远志属Polygala L. 是一个世界性分布的大属，尤以热带、亚热带为盛，约500种^[1]，传统分类分为10个组^[2]或12个亚属^[3]。我国有3个亚属，42种8变种，全国分布，以西南和华南地区最多，3个亚属分别是黄杨亚属、小扁豆亚属和远志亚属^{[1, 4]}。远志属植物含有丰富的三萜皂苷、酮、寡糖酯类成分及其他活性成分，组成该属植物生理活性的有效物质群，该属植物有镇咳、祛痰、益智、安定、解毒消肿、补益强壮等作用^{[5, 6]}。在临床和民间常用于心神不安、惊悸失眠健忘、咳痰不爽、疮疡肿毒等^[6]。肾果小扁豆Polygala furcata Royle、瓜子金P. japonica Houtt.、远志P. tenuifolia Willd.、华南远志P. glomerata Lour.、蓼叶远志P. persicariifolia DC. 卵叶远志P. sibirica L. 及小花远志P. arvensis Willd. 为常见的远志属药用植物，近年来，在化学成分、HPLC指纹图谱、遗传多样性、组织培养和药理作用等方面有一些相关研究^{[7, 8, 9]}。

核糖体DNA内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）序列由于长度保守、信息位点丰富、核苷酸变异快，已被广泛用于植物种间、属间和科内的系统发育与分类研究^{[10, 11, 12]}。近年来，在药用植物分子鉴定、遗传多样性、系统分类等方面有大量研究^{[9, 13, 14]}，而有关用ITS序列鉴定远志属药用植物的研究未见报道。本研究通过测定ITS1、ITS2序列，构建远志属7种植物的系统发育树，从分子系统学角度探讨其亲缘关系，同时为远志属药用植物分子鉴定提供参考。

远志Polygala tenuifolia Willd.（山西盂县和灵丘）和卵叶远志Polygala sibirica L.（山西盂县）由山西中医学院樊杰讲师鉴定。肾果小扁豆Polygala furcata Royle、华南远志Polygala glomerata Lour. 及小花远志Polygala arvensis Willd. 的叶片材料取自中国科学院植物所标本馆。从GenBank数据库获得另外3个种的ITS序列3条，材料来源和GenBank 数据见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 样品来源 Table 1 Sample sources 种名 来源 GenBank登录号 ITS1 ITS2 肾果小扁豆 中国科学院植物所标本馆 KJ490654 KJ490656 华南远志 中国科学院植物所标本馆 KJ490653 KJ490657 远志-1（山西灵丘） 山西中医学院 KJ462466 KJ490655 远志-2（山西盂县） 山西中医学院 KJ755057 KJ755057 小花远志 中国科学院植物所标本馆 KJ755055 KJ755055 卵叶远志-1（山西盂县） 山西中医学院 KJ755056 KJ755056 卵叶远志-2 － GQ889020 GQ889020 蓼叶远志 － GQ888998 GQ888998 瓜子金 － GQ888972 GQ888972 *GenBank下载序列 *GenBank download sequence

表 1 样品来源 Table 1 Sample sources

DNA的制备采用改良CTAB法，但无法获得进行后续PCR的DNA，根据文献报道 ^[15]对实验环节略作调整，水浴温度45 ℃，水浴5 h，加异丙醇沉淀1 h。

引物参考文献中的引物^[14]，ITS片段均无法一次完成PCR扩增，所以分为ITS1和ITS2两段扩增。使用的引物包括ITS正向：5’-CGAGAAGTCCAC-TGAACCTTATC-3’和ITS反向：5’-TCTTYTCCTC-CGCTTATTGATATGC-3’；ITS internal 反向：5’-GCGTTCAAAGACTCGATGGTTC-3’和ITS internal正向：5’-GACTCTCGGCAACGGATATCTCGGC-3’。PCR反应在PTC-200型PCR仪上进行。PCR总体积为25 μL，包括：12.5 μL Mix（Takara Premix Taq），10 μm引物各0.5 μL，0.5～1 μL模板（10～50 ng），用灭菌超纯水补足反应体积。扩增程序为：94 ℃、3 min，33 个循环：94 ℃、1 min，58 ℃、1 min，72 ℃、80 s，72 ℃、6 min。PCR产物10 μL用1%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物送华大基因测序。

序列通过Sequin软件提交至NCBI 数据库，并获得相应登录号。ClustalX 1.81软件用于序列比对，采用MEGA 3.1软件计算遗传距离并构建系统发育树。

测序结果表明，序列中除ITS1和ITS2的全长外，还包含5.8、18、28 S的部分序列，远志属4种药用植物的ITS序列已提交至NCBI，GenBank登录号和对应的植物名称见表 1。序列分析结果表明，远志属7种药用植物ITS1长度为279～291 bp，（G＋C）量为55.6%～62.5%；ITS2的长度为211～219 bp，（G＋C）量为59.3%～65.0%。结果见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 远志属7种药用植物ITS1、ITS2序列长度及(G＋C)量 Table 2 Length and G + C contents of ITS1 and ITS2 sequences of seven medicinal plants in Polygala L. 样品 ITS1 ITS2 长度/bp (G＋C)/% 长度/bp (G＋C)/% 肾果小扁豆 291 55.6 211 59.3 华南远志 285 62.1 219 64.3 远志-1 282 61.7 216 64.4 远志-2 282 61.7 216 64.4 小花远志 284 62.0 215 63.3 卵叶远志-1 282 62.4 217 65.0 卵叶远志-2 282 62.4 217 65.0 蓼叶远志 279 61.2 212 62.3 瓜子金 280 62.5 216 64.4

表 2 远志属7种药用植物ITS1、ITS2序列长度及(G＋C)量 Table 2 Length and G + C contents of ITS1 and ITS2 sequences of seven medicinal plants in Polygala L.

利用Clustal X 1.81软件分别对ITS1和ITS2的9个序列进行比对，结果表明，ITS1和ITS2结果类似，ITS1序列远志与卵叶远志之间差异最小，仅存在1个碱基的差别，其余种间差别都很大；ITS2序列远志与卵叶远志之间差异最小，仅存在1个碱基的差别，瓜子金与远志有2个碱基差异，与卵叶远志有3个碱基的差异；其余种间差别都很大。

利用MEGA 3.1软件计算ITS1和ITS2的变异位点及信息位点，结果表明，ITS1含144个变异位点和35个信息位点，分别占总位点数的42.48%和10.32%；而ITS2序列中的变异位点和信息位点分别为88和18个，占总位点数的37.93%和7.76%。利用MEGA 3.1的Kimura 2-parameter计算6种药用植物之间的遗传距离，结果表明，远志的2个样品及卵叶远志的2个样品之间遗传距离为0，远志与卵叶远志之间的遗传距离为0.006，两者的亲缘关系为种间最近；华南远志与肾果小扁豆之间遗传距离最大，达0.472，两者关系最远（表 3）。

表 3(Table 3)

表 3 远志属7种药用植物的遗传距离 Table 3 Genetic distances among seven medicinal plants in Polygala L. 样品 远志-2 卵叶远志-1 小花远志 肾果小扁豆 蓼叶远志 远志-1 卵叶远志-2 瓜子金 华南远志 远志-2 1.000 卵叶远志-1 0.006 1.000 小花远志 0.057 0.055 1.000 肾果小扁豆 0.428 0.428 0.432 1.000 蓼叶远志 0.155 0.149 0.157 0.457 1.000 远志-1 0.000 0.006 0.059 0.431 0.157 1.000 卵叶远志-2 0.006 0.000 0.057 0.432 0.152 0.006 1.000 瓜子金 0.050 0.050 0.051 0.440 0.166 0.053 0.052 1.000 华南远志 0.171 0.173 0.176 0.472 0.234 0.173 0.176 0.177 1.000

表 3 远志属7种药用植物的遗传距离 Table 3 Genetic distances among seven medicinal plants in Polygala L.

基于ITS1和ITS2序列，采用NJ法构建了系统发育树，经1 000次自举检测，结果（图 1）表明，亲缘关系较近的卵叶远志与远志处于同一分支，并得到100%支持；瓜子金与小花远志聚为一支，支持率中等（63%）。与它们遗传距离较远的蓼叶远志、华南远志、肾果小扁豆依次各自成一支。

图 1 基于ITS1和ITS2序列构建的系统发育树Fig. 1 Phylogenetic tree based on ITS1 and ITS2 sequences

ITS 序列分析技术具有技术简单、结果准确、重复性好等优点，近年来广泛应用于药用植物鉴定，是药学研究中的一种重要分子标记^[16]。其中ITS2被认为比ITS1具有更多的信息位点，具有更高的鉴定效率^{[17, 18]}。但本研究并不支持这一结论，ITS1序列中的信息位点占总位点数的10.32%略高于ITS2 的7.76%。

本研究以7种远志属药用植物为材料，利用PCR技术分离、测定了其中5种的ITS1、ITS2序列，并提交至NCBI数据库，丰富了GenBank数据库中远志属植物的序列信息。卵叶远志和远志同为药材远志的基源植物^[19]，两者在形态上十分相似，药材也较难区别，基于ITS序列建立的系统发育树也支持这一观点，二者是7种药用植物中遗传距离最小的。ITS序列可用于植物种间、属间和科内的系统发育与分类，本研究中，远志属植物在ITS序列上存几个到几十个碱基的差异，变异位点和信息位点丰富，ITS序列可作为远志属7种药用植物之间鉴定的分子标记。