罗汉果Siraitia grosvenorii (Swingle) C. Jeffrey ex A. M. Lu et Z. Y. Zhang是雌雄异株的葫芦科（Cucurbitaceae）罗汉果属Siraitia Merr. 多年生藤本植物^[1]，为我国特有的珍贵药用和甜料植物，主要产于广西的永福、临桂、龙胜等地^[2]。罗汉果果实是传统中药，可用于治疗气管炎、急慢性咽喉炎、哮喘和感冒等。此外，其果实中还含多种甜苷，其中甜苷V为世界上最强的非糖甜味物质之一，为蔗糖甜度的300～400倍，是一种综合性状极佳的天然甜味剂，广泛应用于食品、保健品、药品中，适合所有人群长期食用，是糖尿病人、肥胖者、高血压患者的理想糖替代品^{[3, 4]}，也是我国出口增长最快的植物提取物之一。多倍体罗汉果可大幅提高根、茎、叶、果实等部位的生物量和产量，增强抗逆性，提高活性成分的量，其中三倍体还具有无籽的特性，大大提高了整果利用率和甜苷提取收得率，对整个罗汉果产业具有里程碑的意义^[5]。

罗汉果三倍体雌株经二倍体雄株授粉后所结的果实即为无籽罗汉果。本研究拟利用ISSR分子标记技术^{[6, 7, 8]}探讨罗汉果三倍体雌株和二倍体雄株的遗传背景，为无籽罗汉果优良品种的选育提供依据。

材料采自广西桂林兴安县漠川乡的罗汉果种植基地，总共采集到28份材料：二倍体雄株7份；三倍体雌株21份，利用二倍体（或四倍体）父本花粉对四倍体（或二倍体）母本柱头进行人工授粉杂交获得（表 1）。每份材料选取生长状况良好的罗汉果单株3～5株，采集约10片健康成熟叶片混合成该份材料的样品，所有材料经广西药用植物园白隆华研究员鉴定为葫芦科植物罗汉果Siraitia grosvenorii (Swingle) C. Jeffrey ex A. M. Lu et Z. Y. Zhang的叶片，用硅胶干燥保存，带回实验室中待用。

表 1(Table 1)

表 1 材料来源、倍性和雌雄 Table 1 Material source,ploids,and male/female used in study 编号 材料 倍性 雌/雄 编号 材料 倍性 雌/雄 M201 Dongguaguo 2x ♂ F308 Keyan1 C×M202 3x ♀ M202 Qingpiguo 2x ♂ F309 Keyan1 C×M204 3x ♀ M203 Male 1 2x ♂ F310 Nongjia×M205 3x ♀ M204 Hongmaoguo 2x ♂ F311 Nongjia×M206 3x ♀ M205 Dongguaguo 2 2x ♂ F312 Nongjia×M201 3x ♀ M206 Changtanguo 2x ♂ F313 Nongjia×M202 3x ♀ M207 Hongmaoguo 2 2x ♂ F314 Nongyuan B6×M205 3x ♀ F301 Bolin 3×M205 3x ♀ F315 Nongyuan B6×M204 3x ♀ F302 Bolin 3×M206 3x ♀ F316 Yongqing 1×M205 3x ♀ F303 Bolin 3×M204 3x ♀ F317 Yongqing 1×M206 3x ♀ F304 Bolin 3×M202 3x ♀ F318 Yongqing 1 (2n)×Dongguaguo (4n) 3x ♀ F305 Keyan1 C×M205 3x ♀ F319 Yongqing 1 (2n)×Changtanguo (4n) 3x ♀ F306 Keyan1 C×M206 3x ♀ F320 Keyan1 C (2n)×Dongguaguo (4n) 3x ♀ F307 Keyan1 C×M201 3x ♀ F321 Keyan1 C (2n)×Changtanguo (4n) 3x ♀

表 1 材料来源、倍性和雌雄 Table 1 Material source,ploids,and male/female used in study

采用改良的CTAB法^[9]提取罗汉果叶片的总DNA。

PCR-ISSR反应体系及反应程序^[10] 25 μL PCR扩增反应体系中含10×缓冲液 2.5 μL，MgCl₂ 2.0 mmol/L，脱氧核糖核苷酸（dNTP）0.2 mmol/L（上海生工生物工程技术服务有限公司），ISSR引物0.5 μmol/L（上海生工生物工程技术服务有限公司），Taq DNA聚合酶（MBI Fermentas公司）1.0 U，模板DNA约30～50 ng，超纯水补至25 μL。在PCR仪（美国BIO-RAD伯乐公司，型号PTC-200）上进行以下扩增反应程序：94 ℃预变性3 min，接着进行40个循环（94 ℃变性1 min，52 ℃退火52 s，72 ℃延伸2 min），循环结束后72 ℃延伸7 min。

引物筛选 随机选出6份样品（包含二倍体和四倍体）进行引物筛选，从100条ISSR引物中筛选出13条扩增反应稳定、条带清晰、具有多态性的引物，并用于所有材料的扩增。13个ISSR引物名称、序列（表 2）。

表 2(Table 2)

表 2 引物名称、序列及其对28份材料的扩增条带统计 Table 2 Primers,sequences,and amplification bands on 28 individuals 引物 引物序列5’-3’ 扩增总条带数 多态性条带数 多态性百分比/% UBC823 (TC)8C 8 6 75.00 UBC825 (AC)8T 8 4 50.00 UBC826 (AC)8C 7 3 42.86 UBC827 (AC)8G 9 5 55.56 UBC846 (CA)8RT 10 7 70.00 UBC850 (GT)8YC 5 4 80.00 UBC857 (AC)8YG 8 5 62.50 UBC873 (GACA)4 15 13 86.67 UBC881 (G)3(TGGGG)2TG 11 10 90.91 UBC889 DBD (AC)7 9 5 55.56 UBC891 HVH (TG)7 9 7 77.78 UBC896 AGGT (CG)2G CCGC(N)5ATG 11 10 90.91 UBC900 AC(T)2(C)3(CA)2 (G)2(T)2(A)2(CA)2 21 20 95.24 总计 131 99 75.57 N = (A,G,C,T),R = (A,G),Y = (C,T),B = (C,G,T) ( i. e. not A),D = (A,G,T) ( i. e. not C),H = (A,C,T) ( i. e. not G),V = (A,C,G) (i. e. not T)

表 2 引物名称、序列及其对28份材料的扩增条带统计 Table 2 Primers,sequences,and amplification bands on 28 individuals

将扩增产物置于1.5%的琼脂糖凝胶中电泳，凝胶上所加电压不超过5 V/cm，用Lambda DNA/EcoR I＋Hind III Marker（MBI Fermentas公司）作为标准相对分子质量对照，经溴化乙锭（EB）染色20～30 min，在凝胶成像系统上观察照相、记录。

ISSR为显性标记，同一引物的扩增产物中电泳迁移率一致的条带被认为具有同源性，相同迁移位置上有扩增条带记录为“1”，无扩增条带记录为“0”，构建“0”“1”原始矩阵。仅清晰、稳定、可分辨的并且长度在400～2 000 bp内的ISSR扩增条带才被记录。用AFLP-SURV version 1.0^[11]计算材料间遗传距离，并计算Nei & Li遗传相似性系数；用NTSYS-pc version 2.02^[12]软件的UPGMA（unweighted pair group method using arithmatic average）方法进行聚类分析；用GenAIEx version 6.3^[13]进行主坐标分析。

用13个ISSR引物对28份材料的总DNA进行PCR扩增，重复2次，扩增产物重复性好且稳定，扩增得到的条带数及多态性条带见表 2。13个引物扩增条带数的范围为5～21条，共同带在1～4条内，多态性条带数范围为3～20条，多态性百分比为42.86%～95.24%，且由总计的结果可知，扩增总条带数为131条（平均每个引物10.08条），其中多态性总条带数为99条，多态性条带百分比为75.57%。引物UBC900得到的条带数最多，为21条；引物UBC850得到的条带最少，为5条。其中引物UBC873的扩增图谱见图 1。此外，在不同罗汉果品种间存在的多态性条带可作为鉴定品种的特征带。

图 1 引物UBC873对28份材料的ISSR扩增图谱Fig. 1 ISSR amplification from DNA of 28 individuals using Primer UBC873

28份材料间的相似性系数变化为0.639 9～0.915 7，其中F311与M205间的相似性系数最低（0.639 9），遗传距离最高（0.446 5）；而F307与F318间的相似性系数最高（0.915 7），遗传距离最小（0.088 1）。

图 2为28份材料的聚类树状图，从图 2中可看出：F307和F318直接聚为一类，具有很高的相似性系数，两者距离最近，与上面的相似性系数及遗传距离的数值是一致的。

图 2 供试28份材料的UPGMA聚类图Fig. 2 UPGMA dendrogram for 28 individuals

在相似性系数为0.82处，28份三倍体雌株与二倍体雄株被分为4大类，第1类为F301、F302；第2类为F303、F304；第3类为F305、F312、F313、F314、M201、M202、M203、F306、F307、F308、F315、F316、317、F318、F319、F320、F321、F309、F310、F311；第4类为M204、M205、M206、M207。

主坐标分析（principal coordinate analysis，PCoA）是基于Nei & Li遗传距离及相应的相似性系数进行的。因此，主坐标分析图中各个个体（品种）间的位置关系反映了它们在遗传上的相似性。由于每份试验材料都是通过选取生长状况良好的罗汉果单株3～5株，共采集约10张健康成熟叶片混合而成的，故此28份材料的主坐标分析可看作“双变量主坐标分析”（double principal coordinate analysis，DPCoA：一种将物种与物种之间差异考虑到群体间相互关系的测度之中的排序方法）^{[14, 15]}。通过ISSR标记对28份材料进行DPCoA排序，发现前3个主坐标的方差贡献率分别为22.76%、19.70%和18.21%，相对应的累积贡献率分别为22.76%、42.46%和60.67%。一般认为，如果前3个主要特征向量的方差占总方差的40%以上，则排序效果是满意的^[16]，本实验结果28份材料的前3个主要特征向量的方差累积贡献率高达60.67%，说明了降维效果较好。因此，保留DPCoA的前二轴对28份材料进行排序分析，应用GenAIEx version 6.3获取坐标轴特征值及样品特征向量，并据此划分出28份不同材料在DPCoA前二轴空间中的排序（图 3）。

图 3 28份材料的第1、2主坐标二维散点图Fig. 3 Scatterplot of first and second double principal coordinates on 28 individuals

由Proj划分而得的28份材料在PCoA排序图中空间分布十分明显，除F315和F320有部分交叉重叠外，其余样品间均无交叉重叠现象。PCoA排序图把28份材料分为3大类。

第1大类包括三倍体雌株14份（F301、F302、F303、F304、F305、F308、F311、F312、F313、F314、F315、F319、F320、F321），二倍体雄株3份（M201、M202、M203）。

第2大类包括三倍体雌株7份（F306、F307、F309、F310、F316、F317、F318），二倍体雄株2份（M206、M207）。

第3大类包括二倍体雄株2份（M204、M205）。

比较图 2和图 3可知，对28份材料所进行的亲缘关系聚类分析和双变量主坐标分析的结果基本上是一致的，雌雄株间距离相对较近的聚在一起，而双变量主坐标分析能从多个方向、多个层面更直观和准确地反映材料间的遗传关系。

研究种质资源的遗传背景、遗传结构及亲缘关系，可以为优良品种的选育提供帮助，这就需要一种甚至多种可靠的、鉴别力强的分子鉴定手段^[17]。采用13个ISSR引物对28份罗汉果（三倍体雌株与二倍体雄株）进行PCR扩增，结果呈现出不同程度的多态性和共同性，这一方面说明罗汉果种质遗传背景的复杂性，另一方面也说明材料之间具有一定的共同性^[18]。其中，某些种质的父本（或母本）是相同的，它们之间的距离相对较近，说明ISSR对于亲缘关系较近的材料能检测出较高的多态性。此外，在亲缘关系较远的种质间检测出数目不等的特征带，说明ISSR技术也可用于遗传距离较远的种质间鉴别。

在ISSR结果分析中，遗传相似性系数和遗传距离的结果是一致的；而且系统聚类分析和主坐标分析的结果基本上也是一致的，虽然聚类和主坐标都能对样品进行聚类分析，但它们所反映的信息却有所不同，系统聚类分析对密切相关的个体间有很高的分辩率，其最终结果将所有的种质都聚为一类，而双变量主坐标分析却能在不同群体之间的距离上、从不同的方向和层面提供更多的信息，可以更加直观的揭示供试材料间的差异^[19]。因此，两者并不重复，一般将主坐标分析和系统聚类分析结合起来使用，以便对聚类结果做更全面的解释^[20]；所以，本研究将遗传相似性系数、遗传距离和聚类、双变量主坐标分析结合起来，全面分析罗汉果三倍体雌株与二倍体雄株的遗传背景。

根据ISSR分析结果，有的材料之间虽然是不同的种质，但遗传相似性系数较高，说明了它们的亲缘关系近；如：F313因为由Nongjia与M202株系杂交而成，所以与M202关系较近，其相似性系数高达0.839 1。此外，在三倍体雌株中，如果其亲本相同或相似性系数较高，由于子代继承了亲本一定的遗传物质，从而子代间的相似性系数也会较高，如F305和F306、F320与F321，由于其母本都是Keyan 1 C，故它们的相似性系数分别高达0.919 3和0.900 4；而F305和F310也都为同一父本M205，所以其相似性系数也高达0.855 6。

多倍体育种，主要利用多倍体效应和杂交优势，就后者来说，要求亲本的优良性状能互补，并且亲缘关系较远。本研究根据陈受良等^[21]提出的结合线法，将28份罗汉果材料的ISSR聚类结果进行了划分，认为无籽罗汉果亲本间的相似性系数以0.82较为合适，这是因为：相似性系数过低，亲本间的同源性随之降低，容易向远缘杂交方向偏移，尤其是栽培种和野生种间的杂交，经常会伴随部分野生性状，降低杂种优势的利用效率，从而难以获得生产上需要的新类型；反之，相似性系数过高，亲本间趋于同源，杂种优势减弱。

在本实验中，F311与M205间的相似性系数仅为0.639 9，F321与M204、F321与M205间的相似性系数也都仅为0.678 2，遗传距离较大；而且M205与其他27份材料间的相似性系数在0.6～0.7的有6个之多，其中母本5个。推测在罗汉果三倍体雌株与二倍体雄株中，最适合作雌雄组配的是F311和M205，其次是F321和M204、F321和M205。

值得指出的是，虽然罗汉果三倍体雌株和二倍体雄株的遗传背景存在一定的复杂性，但大多遗传相似性系数较大，遗传距离较近，应该尽快采取相应措施，进行种质创新，进一步丰富三倍体雌株和二倍体雄株的遗传背景，为无籽罗汉果优良品种的选育奠定坚实基础。