2015, Vol. 46
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.06.024 |
2. 中药制药过程新技术国家重点实验室, 江苏 连云港 222001
, CAO Ze-yu1,2, KE Zhi-peng1,2, CAO Liang1,2, LI Na1,2, DING Gang1,2, WANG Zhen-zhong1,2, XIAO Wei1,2
2. State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process, Lianyungang 222001, China
2014年2月，西非开始爆发大规模埃博拉病毒（Ebola virus，EBOV）疫情，世界卫生组织关于疫情报告表明，截至2014年12月2日，以几内亚、利比里亚、塞拉利昂疫情最为严重、美国、塞内加尔与西班牙也陆续出现确诊病例报告，目前为止累计出现埃博拉确诊、疑似和可能感染病例17 290例，其中6 128人死亡，死亡人数上升趋势正在减缓。本文着重介绍了埃博拉病毒的一般特性、结构组成、生命周期，同时综述了埃博拉出血热（Ebola hemorrhagic fever，EHF）的发病机制、临床表现，最后总结了抗EBOV的靶点与药物的最新研究进展，对中药预防与治疗EHF的前景进行了展望。
1 EHF的研究现状 1.1 EBOV的一般特征EHF是由丝状病毒科丝状病毒属的EBOV引起的一种高致死率和高传染性的急性出血性传染病，1976年从扎伊尔埃博拉河附近村庄的1例患者体内首次分离得到，并由此被命名[1, 2]。EBOV是一种泛嗜性的病毒，可侵犯各系统器官，尤以肝、脾损害为重，主要通过直接接触患者的体液、器官和排泄物，处理发病和死亡的动物，使用污染的医疗用品等途径传播，另外也可通过气溶胶和性接触传播。EHF发病无明显季节性，人群普遍易感，无性别差异，是人类目前已知最为烈性的传染病之一，感染后死亡率高达90%，世界卫生组织已将EBOV列为对人类危害最严重的病毒之一。
根据病毒抗原不同，EBOV主要分为4个亚型：扎伊尔型（EBOV-Z）、苏丹型（EBOV-S）、科特迪瓦型（EBOV-C）及雷斯顿型（EBOV-R）。不同亚型EBOV的毒力不同，其中EBOV-Z毒力最强，EBOV- S次之，两者对人类和非人类灵长类的致死率很高，为50%～88%。EBOV-R和EBOV-C对人的毒力较低，表现为亚临床感染，EBOV-R仅在非人类灵长类中引起发病和死亡，尚未见引起人类致病的报道[3]。4种亚型相互间存在血清学交叉反应，通过定量血清学、胰酶消化多肽图谱分析和寡核苷酸图谱分析等方法可以检测出不同亚型。由于EBOV传染性极强，目前还没有针对EBOV特效的疫苗或者治疗手段，进行相关研究需在生物安全级别为最高的P4级的实验室中进行。
1.2 EBOV感染的临床表现EHF是一种多器官损害的疾病，组织病理学特征是肝、脾、肺、淋巴结和睾丸的急性坏死及弥散性血管内凝血（DIC）、电解质和酸碱的平衡失调，还表现为大动脉内皮细胞产生前列腺素能力的受损和内皮细胞生化完整性的破坏。临床症状主要表现为急性发热（38.3 ℃以上）、肌肉酸痛、头痛、呕吐、面部水肿、皮疹、胃肠道、呼吸道和器官瘀血、出血、肝功能和肾功能损害，器官坏死、分解，最后多因广泛性内出血、脑部受损等原因而死亡[4, 5, 6]。
EHF特征性的感染周期分为几个阶段[7, 8, 9]：潜伏期3～18 d，患者可观察到发热等前期症状；发病第2～3天可出现恶心、呕吐、腹痛，腹泻黏液便或血便，腹泻可持续数天；第4～5天进入极期，发热持续，出现神志意识变化，此期常见出血，可有呕血、黑便、注射部位出血、鼻咯血等，急性期并发症有心肌炎、肺炎等；第6～7天，可在躯干出现麻疹样斑丘疹，并扩散至全身各部，数天后脱屑，以肩部、手心、脚掌多见；重症患者常因出血、肝功能和肾功能衰竭、严重的并发症或休克死于病程第8～9天。在临床症状开始显现初期，病人的肝、脾、淋巴结及肺部有较高的病毒滴度，随着病毒的复制，这些组织逐渐坏死。感染后2 d病毒首先在肺中检出，4 d后在肝、脾等组织中检出，6 d后全身组织均可检出。
1.3 EBOV的致病机制EBOV致病的原因主要由于对人体两方面的危害：一是血管以及肝、脾、肾等脏器，二是免疫系统。
病毒进入机体后，首先感染单核吞噬系统的细胞（mononuc1ear phago-cyticsystem，MPS），受感染的MPS被激活，释放大量的细胞因子和趋化因子，这些细胞活性物质可增加血管内皮细胞的通透性，诱导表达内皮细胞表面黏附和促凝因子；当病毒释放到淋巴或血液中，可以引起肝脾肾等多脏器损伤[10]，两者协同作用下最终导致DIC，使患者迅速死亡[7, 8, 9]。
EHF的另一个显著特点是抑制宿主的免疫反应，患者经常还没有出现有效的免疫反应就已经死亡，在感染晚期可发生脾脏、胸腺和淋巴结等大量淋巴细胞凋亡。单核细胞巨噬细胞和树突状细胞（DCs）在EBOV感染中是最重要的早期靶细胞，在先天免疫和获得性免疫中都有重要作用的DCs，在体外感染EBOV实验研究中发现其并不行使功能，即不能产生前炎性细胞活素或表达协同刺激分子[11, 12, 13]。自然杀伤细胞（NK）也是受EBOV感染影响的先天免疫细胞，这些细胞以独立抗原的方式应答病毒的感染，并通过释放穿孔素和颗粒酶诱导凋亡来杀死被感染的细胞[14]。
2 EBOV的基因结构和蛋白组成 2.1 EBOV的基因结构EBOV是一种不分节段的单股负链RNA病毒，丝状病毒科丝状病毒属，EBOV形态多样，外有脂蛋白组成的包膜，多呈长丝状或杆状，有分支形、U形、6形或环形，分支形的较常见，直径70～90 nm，长度差异较大，长0.5～1 400 nm，感染能力较强的病毒一般长665～805 nm。毒粒表面有刷状样整齐排列的突起，长约7 nm，间隔10 nm，内含直径40 nm的内螺旋衣壳，染色观察内部有交叉条纹[3]。
病毒基因组为非节段，线状，单股负链RNA，全长18.9 kb，相对分子质量为4.2×106[3]，基因组反转录产生的正链能编码巨蛋白（large protein，L）、核蛋白（nucleoprotein，NP）、2个结构蛋白VP30和VP35（virion structural protein）、膜关联蛋白（membrane-associated protein）或基质蛋白（matrix protein）VP24和VP40、糖蛋白（glycoprotein，GP）以及EBOV特有的分泌型小糖蛋白（secretedglycoprtein，sGP）7个蛋白和RNA聚合酶[3]，每种产物由一种单独的mRNA编码，基因外的两末端序列具有保守性和高度互补性，含五聚体3′-UAAUU-5′，多数基因被非保守的基因间隔开[15]。
2.2 EBOV的蛋白与功能本文对EBOV各个蛋白的结构及其在致病感染中的作用进行逐一阐述（图 1）[16]，由于4种与膜相偶联的蛋白（GP、VP40、VP24和NP）在EBOV的毒粒装配、出芽以及致病过程中起到了相当关键的作用，对这4种蛋白的研究有助于EBOV致病机制的阐明和加速EBOV疫苗与治疗药物的研发过程，因此本文将主要介绍这4种蛋白的结构及功能。
 | 图 1 EBOV结构及其蛋白在病毒感染致病过程中的功能Fig. 1 Function of EBOV structure and its protein in pathogenic process with virus infection |
GP是病毒外膜表面的“小钉”，该蛋白在EBOV入侵宿主细胞中具有重要作用[17]。GP蛋白是由GP1和GP2 2个亚单位形成三角裂杯状的同源三聚体，并且高度糖基化。在病毒感染过程中，GP蛋白被furin蛋白酶水解成GP1和GP2[18]，分别发挥受体识别与结合（GP1），以及病毒与细胞膜融合（GP2）的功能[19, 20, 21]。Takada等[22]比较了EBOV-Z和EBOV-R的GP，发现EBOV-R的GP furin识别位点明显少于EBOV-Z，这可能是EBOV-R的毒力比EBOV-Z弱的原因。GP1通过与受体结合黏附在细胞表面[23]，在组织蛋白酶B和L的消化下，打开蛋白衣壳将病毒遗传物质注入宿主细胞[24, 25]。此外，也有研究表明，EBOV进入细胞需要胆固醇转运蛋白质Niemann-Pick C1（NPC1）[26]。
病毒核酸进入宿主细胞后通过RNA编辑或框架漂移方式合成GP蛋白。GP蛋白为I型跨膜蛋白，具有2个阅读框，分别编码1个分泌型的糖蛋白sGP（secretedGP）和1个全长的跨膜GP，sGP作为GP的早期产物被大量分泌出来[27, 28]，可能与干扰免疫细胞对病毒的杀伤作用有关，sGP通过CD16b（中性粒细胞Fc-受体的一种形式）与中性粒细胞结合并抑制其早期活化作用，使其对病毒的先天性免疫（炎症反应）减少，为病毒复制提供了便利[29]。科学家们还发现，sGP能够与中和抗体结合以抑制抗GP抗血清的中和反应，这可以解释当感染发生时为什么在病人的血清里并没有检测到GP特异性抗体，却发现了EBOV其他主要病毒蛋白的抗体[30]。综上所述，sGP与宿主免疫细胞的密切互作可能是其能逃避免疫反应的重要原因之一。
此外，宿主细胞中新合成的GP蛋白不但可以与细胞的整合素（integrins）结合诱导细胞变圆和细胞分离，导致细胞病变，还可以与上皮细胞更加紧密的结合，破坏微血管的完整性，引起血管渗漏[31, 32]，从而诱导上皮细胞的感染导致其功能紊乱，导致出血热晚期阶段的出血症状。
VP24、VP40与病毒颗粒的成熟有密切关系。VP40是丝状病毒毒粒中量最丰富的一类蛋白，VP40长约326个氨基酸，含大量的疏水区，保守性较高，具有与细胞因子相互作用的位点，与病毒的成熟和释放有关，同时它与GP共表达，产生具特定形态、有侵染力的病毒粒子。VP40是由2个富含β折叠的结构相似的结构域组成，而这两个结构域由6个氨基酸残基构成的桥段连接。VP40可以通过其C端与细胞膜紧密结合，具有抵抗高盐度的特点。相对于其他病毒蛋白来说，VP40最突出的特点是能够发生寡聚化作用（oligomerzation）[33]。Scianimanico等[34]发现VP40与质膜结合后会发生自体寡聚化，并暴露出其N端结构域从而可与其他VP40单体结合。科学家已经分离出了VP40的六聚体和八聚体（结构元件都是VP40二聚体），两者结构均为环状结构，能与核酸结合。Gomis-Ruth等[35]推测，这种VP40八聚体可能与毒粒的核衣壳形成有关，还可能参与对毒粒RNA转录和翻译的调控过程。利用哺乳动物细胞表达的VP40能以与膜结合的形式释放到培养基中，其中VP40的N端结构域在毒粒装配和出芽过程中起着重要的作用[36]。进一步的研究表明，VP40中一种保守的结构域Late-domain，在毒粒的出芽过程中也起着非常重要的作用。Late-domain主要有3个重要的基序：PTAP、PPxY和YxxL。VP40的PPxY基序在其N端部分，若对PPxY序列的酪氨酸残基进行突变，则对出芽过程造成影响[37]。Late-domain可以在VP40的不同部位发挥相同的作用：当把VP40 N端的Late-domain去除而插入C端后，由VP40介导的病毒样颗粒（virus-like particles，VLPs）的释放活性不会发生改变。Late-domain与细胞因子还可发生相互作用促进其出芽过程。目前认为EBOV病毒颗粒的组装和出芽过程是VP40单体首先通过其C端与多囊泡体（multi-vesicularbodies，MVB）结合，这种结合使VP40的构象发生变化从而自体寡聚化。Nedd4与VP40的PPxY基序结合后能够泛素化VP40和邻近的蛋白[38]。Tsg101与ESCRT1复合物结合后，再协同ESCRT复合物与泛素化了的VP40 MVB复合物结合，然后一起被运送到质膜。在质膜上，VP40 MVB复合物在ESCRT复合物诱导膜的外翻作用下逐渐形成小泡，ESCRT复合物还能促进成熟毒粒的聚集，最终导致毒粒的释放[37, 38]。
VP24为小型膜蛋白，可能与病毒的组装和出芽释放有关。VP24被认为是第2基质蛋白，VP24在EBOV中是一种次级基质蛋白，同时也是毒粒的次要组成成分，分布于细胞的质膜或者核周区域，具有膜蛋白的所有性质。目前在EBOV-Z的VP24的氨基酸序列中，发现了3个N端连接糖蛋白的潜在位点，分别在氨基酸序列的第84、185和246位置上，同时还发现了序列中存在着一段富含疏水残基的区域，即第90、130位的氨基酸序列。目前已发现，VP24能够在哺乳动物细胞中寡聚化，并且优先形成四聚体，在这一过程中，VP24的N端区域起着十分重要的作用[39]。最近的研究表明，VP24很可能与脂筏紧密地结合在一起，在VP24的172～175的氨基酸位置，发现了序列与Late-domain（YxxL）相一致的基序，而且在VLPs中检测到了VP24的存在，这表明VP24很有可能在病毒的装配和出芽过程中起到重要的作用[40]。此外，VP24能够抑制α干扰素（IFN-α）信号转导通路，逃避宿主免疫系统的监视[41]。
NP是核蛋白的主要成分，其基因定位于基因组的3′端，带有一个前导序列，编码区含2 217个核苷酸，编码一个含737个氨基酸残基的蛋白质，相对分子质量为8.33×104[42]。NP可分为N端疏水性的一半（包含了所有的Cys残基）和C端亲水性的一半（包含了大部分的Pro残基），N端的作用可能是与基因组的RNA结合，其C端的作用可能是结合病毒的其他蛋白。NP与VP30、VP35及基因组RNA组成核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）[43]，VP30是具有锌指结构的蛋白质，VP30与核衣壳紧密结合，是病毒转录的激活因子[44, 45]，在转录起始之后作为抗转录终止因子发挥作用，另外，VP30普遍磷酸化，这一翻译后的修饰过程可调节VP30在转录过程中的活性。VP35对转录启动子有负调控作用，VP35能够抑制干扰素调节因子3（interferon regulatory factor 3，IRF3）的磷酸化[46]，而磷酸化的IRF3在IFN分泌中起转录因子的作用，病毒可能通过VP35抑制I型干扰素的产生从而关闭免疫系统[47]，因此，VP35很可能是EBOV毒力的一个重要因子。
L基因有一些较为保守的序列，据专家估计L可能是一种依赖RNA的RNA聚合酶，一般具有RNA聚合酶、外切酶等活性[48]。
3 EBOV研究的体内外模型EBOV可感染并在人、猴、豚鼠等哺乳类动物原代或者传代细胞中增殖，其中，非洲绿猴肾细胞（Vero）[49]、HeLa-229细胞[49]和人胚肺纤维母细胞[50]等最为敏感；病毒接种后，6～7 d出现细胞病变，表现为细胞圆化、皱缩，细胞质内可见纤维状或颗粒状结构的包涵体，但仅在Vero细胞中形成空斑。包涵体主要由核衣壳组成，成熟 的病毒从细胞浆中含有核衣壳的管型结构通过宿主细胞膜以芽生的形式释放。
目前常用的EBOV动物模型主要包括小鼠、豚鼠及非人灵长类3种，免疫系统完整的成熟小鼠并不能感染EBOV，推测可能是由于其强大的先天免疫系统，尤其是IFN-I型反应所导致。然而，腹腔或脑内接种病毒可导致乳鼠[51]、成熟的免疫系统缺陷SCID小鼠[52]以及IFN-α/β受体或STAT基因敲除小鼠死亡[53, 54]。另一途径是通过将EBOV-Z在免疫系统完整的乳鼠体内连续传代，来获得乳鼠适应株[55]。用EBOV攻毒豚鼠仅能引发短时的、非致死的发热症状。同样，使用EBOV-Z在近交及远交系豚鼠体内连续传代可获得使豚鼠致死的适应株。很多非人灵长类动物均被用于EBOV动物模型的研究，其中恒河猴Rhesus macaques和食蟹猴Cynomolgus macaques是目前使用的最为广泛的动物模型，均对EBOV高度敏感，可引起与人类极为类似的临床症状。食蟹猴对EBOV-Z毒株最敏感，临床症状出现最快[56, 57, 58]。现在使用的动物模型主要是啮齿类动物和灵长类动物，疫苗实验在2种动物身上取得的结果差别很大，或许二者在抗病毒的过程中存在着不同的保护机制。
4 针对EBOV的诊断学研究EBOV传染性极强，由于EHF早期的临床症状与其他一些疾病有相似之处，因此，及时检出和确诊病例对其流行控制和治疗有重要意义。EHF诊断主要依据流行病学资料、临床表现和实验室检查。目前，对EBOV病原学的检查主要有细胞分离法、ELISA检测法和PCR法3种。
在ELISA检测方面，盖微微等[59]构建了pET2B (+)-VP的重组质粒，并诱导表达VP40蛋白。该蛋白具有免疫反应性，以该蛋白为抗原建立的ELISA方法具有较高的特异性和稳定性，可用于EHF的诊断和流行病学调查。同年，该实验室构建重组病毒rVSV-ZEBOV-GP，通过蛋白印迹和共聚焦免疫荧光实验证明GP蛋白在感染细胞膜表面能够正确表达。中和实验结果表明该重组病毒能诱导小鼠产生针对GP蛋白的特异性中和抗体，证明了重组病毒作为EBOV-Z疫苗的有效性。表明rVSV-ZEBOV-GP作为防控EBOV-Z的储备性疫苗具有潜在的应用价值[60, 61]。王雪敏等[62]原核表达并纯化了EBOV-C的核蛋白，为ELISA检测法的开发奠定了基础。
在PCR检测方面，夏咸柱院士团队根据EBOV- S和EBOV-ZGP基因的保守区序列，设计一对通用引物及特异性TaqMan探针。用建立的Real-time PCR方法检测EBOV快速、灵敏、特异、重复性好，为EHF的快速确诊奠定了基础[63]。刘阳等[64]根据NP基因序列，设计引物和MGB探针，通过优化反应条件，建立了一种检测EBOV-Z和EBOV-S的一步法MGB荧光定量RT-PCR方法。
5 EBOV疫苗的研究目前还没有任何EBOV疫苗可用于人类，疫苗被认为是当前最有前途的一个研究方向之一，美国目前有多家机构在加紧研制针对EBOV的疫苗和药物。曾先后有DNA重组疫苗、增强型疫苗和病毒样颗粒疫苗问世。美国国立卫生研究院也于2014年7月31日宣布，该机构将与美国食品及药品监督管理局（FDA）合作，最早将于2014年9月开始进行埃博拉疫苗人体试验，有望在2015年早些时候得到试验结果。
5.1 DNA重组疫苗Sullivan等[65]用非人灵长类动物研制了高效的疫苗免疫，并利用DNA重组疫苗在食蟹猴和短尾猴体内诱发了自身免疫机制，其免疫动物无症状达6个月，而且最后未检测到EBOV。由于用病毒载体进行初次免疫时，宿主对载体自身的应答作用会降低对重组载体的免疫应答效果，从而降低了疫苗的临床效果。而非病毒DNA疫苗可以克服这一缺陷，但这种方法要求很高的注射剂量，而且克隆DNA有整合到宿主基因组的风险，具有潜在的安全性问题[66]。
5.2 增强型疫苗此疫苗由美国国立卫生研究院Nabel等于2000年研制开发的，是继DNA疫苗之后的又一新型疫苗，目前已进入II期临床阶段。该疫苗主要采取两步走的策略，首先向动物体内注射DNA疫苗，随后用腺病毒载体疫苗加强免疫，结果发现小鼠抗体效价的增长较单用DNA疫苗有10～100倍的增长。然后在恒河猴中进行进一步试验，结果显示接种安慰剂的4只猴子在2周内死亡，而接种疫苗的4只猴子均存活。然而，该疫苗接种过程长达6个月，需4次注射，无法快速控制疾病的传播[67, 68]。
5.3 病毒样颗粒疫苗病毒样颗粒疫苗是由病毒衣壳蛋白或包膜蛋白自主包装形成的空衣壳结构，能快速刺激机体产生体液免疫和细胞免疫应答，病毒样粒子不含有病毒遗传物质和免疫抑制蛋白，安全性高[69]。可以通过单独表达VP40或与GP联合表达产生EBOV病毒样颗粒，这种病毒颗粒缺失了EBOV基因组和NP、VP30、VP24和VP35，被认为是最安全、最有潜力的候选疫苗。Warfield等[70]研究发现，病毒样颗粒疫苗能够激活CD4+、CD8+ T细胞，产生IgG抗体，活化B细胞，并且没有细胞因子反应毒性。此外，免疫病毒样颗粒可以增加小鼠NK细胞浓度，免疫NK细胞缺失小鼠并不能完全保护，野生型则可以完全保护。免疫豚鼠后也可以获得完全保护，并检测出高滴度中和抗体。在以非人灵长类（NHPs）为模型进行免疫保护实验，NHPs也能获得完全保护，且未发现EBOV感染的临床及实验室症状[70]。在免疫的NHPs血液中检测到高滴度的抗体和CD4+ T细胞增加。
6 抗EBOV药物与靶点的研究目前对EHF尚无特效治疗方法和可以利用的疫苗，一些抗病毒药如IFN和利巴韦林对EHF无效。目前对EHF病人主要采取对症治疗的策略，包括注意水电解质平衡、控制出血，肾脏衰竭时进行透析治疗等。
6.1 在研的抗EBOV药物Mapp生物制药公司正在测试针对病毒的单克隆抗体组合药物ZMapp，该药物来自感染EBOV的实验动物体内产生的抗体，由3种单克隆抗体混合制成，这种抗体能够吸附在EBOV表面的蛋白上，降低病毒识别目标细胞的能力，从而阻止病毒入侵宿主细胞。每一种不同类型的抗体与病毒蛋白的不同部位结合，使被病毒感染的细胞不再与其他细胞结合，并且可以激活其他免疫系统而杀死被感染的细胞[71]。Tekmira制药公司研制的抗感染药物TKM-Ebola通过干扰病毒生活史发挥效用，这项技术可能拥有抗EBOV的潜力[72, 73]。该药已经获得FDA临床研究申请批准，I期临床研究正在进行中[74, 75]。
日本富山化学工业公司日前表示，其研制的法匹拉韦能有效阻止细胞内的病毒增殖，在对抗EBOV方面很可能具有一定的疗效。法匹拉韦是一种流感治疗药物，通过阻碍细胞内的基因复制，从而遏制病毒本身的增殖[76, 77]。Oestereich等证实法匹拉韦在体外抗EBOV的IC90为110 μmol/L，感染6 d后给药对动物的保护率达100%[78]。Smither等[79]认为由于流感病毒和EBOV类似，都是RNA病毒，所以法匹拉韦有可能阻碍EBOV在细胞内增殖，从而遏制感染。法匹拉韦作为新型抗流感药已获批在日本制造销售，在美国，富山化学工业公司于2007年申请对该药进行临床试验，确认其作为抗流感药物的疗效，美国卫生部门正准备加速审批是否用法匹拉韦开展抗EBOV临床试验。
2014年8月30日，军事医学科学院微生物流行病研究所由王洪权研究员领衔的科研团队宣布，我国首个抗EBOV药物jk-05已完成临床前研究，历时5年研制的药物jk-05近日通过总后卫生部专家评审，获得军队特需药品批件。该药连同此前获批生产的EBOV检测试剂等科研成果为我国防控埃博拉疫情提供了关键技术手段。jk-05是一种小分子化学药物，该药能够选择性地抑制EBOV的RNA聚合酶，从而达到抑制病毒复制的目的。研究表明，该药在细胞和动物水平感染实验中具有抗EBOV活性。专家特别强调，该药物虽已完成临床前研究，并在适用于广谱抗流感时完成了临床安全性评价，但对于EHF热治疗，目前仍仅限于紧急情况下使用。
6.2 GP蛋白相关靶点GP蛋白在病毒入侵和感染人体细胞的过程中具有重要作用，Schornberg等[80]通过化学抑制剂和小干扰RNA的作用，确证了组织蛋白酶B和L在EBOV糖蛋白介导的感染中所起的作用。基于以上结果，如果能够人工合成抑制组织蛋白酶B和L的药物，有可能成为对抗EBOV的新手段。许多研究表明，EBOV除了表达GP蛋白外，还表达2种分泌型糖蛋白和1种Δ-肽段。其中分泌型糖蛋白包括sGP和小分子分泌型糖蛋白（ssGP）。这些糖蛋白与GP蛋白相比具有相同的N端，其中包含受体结合区域，但C末端不同。Radoshitzky等[81]将合成的sGP、ssGP以及Δ-肽段分别加入Vero-E6和HeLa等细胞系中孵育，发现这些肽段能够抑制病毒通过GP介导的方式穿入细胞。推测可能的机制是这些糖蛋白与GP蛋白竞争结合细胞表面的受体，或者是干扰了组织蛋白酶对GP的切割。此外，furin蛋白酶抑制剂也是潜在的药物设计靶点之一[18]。
6.3 NPC1靶点NPC1编码胆固醇转运蛋白，该蛋白与EBOV进入宿主细胞有关[26]。NPC1突变细胞进行感染实验，发现携带EBOV包膜蛋白且有复制能力的水泡性口炎病毒几乎不感染该细胞，而当细胞再次表达NPC1后其又恢复了对病毒的易感性[26]。Côté等[82]在CHO模型上的结果与之相一致；该研究还发现NPC1的小分子抑制剂如苄基哌嗪金刚烷二酰胺衍生物对EBOV感染绿猴肾细胞有干扰作用。早在2006年，Côté等[83]就从4万个小分子的化合物库中筛选得到NPC1蛋白抑制剂苄基哌嗪金刚烷胺。因此，NPC1蛋白也是抗EBOV药物开发的潜在靶点之一[84]。
7 中药在抗EBOV方面具有光明前景中药用于EBOV感染的治疗目前未见报道，但也是用于治疗EBOV感染的一个潜在选择。现代药理学证实中药具有抗病毒、抗菌、抗内毒素、消炎解热及调节免疫功能等作用，抗病毒作用尤为显著，并不断被药理研究和临床实践所证实。中药的抗病毒作用非常广泛，几乎涉及到常见的病毒，如流感病毒、副流感病毒、鼻病毒、腺病毒、腮腺炎病毒、乙型肝炎病毒、孤儿病毒、柯萨奇病毒、乙型脑炎病毒、出血热病毒、脊髓灰质炎病毒、疱疹病毒[85]等，并且在抗流感病毒[86, 87]、呼吸道合胞病毒[88, 89]和肠道病毒[90, 91, 92]等方面都已有广泛的应用。
中药在防治病毒感染性疾病方面具有独特的优势和广阔的发展前景，由于其自身的药物特性，也表现出不同于化学药的一些特点：中药的抗病毒作用不仅体现在直接阻断病毒的生命周期（直接杀灭病毒[93, 94]、阻挡病毒的吸附与入侵[95]、抑制病毒自我复制[96]、抑制病毒颗粒的释放[97, 98]等），而且许多药物兼有缩短发热时间、控制炎症扩散[99]等作用；另一方面还可以激发机体的主动免疫机制[100]，刺激免疫系统产生肿瘤坏死因子、干扰素、白细胞介素等细胞因子[101]，杀伤病毒，减轻病毒产生的毒素对机体的损害，间接发挥抗病毒作用等，即对病毒以及病毒引起的病理反应能多途径、多方位起作用。中医药治疗病毒性疾病时，辨证论治是其不同于化学药的优势，明确病毒性疾病特性，选用有针对性的抗病毒药物，即随证选药、随病用药，如治疗病毒性肝炎，属肝胆湿热，应选用黄芩，既可清热利湿，又有抗肝炎病毒作用；若肝炎属气阴两虚证型，则应选用女贞子治疗，女贞子既有补阴功效，同时也有抗肝炎病毒作用。以此类推，这样才更能充分发中药抗病毒的优势及治疗效果[102]。另有学者认为，由于中药化学成分的多元化，其抗病毒机制可能是综合作用的结果，同时病毒对其也很少产生抗药性。因此，在中药抗病毒药的筛选中，除了从单味药着手外，也应关注复方制剂、拆方、中药有效成分、多种有效成分联合应用等多个方面进行研究。
国内外关于中药、天然药物抗病毒的实验室和临床研究为中医药科学地用于EBOV的治疗提供了扎实的基础。根据传统中医理论，埃博拉属于温病中的营血症，具有发病和转变迅速的特点[103]。部分中药清热解毒的功效可以截断病势，降低高热期引发其他疾病的可能性，在目前应对埃博拉等传染病尚无特效药物和疫苗情况下，早期使用清热凉血药物是合适的。《中医药治疗埃博拉出血热专家指导意见（第一版）》建议，根据埃博拉病情的不同阶段和中医证侯，在口服制剂方面推荐临床使用双黄连、抗病毒和清开灵等口服液，在注射剂方面推荐临床使用喜炎平、热毒宁、清开灵和痰热清等注射液，为临床中医药治疗EHF给予了指导。结合发病原因、流行病特点以及患者证侯的表现，用中药控制病情、防止向重症发展方面，中药具有重要的临床意义。目前，鉴于中药治疗病毒性疾病确证的疗效和特点，已普遍出现在国家有关部门颁发的病毒性疾病治疗指南上，包括《登革热诊疗指南（2014年第2版）》、《人感染H7N9禽流感诊疗方案（2014年版）》以及《手足口病诊疗指南（2012年版）》等。上述国家行业管理机构的指导性意见均表明，随着研究的日益深入和普及，为中医药的抗病毒治疗提供了更广泛和有效的选择方案，在严格把控质量标准的前提下，中药应用于抗EBOV等病毒感染具有光明的前景。
同时，中药的发展也必须与时俱进，实现现代化，达到“安全、有效、可控”的要求。中药治疗病毒感染性疾病，不单纯着眼于直接的抗病毒作用，而是重视病毒-机体-中药三者的关系；不仅以清除体内病原体为目的，而且能通过调动机体特异性和非特异性免疫功能来增强抗病毒感染的能力。中药抗病毒的临床应用与研究目前还存在不少亟待解决的问题，一是就大部分药物而言，其抗病毒作用的有效成分尚不十分明确；二是临床使用证明有抗病毒作用的药物，实验效果却并不满意，也有的药物实验研究表明有抗病毒活性而未能在临床实践中进行验证或应用；三是人们眼前往往重视药物实验和临床的研究，即药效学的研究，但缺乏药动学的研究，即对抗病毒药物在体内的代谢过程、量效关系、构效关系以及作用环节研究不够[104]。另外，复方是中医应用的主要的也是最广泛的形式，对方剂和中成药整方，即复方抗病毒作用的研究，也将是一个长期而又艰巨的任务。
8 结语与展望自2014年2月份EBOV疫情出现，感染人数就在不断上升，已致1.5万人感染，逾5 000人死亡，这场流行病已经被认定为是非洲有史以来最严重的疫情。近年来在对EBOV的感染机制研究中取得了多项重大突破，但还有许多争议有待解决。总之，随着对于EBOV感染机制的研究不断深入，将有更多的潜在治疗靶点浮出水面。这不仅有利于EBOV疫苗和药物的研究，特别是中药和天然药物的研发，也对其他丝状病毒或出血热病毒的研究有重要的启示作用。
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