用^{[3, 4]}。天然药物中提取的多糖通常是以中性糖和酸性杂多糖的形式存在，而酸性杂多糖（下文简称酸性糖）中主要是以糖醛酸^{[5, 6]}为主，糖醛酸自身或含有糖醛酸结构单元的低聚糖或多糖常显示出一些重要的生物活性^[7]，而中性糖则具有一定的抗氧化作用^[8]。此外，二者在定量方法上也存在差异^{[5, 6, 9]}。牡丹皮中的芍药苷具有扩张血管、镇静镇痛、抗炎抗溃疡、解热解痉、利尿的作用。山茱萸中含有马钱苷、莫诺苷，马钱 苷具有对非特异性免疫功能增强作用，能促进巨噬细胞吞噬功能，延缓衰老，有良好的防癌防辐射功效，并有良好的抗炎、抗菌、镇咳、祛痰等作用；莫诺苷具有保护细胞免于H₂O₂诱导的细胞毒性和细胞凋亡的作用；熟地黄中的甘露三糖具有促进造血细胞增殖、提高免疫力、降血糖、抗肿瘤等作用。

醇沉是中药制剂中常用的精制工艺，使不溶于乙醇的物质如糖类、蛋白质等沉降下来，达到精制浓缩液的目的。六味地黄方中的成分复杂，经过醇沉后，可提高有效成分的量，发挥其有效成分的治疗作用。课题组前期实验对六味地黄方醇沉工艺进行中试及放大生产研究，多项检测指标均发生了改变，无法达到预期质量要求，分析原因可能由于生产设备、操作及环境的变化造成的。为适应大生产需要，本实验通过考察生产工艺参数对六味地黄方有效成分质量的影响，优化醇沉生产工艺，开展产业化推广。

U3000型高效液相色谱仪，美国Cohesive Technologies公司，Waters Symmerty C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯；纯化水（自制）。甘露三糖对照品（product of Sigma Aldrich，批号1450717，质量分数＞95%），莫诺苷对照品（北京格润得科技发展公司，质量分数为98.8%），马钱苷对照品（11640-200503，质量分数为99.2%）、芍药苷对照品（110736-200934，质量分数为96.4%），均购于中国食品药品检定研究院。

药材饮片均经康缘大药房吴舟药师鉴定，熟地黄（批号Y130301，产地河南）为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch的干燥块根经加工蒸晒而成，山茱萸（批号Y130301，产地河南）为山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb. et Zucc. 的干燥成熟果肉，山药（批号Y130301，产地安徽）为薯蓣科植物薯蓣Dioscorea opposita Thunb. 的干燥根，泽泻（批号Y1301089，产地福建）为泽泻科植物泽泻Alisma orientale (Sam.) Juzep. 的干燥块茎，均购于精华制药亳州康普有限公司；牡丹皮（批号Y130306，产地安徽）为毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr. 的干燥根皮，购于亳州弘惠药业；茯苓（批号Y1303064，产地湖北）为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos (Schw.) Wolf的干燥菌核，购于湖北英山县百草堂实业有限公司。

采用U3000型高效液相色谱仪，Waters Symmerty C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；流动相为水-甲醇-乙腈，梯度洗脱：0～10 min，74%水、21%甲醇、5%乙腈；10～30 min，74%～69%水、21%～26%甲醇、5%乙腈；检测波长为236 nm，体积流量为1.0 mL/min，理论板数按莫诺苷、马钱苷、芍药苷峰计算均应不低于3 000。

分别精密称取芍药苷、马钱苷、莫诺苷对照品适量，用甲醇制成含芍药苷51.25 μg/mL、马钱苷47.90 μg/mL、莫诺苷57.70 μg/mL的混合对照品溶液，0.45 μm微孔滤膜滤过，滤液备用。

取本品中间体，研细，取0.50 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理1 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取上清液5 mL，加甲醇稀释至20 mL，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

分别精密吸取“2.1.2”项下混合对照品溶液1、2、4、8、10、20 mL定容至25 mL量瓶中，用甲醇定容，混匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，精密吸取续滤液10 μL注入液相色谱仪记录峰面积，以质量浓度（X）对峰面积积分值（Y）进行线性回归，得回归方程分别为芍药苷Y＝0.236 X＋0.601，r＝0.999 5；马钱苷Y＝3.954 X－2.371，r＝0.999 5；莫诺苷Y＝0.241 X＋1.049，r＝0.999 5；线性范围分别为2.05～41.00、1.02～10.22、2.31～46.16 μg/mL。

精密吸取同一供试品溶液10 μL，连续进样6次，测定芍药苷、马钱苷、莫诺苷峰面积积分值的RSD分别为1.36%、1.45%、1.20%，表明精密度良好。

取同一中间体约0.50 g，按“2.1.3”项下方法制备成供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h进样测定，测定芍药苷、马钱苷、莫诺苷峰面积积分值的RSD分别为1.54%、1.69%、1.23%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

取同一中间体约0.50 g，精密称定6份，按“2.1.3”项下方法制备成供试品溶液进样测定，按照3种指标成分的质量分数计算，RSD分别为芍药苷1.87%、马钱苷1.45%、莫诺苷1.61%，表明测定方法重复性良好。

取已知质量分数的中间体约0.20 g，精密称定6份，分别精密加入芍药苷、马钱苷、莫诺苷对照品适量，按“2.1.3”项下方法制备成供试品溶液，精密吸取续滤液10 μL注入液相色谱仪，按峰面积外标法计算，平均回收率分别为97.78%、97.67%、97.89%，RSD分别为1.02%、1.31%、0.86%。

采用Aglient 1100高效液相色谱仪，Kromasil NH₂（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，以乙腈-水（60∶40）为流动相；HP1047A示差折光检测器；体积流量为1.0 mL/min，柱温箱与检测器温度均为35 ℃；理论板数按甘露三糖峰计算应不低于1 500。

称取甘露三糖对照品适量，精密称定，用流动相乙腈-水（60∶40）制成含甘露三糖1.856 mg/mL的溶液，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液备用。

称取本品中间体约0.20 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入流动相乙腈-水（60∶40）25 mL，密塞，称定定量，超声（功率100 W，频率30 kHz）处理30 min，放冷，再称定质量，用乙腈-水（60∶40）补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取上清液5 mL，加乙腈-水（60∶40）稀释至20 mL，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

精密吸取对照品溶液0.25、0.5、1.0、1.25、2.5、3.75、5.0 mL定容至5 mL量瓶中，用乙腈-水（60∶40）定容，混匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，精密吸取续滤液10 μL注入液相色谱仪记录峰面积，以甘露三糖质量浓度（X）对峰面积积分值（Y）进行线性回归，得到回归方程为Y＝1 343 X－111.5，r& lt; span style='font-family:宋体'>＝0.999 5，结果表明甘露三糖在0.37～1.86 mg/mL与峰面积呈良好线性关系。

精密吸取同一供试品溶液10 μL，连续进样6次，峰面积的RSD为1.75%，表明精密度良好。

取同一中间体约0.20 g，精密称定，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h进样，峰面积的RSD为1.65%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

= 取同一中间体约0.20 g，精密称定6份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，分别进样测定，甘露三糖质量分数的RSD为1.84%，表明测定方法重复性良好。

取已知质量分数的中间体约0.10 g，精密称定6份，精密加入甘露三糖对照品适量，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，精密吸取续滤液10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，按峰面积外标法计算，甘露三糖的平均回收率为96.94%，RSD为1.52%。

取熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、牡丹皮、茯苓，加10倍量沸水煎煮2次，每次2 h，合并提取液并浓缩成清膏A。清膏A调乙醇体积分数至30%后醇沉，吸出上清液，上清液浓缩成稠膏B，沉淀弃去。稠膏B调乙醇体积分数至60%后醇沉，吸出上清液，浓缩后备用；沉淀加水溶解，减压浓缩至稠膏并真空干燥，得多糖部位。

取5份等量清膏A，按以下进行操作：① 清膏A用乙醇调至含乙醇量为30%（按体积折算含乙醇量），过夜离心，上清液备用；沉淀用30%乙醇冲洗并直接离心，沉淀弃去，上清液备用；合并2次上清液浓缩到相对密度为1.09～1.10（设为A1）；② 清膏A用乙醇调至含乙醇量为30%（按体积折算含乙醇量），放置过夜不离心，真空吸取上清液备用，其他同 ① 操作（设为A2）；③ 清膏A用乙醇调至含乙醇量为30%（用酒精计测定乙醇量），其他同 ① 操作（设为A3）；④ 清膏A用乙醇调至含乙醇量为30%（按体积折算含乙醇量），过夜离心，沉淀不进行30%乙醇冲洗直接弃去，将上清液浓缩到相对密度为1.09～1.10（设为A4）；⑤ 浸膏A用乙醇调至含乙醇量为30%（按体积折算含乙醇量），直接离心，其他同 ④ 操作（设为A5）。

由表 1结果可知，A1的莫诺苷、马钱苷、芍药苷、甘露三糖、多糖总糖（采用硫酸-苯酚法测定^[9]）的量均高于A3，初步推测按体积折算确定加乙醇量较合理；A5的莫诺苷、马钱苷、芍药苷、甘露三糖、多糖总糖的量均高于A4，推测直接离心优于过夜离心；A1的莫诺苷、马钱苷、芍药苷、甘露三糖、多糖总糖的量均高于A4，推测加入乙醇洗涤可有效提高有效成分的量；A1的莫诺苷、马钱苷、芍药苷、甘露三糖、多糖总糖的量均高于A2，推测离心操作可有效提高有效成分的量。

表 1(Table 1)

表 1 30%醇沉工艺考察 (n = 3) Table 1 Investigation of 30% alcohol precipitation (n = 3) 样品 莫诺苷/ (mg∙g−1) 马钱苷/ (mg∙g−1) 芍药苷/ (mg∙g−1) 甘露三糖/ (mg∙g−1) 多糖总糖/ (mg∙mL−1) A1 2.83 1.30 1.01 37.58 0.20 A2 2.45 1.12 0.87 30.29 0.13 A3 2.68 1.23 0.94 35.90 0.16 A4 1.87 0.86 0.65 23.97 0.10 A5 2.62 1.20 0.90 33.44 0.14

表 1 30%醇沉工艺考察 (n = 3) Table 1 Investigation of 30% alcohol precipitation (n = 3)

取5份等量稠膏B，按以下进行操作：① 稠膏B用95%乙醇调至含乙醇量为60%（按体积折算含乙醇量），过夜离心，上清液备用；沉淀用60%乙醇冲洗并直接离心，上清液备用，沉淀加水溶解并浓缩到相对密度为1.20～1.21（设为B1），合并2次上清液并浓缩到相对密度为1.12～1.13（设为b1）；② 稠膏B用95%乙醇调至含乙醇量为60%（按体积折算含乙醇量），醇沉后放置过夜不离心，真空吸取上清液，其他同 ① 操作（设为B2、b2）；③稠膏B用95%乙醇调至含乙醇量为60%（用酒精计测定含乙醇量），其他同 ① 操作（设为B3、b3）；④ 稠膏B用95%乙醇调至含乙醇量为60%（按体积折算含乙醇量），过夜离心，上清液浓缩到相对密度为1.12～1.13（设为b4），沉淀不进行60%乙醇冲洗直接加水溶解并浓缩到相对密度为1.20～1.21（设为B4）；⑤ 稠膏B用95%乙醇调至含乙醇量为60%（按体积折算含乙醇量）后直接离心，其他同 ④ 操作（设为&l t;/ span>B5、b5）。

60%醇沉上清浓缩液主要成分是苷类和甘露三糖，其质量分数是评价多糖生产工艺的指标，结果见表 2。b1的莫诺苷、马钱苷、芍药苷、甘露三糖质量分数均高于b3，故初步推测按体积折算加乙醇量较合理；b5的莫诺苷、马钱苷、芍药苷、甘露三糖的量均高于b4，故推测直接离心优于过夜离心；b1的莫诺苷、马钱苷、芍药苷、甘露三糖的量均高于b4，故加入乙醇洗涤有利于多糖的纯化。b1的莫诺苷、马钱苷、芍药苷、甘露三糖的量均高于b2，推测离心操作可有效提高有效成分的量。

表 2(Table 2)

表 2 60%醇沉工艺中苷类和甘露三糖量的考察 (n = 3) Table 2 Investigation of glycosides and manninotriose contents in 60% alcohol precipitation (n = 3) 样品 莫诺苷/ (mg∙g−1) 马钱苷/ (mg∙g−1) 芍药苷/ (mg∙g−1) 甘露三糖/ (mg∙g−1) b1 5.94 3.30 3.02 94.39 b2 5.08 2.38 2.10 89.86 b3 5.24 2.75 2.16 78.13 b4 5.01 2.36 2.06 83.72 b5 5.52 2.62 2.24 93.95

表 2 60%醇沉工艺中苷类和甘露三糖量的考察 (n = 3) Table 2 Investigation of glycosides and manninotriose contents in 60% alcohol precipitation (n = 3)

由于酸性糖和中性糖在定量测定中相互干扰，所以本研究采用硫酸-苯酚法测定中性糖的量^[9]，采用间羟基联苯法测定酸性糖的量^{[5, 6]}，由表 3可知，B1的中性糖、酸性糖、多糖总糖质量分数均高于B3，推测按体积折算加乙醇量较合理；B4的中性糖、酸性糖、多糖总糖量均高于B5，推测放置时间越长对多糖的质量分数越有利，故过夜离心优于直接离心；B1的中性糖、酸性糖、多糖总糖的量均高于B4，加入乙醇洗涤可提高多糖有效成分的量。B1的中性糖、酸性糖、多糖总糖的量均高于B2，推测离心操作可有效提高有效成分的量。

表 3(Table 3)

表 3 60%醇沉工艺中多糖量的考察 (n = 3) Table 3 Investigation of polysaccharide content in 60% alcohol precipitation (n = 3) 样品 中性糖/% 酸性糖/% 多糖总糖/% B1 3.90 1.80 5.70 B2 3.13 1.71 4.84 B3 3.55 1.46 5.01 B4 2.59 1.30 3.89 B5 2.24 0.94 3.18

表 3 60%醇沉工艺中多糖量的考察 (n = 3) Table 3 Investigation of polysaccharide content in 60% alcohol precipitation (n = 3)

清膏A中加入95%乙醇并调至含乙醇量30%，放置过夜，倾出上清液，并将剩余部分离心，合并上清液，沉淀用30%乙醇冲洗3次，倾出上清液，剩余部分离心，合并上清液，沉淀弃去。上清液浓缩成稠膏，用95%乙醇调乙醇体积分数为60%，放置过夜，离心，上清液备用，沉淀加水溶解并浓缩至稠膏状；按上述方法重复2次后，将所得的沉淀浸膏真空干燥，得到多糖部位。

清膏A用95%乙醇调乙醇体积分数至30%，放置过夜，真空吸出上清液备用，沉淀用30%乙醇冲洗，放置过夜，吸出上清液备用，沉淀弃去；合并2次上清液浓缩成稠膏状，用95%乙醇调乙醇体积分数为60%，放置过夜，真空吸出上清液，沉淀用60%乙醇冲洗，放置过夜，吸出上清液备用，合并2次沉淀加水溶解，并浓缩至稠膏后减压干燥，得多糖部位。

由表 4可知，从中性糖、酸性糖和总糖质量分数比较，改进中试工艺后进行生产的多糖质量分数高于按中试工艺进行生产的多糖，说明改进后的中试工艺可有效提高多糖的质量分数；改进中试工艺后生产所得多糖浸出物优于原生产工艺，且符合多糖浸出物的标准。

表 4(Table 4)

表 4 多糖质量分数及浸出物比较 Table 4 Comparison on content and extract of polysaccharide 工艺 中性糖/ % 酸性糖/ % 多糖总 糖/% 浸出物/ % 改进中试工艺放大生产 48.71 18.75 67.46 73.5 中试工艺中试生产 50.36 19.87 70.23 76.9 中试工艺放大生产 45.65 15.01 60.66 66.4

表 4 多糖质量分数及浸出物比较 Table 4 Comparison on content and extract of polysaccharide

由图 1可知，中试工艺、改进中试工艺放大生产工艺、中试工艺放大生产工艺的多糖相对分子质量分布相似，在多糖相对分子质量分布不存在差异^{[12, 13, 14]}。

图 1 多糖相对分子质量分布Fig. 1 Distribution of relative molecular weights of polysaccharide

本实验通过考察生产工艺参数对六味地黄方中有效成分质量的影响，并根据考察结果对醇沉生产工艺进行了一定的改进。改进后的醇沉生产工艺可使六味地黄方中有效成分的质量得到稳定，并能达到了预期生产工艺的要求，适应了大生产的需要，结果见表 5。

表 5(Table 5)

表 5 不同生产工艺对六味地黄方醇沉后有效成分的影响 (n = 3) Table 5 Influence of different production processes on active constituents in Liuwei Dihuang Prescription after alcohol precipitation (n = 3) 工艺 多糖浸出物/% 多糖总糖/% 中性糖/% 酸性糖/% 莫诺苷/% 马钱苷/% 芍药苷/% 甘露三糖/% 质量标准 不得少于70 50～70 30～60 10～25 6.3～13.5 2.4～5.0 2.2～5.0 40.0～60.0 生产放大 61 58 45 13 7.8 3.1 3.0 36 中试生产 75 68 51 20 12.0 4.6 4.4 52 改进后放大生产 73 65 48 19 10.5 4.3 4.2 51

表 5 不同生产工艺对六味地黄方醇沉后有效成分的影响 (n = 3) Table 5 Influence of different production processes on active constituents in Liuwei Dihuang Prescription after alcohol precipitation (n = 3)

综上所述，对于六味地黄方中的醇沉工艺分析，以体积计算加乙醇量的方法优于酒精计实测加乙醇量；在生产工艺中加入乙醇洗涤步骤，可提高有效成分的量，故醇洗是有必要的；由结果可知，直接离心可减少有效成分与沉淀结合时间，使更多的有效成分从沉淀中游离出来，故直接离心较好；多糖是沉淀部分，需较长的时间让其充分沉降，对于多糖的生产工艺，则过夜离心要优于直接离心。

通过对多糖制备工艺的研究可知，制备工艺中的醇沉是关键步骤^{[15, 16]}。对醇沉进行考察过程中发现，乙醇加入方式对醇沉有一定影响^{[17, 18]}，故通过研究得出六味地黄方中多糖的醇沉按体积法计算加乙醇量较合理。由于醇沉分离效果不好，故采用乙醇洗涤法可达成多糖部位与醇沉上清液的分离；改进后生产工艺生产的多糖浸出物优于改进前工艺。通过不断的改进及优化多糖生产工艺，使产业化的工艺方法及参数易操作、可控性好，重复性好，故值得产业化推广应用。