中草药  2015, Vol. 46 Issue (4): 490-495
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引用本文doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.04.006
宋亚玲, 王红梅, 倪付勇, 王雪晶, 赵祎武, 黄文哲, 王振中, 萧伟. 金银花中酚酸类成分及其抗炎活性研究[J]. 中草药, 2015, 46(4): 490-495.
SONG Ya-ling, WANG Hong-mei, NI Fu-yong, WANG Xue-jing, ZHAO Yi-wu, HUANG Wen-zhe, WANG Zhen-zhong, XIAO Wei. Study on anti-inflammatory activities of phenolic acids from Lonicerae Japonicae Flos[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2015, 46(4): 490-495.
金银花中酚酸类成分及其抗炎活性研究
宋亚玲1,2, 王红梅1,2, 倪付勇1,2, 王雪晶1,2, 赵祎武1,2, 黄文哲1,2, 王振中1,2, 萧伟1,2     
1. 江苏康缘药业股份有限公司, 江苏 连云港 222000;
2. 中药制药过程新技术国家重点实验室, 江苏 连云港 222000
收稿日期: 2014-12-11;
基金项目： 科技部重大新药创制项目:现代中药创新集群与数字制药技术平台(2013ZX09402203)
作者简介：宋亚玲, 女, 工程师, 从事天然产物化学研究.Tel:(0518)81152323E-mail:songyaling@yeah.net
通讯作者：萧伟, 男, 研究员级高级工程师, 博士, 研究方向为中药新药的研究与开发.Tel:(0518)81152367 E-mail:kanionlunwen@163.com
摘要：目的 研究金银花Lonicerae Japonicae Flos中酚酸类成分及其抗炎活性.方法 采用硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱等方法分离纯化,根据理化性质和波谱数据进行结构鉴定;采用脂多糖(LPS)诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症反应模型,考察金银花中酚酸类成分对巨噬细胞经LPS刺激后产生的炎症因子 [NO、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及白细胞介素-6(IL-6)] 的影响,评价其抗炎活性.结果 从金银花醋酸乙酯部位中分离得到12个化合物,包括8个酚酸、3个环烯醚萜苷和1个黄酮类成分,分别鉴定为新绿原酸(1)、隐绿原酸(2)、3,5-二咖啡酰奎宁酸(3)、3,4-二咖啡酰奎宁酸(4)、4,5-二咖啡酰奎宁酸(5)、绿原酸(6)、咖啡酸(7)、咖啡酸甲酯(8)、断氧化马钱子苷(9)、裂环马钱苷(10)、獐芽菜苷(11)和木犀草素(12).对其中的酚酸类化合物1～8进行了体外抗炎活性实验,结果表明,化合物1～8对LPS刺激的巨噬细胞炎症因子均具有不同程度的抑制作用.结论 酚酸类成分是金银花的主要抗炎活性成分之一,其中化合物7活性最强.
关键词： 金银花     酚酸类     抗炎活性     3,5-二咖啡酰奎宁酸     绿原酸     咖啡酸     裂环马钱苷    
Study on anti-inflammatory activities of phenolic acids from Lonicerae Japonicae Flos
SONG Ya-ling1,2, WANG Hong-mei1,2, NI Fu-yong1,2, WANG Xue-jing1,2, ZHAO Yi-wu1,2, HUANG Wen-zhe1,2, WANG Zhen-zhong1,2, XIAO Wei1,2    
1. Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co., Ltd., Lianyungang 222000, China;
2. State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process, Lianyungang 222000, China
Abstract: Objective To study the anti-inflammatory of phenolic acids from Lonicerae Japonicae Flos. Methods The compounds in the EtOAc fraction were isolated and purified by silica gel and Sephadex LH-20 column chromatographies, and preparative HPLC as well. The structures were identified by various spectroscopic data such as ESI-MS, 1H-NMR, and 13C-NMR data. The anti-inflammatory effects were evaluated by a in vitro model of LPS-stimulated RAW264.7 macrophages. Results Eight phenolic acids, three iridoids, and one flavonoid were isolated from the extracts of Lonicerae Japonicae Flos and identified as 5-O-caffeoylquinic acid (1), 4-O-caffeoylquinic acid (2), 3,5-di-O-caffeoylquinic acid (3), 3,4-di-O-caffeoylquinic acid (4), 4,5-di-O-caffeoylquinic acid (5), chlorogenic acid (6), caffeic acid (7), methyl caffeate acid (8), secoxyloganin (9), secologanoside (10), sweroside (11), and luteolin (12). Compounds 1-8 showed the anti-inflammatory activity in different degrees. Conclusion Phenolic acids are the main anti-inflammatory constituents in Lonicerae Japonicae Flos. Caffeic acid shows the strongest activity in vitro.
Key words: Lonicerae Japonicae Flos     phenolic acids     anti-inflammatory activity     3,5-di-O-caffeoylquinic acid     chlorogenic acid     caffeic acid     secologanoside    

金银花Lonicerae Japonicae Flos为忍冬科（Caprifoliaceae）植物忍冬Lonicera japonica Thunb. 的干燥花蕾或初开的花，药用历史悠久，为常用中药之一。金银花味甘，性寒，归肺、心、胃经，具有清热解毒、疏散风热之功效，用于治疗痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温病发热等症[1]，主要含有挥发油类、有机酸类、黄酮类、三萜皂苷类和环烯醚萜类等多种成分[2, 3, 4, 5]。据报道，金银花具有较强的的抗炎作用[6, 7, 8]，然而，这些研究的主要对象大部分都是金银花提取物，涉及金银花单体化合物的只有少数，根据文献报道，金银花三萜皂苷忍冬苦苷A、忍冬苦苷C均具有抗炎作用，效果与阿司匹林相当[9]；金银花挥发油也具有显著的抗炎活性[10]。本实验从金银花醇提物的醋酸乙酯部位中分离鉴定了8个酚酸、3个环烯醚萜苷和1个黄酮类成分，分别为新绿原酸（5-O-caffeoylquinic acid，1）、隐绿原酸（4-O-caffeoylquinic acid，2）、3,5-二咖啡酰奎宁酸（3,5-di-O-caffeoylquinic acid，3）、3,4-二咖啡酰奎宁酸（3,4-di-O-caffeoylquinic acid，4）、4,5-二咖啡酰奎宁酸（4, 5-di-O-caffeoylquinic acid，5）、绿原酸（chlorogenic acid，6）、咖啡酸（caffeic acid，7）、咖啡酸甲酯（methyl caffeate acid，8）、断氧化马钱子苷（secoxyloganin，9）、裂环马钱苷（secologanoside，10）、獐芽菜苷（sweroside，11）和木犀草素（luteolin，12）。采用脂多糖（LPS）诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症反应模型，对其中的酚酸类化合物1～8进行了抗炎活性测定，化合物对LPS刺激的巨噬细胞炎症因子均具有不同程度的抑制作用，化合物7活性最高。并对活性成分的构效关系进行了初步探讨，为进一步研究其抗炎作用机制以及金银花的临床应用提供依据。

1 仪器与材料

Reveleris中低压制备色谱仪（美国GRACE公司），配四元泵、UV、ELSD检测器；Agilent 1260高效液相色谱仪（美国Agilent公司），配自动进样器、四元泵、MWD检测器；Bruker-AV-400型核磁共振光谱仪（德国布鲁克公司）；AE240电子分析天平（瑞士Mettler公司）；SW-CJ-2F型超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；CO2培养箱（Thermo scientific 3100）；倒置显微镜（OLYPΜS，CKX41SF）；96孔细胞培养板、细胞培养瓶（美国Costar）；FlexStation 3钙流工作站（美谷分子仪器）；移液枪（Eppendorf）；BXM-30R立式压力蒸气灭菌锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；LD4-2A离心机（北京众益中和生物技术有限公司）；细胞自动计数仪（Invitrogen，Cl028）。

柱色谱硅胶（200～300目）、薄层色谱硅胶G（青岛海洋化工厂），Sephadex LH-20（Pharmacia公司），乙腈（色谱纯，Oceanpak公司，瑞典），95%乙醇（食用级，连云港长和酒业有限公司），水（双蒸水，自制），甲酸、醋酸乙酯（分析纯，南京化学试剂有限公司）；DMEM培养基、胎牛血清（FBS，Gibco公司），LPS、DMSO（Sigma公司），CCK-8试剂盒（上海贝博生物公司）；NO检测试剂盒（碧云天生物技术研究所）；多因子检测试剂盒（BIO-RAD公司）。

金银花药材购自安徽亳州药材市场，经南京中医药大学吴启南教授鉴定为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb. 的干燥花；小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞株购于中国科学院典型培养物保藏中心上海细胞库。

2 方法 . 2.1 提取与分离

取金银花药材10.0 kg，依次用10、8倍量70%乙醇回流提取2次，每次2 h，合并提取液，滤过，滤液减压浓缩得流浸膏3.5 kg，浸膏加水悬浮，依次用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取，分别得到石油醚部位（121 g）、醋酸乙酯部位（254 g）、正丁醇部位（380 g）。取醋酸乙酯部位经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇（100∶0→0∶1）进行梯度洗脱，经TLC检识合并得到8个部位Fr. 1～8。Fr. 3经Sephadex LH-20、制备液相色谱分离得到化合物2（1.6 g）、8（20 mg）、9（17 mg）、10（0.8 g）；Fr. 5采用Sephadex LH-20、制备液相色谱纯化，得到化合物1（21 mg）、3（14 mg）、4（19 mg）、5（23 mg）；Fr. 7经硅胶柱色谱、RP18和Sephadex LH-20色谱纯化后得化合物6（32 mg）、7（17 mg）、11（26 mg）、12（9 mg）。

2.2 抗炎活性研究 2.2.1 供试品配制

取化合物1～8，分别用DMSO配制成50 mg/mL储存液，加药时用无血清DMEM培养基稀释成50 μg/mL的供试品药液。

2.2.2 细胞培养

RAW264.7细胞用含10% FBS DMEM培养，置5% CO2、37 ℃、饱和湿度的细胞培养箱中培养。待细胞生长至对数生长期进行传代，2～3 d传代1次。取至少3代后的细胞用于实验。

2.2.3 化合物对RAW264.7细胞生长的影响

取对数生长期的RAW264.7细胞0.25%胰酶-0.02% EDTA消化约2 min后，弃胰酶，用10% FBS DMEM培养基中和胰酶作用，轻轻吹打成单细胞悬液，离心弃上清，用完全培养基重悬细胞并计数后，调整细胞悬液至3×105/mL，按每孔100 μL接种至96孔培养板，37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养24 h，吸尽每孔上清，每孔加入100 μL无血清DMEM培养基，随机分为对照组、化合物1～8组（50 μg/mL），加入相应药物后，每组设3个复孔，5% CO2、37 ℃、饱和湿度条件下培养24 h后，提前4 h按每孔10 μL加入CCK-8，4 h后酶标仪检测450 nm处吸光度值（A450）。

2.2.4 炎症因子检测

取对数生长期的RAW264.7细胞0.25%胰酶-0.02% EDTA消化约2 min后，弃胰酶，用10% FBS DMEM培养基中和胰酶作用，轻轻吹打成单细胞悬液，离心弃上清液，用完全培养基重悬细胞并计数后，调整细胞悬液至3×105/mL，按每孔100 μL接种至96孔培养板，37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养24 h，吸尽每孔上清液，每孔加入100 μL无血清DMEM培养基，随机分为对照组、LPS（1 μg/mL）组、LPS（1 μg/mL）＋化合物1～8（50 μg/mL）组，加入相应药物后，每组设3个复孔，5% CO2、37 ℃、饱和湿度条件下培养24 h后，取上清液用于NO、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）等炎症因子的检测。

3 结果 3.1 结构鉴定

化合物1：白色粉末，mp 193～195 ℃，ESI-MS m/z: 353 [M－H]−。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 1.86～2.01 (4H, m, H-2, 6), 3.78 (1H, m, H-4), 4.12 (1H, m, H-3), 5.21 (1H, m, H-5), 6.26 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-8′), 6.77 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5′), 6.95 (1H, dd, J = 2.0, 8.0 Hz, H-6′), 7.05 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2′), 7.50 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-7′)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 35.1 (C-2), 38.6 (C-6), 70.3 (C-3), 70.6 (C-4), 67.3 (C-5), 72.6 (C-1), 114.5 (C-2′), 114.9 (C-8′), 115.8 (C-5′), 121.1 (C-6′), 125.7 (C-1′), 144.3 (C-3′), 144.7 (C-7′), 145.7 (C-4′), 166.3 (C-9′), 175.4 (-COOH)。以上数据与文献报道基本一致[11]，故鉴定化合物1为新绿原酸。

化合物2：白色粉末，ESI-MS m/z: 353 [M－H]−。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.60 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-3′), 7.04 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-5′), 6.95 (1H, dd, J = 2.0, 8.0 Hz, H-9′), 6.77 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-8′), 6.30 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-2′), 4.90 (1H, m, H-4), 2.40 (2H, m, H-6), 2.14 (2H, m, H-2)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 177.3 (C-7), 165.6 (C-1′), 148.6 (C-7′), 145.8 (C-6′), 145.6 (C-3′), 125.5 (C-4′), 121.6 (C-9′), 115.9 (C-8′), 114.9 (C-2′), 113.9 (C-5′), 75.8 (C-1), 71.5 (C-5), 68.6 (C-4), 62.9 (C-3), 36.6 (C-2), 35.8 (C-6)。以上数据与献报道照基本一致[12]，故鉴定化合物2为隐绿原酸。

化合物3：白色无定形粉末，ESI-MS m/z: 515 [M－H]−。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 2.13～2.34 (4H, m, H-2, 6), 3.98 (1H, dd, J = 3.4, 7.6 Hz, H-4), 5.39 (1H, ddd, J = 4.5, 8.2, 10.8 Hz, H-5), 5.43 (1H, m, H-3), 6.26 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-8′), 6.33 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-8″), 6.77 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-5′), 6.78 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-5″), 6.96 (1H, dd, J = 2.0, 8.2 Hz, H-6′), 6.97 (1H, dd, J = 2.0, 8.0 Hz, H-6″), 7.06 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2′), 7.07 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2″), 7.56 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-7′), 7.60 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-7″)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 36.3 (C-2), 37.5 (C-6), 70.6 (C-4), 72.4 (C-3), 72.8 (C-5), 74.8 (C-1), 115.4 (C-8″), 115.6 (C-8′), 115.8 (C-2′, 2″), 116.7 (C-5′, 5″), 123.1 (C-6′, 6″), 127.9 (C-1′, 1″), 146.8 (C-3′, 3″), 147.4 (C-7′), 147.6 (C-7″), 149.8 (C-4′, 4″), 168.5 (C-9′), 168.9 (C-9″), 175.8 (-COOH)。以上数据与文献报道基本一致[13]，故鉴定化合物3为3,5-二咖啡酰奎宁酸。

化合物4：白色粉末，ESI-MS m/z: 515 [M－H]−。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 2.15～2.30 (4H, m, H-2, 6), 4.39 (1H, m, H-5), 5.13 (1H, dd, J = 3.1, 9.0 Hz, H-4), 5.63 (1H, m, H-3), 6.17 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-8′), 6.27 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-8″), 6.74 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-5′), 6.76 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-5″), 6.90 (1H, dd, J = 2.0, 8.2 Hz, H-6′), 6.91 (1H, dd, J = 2.0, 8.0 Hz, H-6″), 7.01 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2′), 7.02 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2″), 7.53 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-7′), 7.58 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-7″)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 38.4 (C-6), 39.4 (C-2), 68.9 (C-3), 69.4 (C-5), 75.8 (C-4), 76.1 (C-1), 114.7 (C-8′), 114.8 (C-8″), 115.2 (C-2′, 2″), 116.5 (C-5′, 5″), 123.1 (C-6′, 6″), 127.7 (C-1′, 1″), 146.8 (C-3′, 3″), 147.6 (C-7′), 147.9 (C-7″), 149.7 (C-4′, 4″), 168.2 (C-9′), 168.6 (C-9″), 176.8 (-COOH)。以上数据与文献报道基本一致[14]，故鉴定化合物4为3,4-二咖啡酰奎宁酸。

化合物5：淡黄色粉末，ESI-MS m/z: 515 [M－H]−。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 1.94～2.34 (2H, m, H-2), 4.35 (1H, m, H-3), 5.02 (1H, dd, J = 3.2, 8.2 Hz, H-4), 5.63 (1H, ddd, J = 4.5, 8.2, 10.8 Hz, H-5), 1.94～2.34 (2H, m, H-6), 7.02 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2′), 6.74 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5′), 6.88 (1H, dd, J = 2.0, 8.0 Hz, H-6′), 7.53 (1H, d, J = 15.9 Hz, H-7′), 6.24 (1H, d, J = 15.9 Hz, H-8′), 7.04 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2″), 6.76 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5″), 6.89 (1H, dd, J = 2.0, 8.0 Hz, H-6″), 7.59 (1H, d, J = 15.9 Hz, H-7″), 6.28 (1H, d, J = 15.9 Hz, H-8″)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 38.6 (C-2), 39.5 (C-6), 69.4 (C-3), 69.5 (C-5), 75.9 (C-4), 76.2 (C-1), 114.8 (C-8″), 114.9 (C-8′), 115.4 (C-2′, 2″), 116.7 (C-5′, 5″), 123.1 (C-6′, 6″), 127.6 (C-1′, 1″), 146.8 (C-3′, 3″), 147.8 (C-7′), 147.9 (C-7″), 149.8 (C-4′, 4″), 168.5 (C-9′), 168.9 (C-9″), 175.8 (-COOH)。以上数据与文献报道基本一致[15]，故鉴定化合物5为4,5-二咖啡酰奎宁酸。

化合物6：白色粉末，mp 207～209 ℃，ESI-MS m/z: 353 [M－H]−。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.55 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-7′), 7.04 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2′), 6.96 (1H, dd, J = 8.4, 2.0 Hz, H-6′), 6.77 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5′), 6.25 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-8′), 5.32 (1H, m, H-3), 4.15 (1H, m, H-5), 3.72 (1H, dd, J = 8.4, 3.2 Hz, H-4), 2.23～2.04 (4H, m, H-2, 6)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 177.8 (COOH), 169.4 (C-9′), 150.4 (C-4′), 147.9 (C-7′), 147.6 (C-3′), 128.6 (C-1′), 123.8 (C-6′), 117.2 (C-5′, 8′), 116.0 (C-2′), 76.9 (C-1), 74.3 (C-4), 72.8 (C-5), 72.1 (C-3), 39.6 (C-2), 39.0 (C-6)。以上数据与文献报道一致[16]，故鉴定化合物6为绿原酸。

化合物7：浅黄色粉末，ESI-MS m/z: 179 [M－H]−。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 6.18 (1H, d, J = 15.9 Hz, H-8), 6.76 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5), 6.92 (1H, dd, J = 2.1, 8.4 Hz, H-6), 7.01 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2), 7.52 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-7)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 127.9 (C-1), 115.6 (C-2), 146.8 (C-3), 149.3 (C-4), 116.6 (C-5), 122.8 (C-6), 147.0 (C-7), 115.0 (C-8), 171.2 (C-9)。以上数据与文献报道基本一致[11]，故鉴定化合物7为咖啡酸。

化合物8：白色针晶（甲醇），ESI-MS m/z: 193 [M－H]−。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 7.44 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-7), 7.03 (1H, d, J =2.0 Hz, H-2), 6.98 (1H, dd, J = 2.0, 8.0 Hz, H-6), 6.77 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5), 6.25 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-8), 3.67 (3H, s, -OCH3)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 125.9 (C-1), 116.5 (C-2), 146.4 (C-3), 149.3 (C-4), 121.6 (C-5), 115.3 (C-6), 145.6 (C-7), 114.0 (C-8), 167.6 (C-9), 51.6 (-OCH3)。以上数据与文献报道基本一致[17]，故鉴定化合物8为咖啡酸甲酯。

化合物9：白色粉末，1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 7.47 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-3), 5.49 (1H, d, J = 3.8 Hz, H-1), 4.66 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-1′), 3.68 (3H, s, -OCH3), 5.65 (1H, ddd, J = 10.1, 9.9, 17.1 Hz, H-8), 2.95 (1H, dd, J = 16.5, 4.9 Hz, H-6), 2.27 (1H, dd, J = 9.0, 16.5 Hz, H-6), 2.82 (1H, m, H-9)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 176.7 (C-7), 169.4 (C-11), 154.1 (C-3), 135.0 (C-8), 121.0 (C-10), 110.6 (C-4), 100.5 (C-1′), 98.1 (C-1), 78.9 (C-5′), 78.5 (C-3′), 75.1 (C-2′), 72.0 (C-4′), 63.2 (C-6′), 52.1 (-OCH3), 45.8 (C-9), 35.6 (C-6), 29.1 (C-5)。以上数据与文献报道基本一致[18]，故鉴定化合物9为断氧化马钱子苷。

化合物10：白色粉末，ESI-MS m/z: 389 [M－H]−。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 5.31 (1H, d, J = 3.6 Hz, H-1), 7.32 (1H, s, H-3), 3.05 (1H, m, H-5), 2.89 (1H, dd, J = 16.6, 5.0 Hz, H-6a), 2.10 (1H, dd, J = 16.8, 9.6 Hz, H-6b), 5.49 (1H, m, H-8), 2.67 (1H, m, H-9), 5.12 (1H, s, H-10a), 5.08 (1H, m, H-10b), 4.50 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-1′)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 97.5 (C-1), 153.3 (C-3), 110.1 (C-4), 28.4 (C-5), 34.9 (C-6), 176.4 (C-7), 134.5 (C-8), 45.2 (C-9), 120.3 (C-10), 170.5 (C-11), 99.8 (C-1′), 74.5 (C-2′), 78.5 (C-3′), 71.5 (C-4′), 78.3 (C-5′), 62.9 (C-6′)。以上数据与文献报道基本一致[18]，故鉴定化合物10为裂环马钱苷。

化合物11：白色粉末，ESI-MS m/z: 357 [M－H]−。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 5.56 (1H, d, J = 7.3 Hz, H-1), 7.60 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-3), 3.14 (1H, m, H-5), 1.75 (1H, m, H-6a), 1.69 (1H, m, H-6b), 4.40 (1H, m, H-7a), 4.30 (1H, m, H-7b), 5.56 (1H, m, H-8), 2.70 (1H, ddd, J = 1.6, 5.6, 9.4 Hz, H-9), 5.30 (1H, m, H-10a), 5.26 (1H, m, H-10b), 4.68 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-1′)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 98.1 (C-1), 154.2 (C-3), 106.1 (C-4), 28.4 (C-5), 25.9 (C-6), 69.7 (C-7), 133.5 (C-8), 43.9 (C-9), 120.6 (C-10), 168.5 (C-11), 99.5 (C-1′), 75.0 (C-2′), 77.9 (C-3′), 71.4 (C-4′), 78.5 (C-5′), 62.9 (C-6′)。以上数据与文献报道基本一致[18]，故鉴定化合物11为獐芽菜苷。

化合物12：淡黄色粉末，ESI-MS m/z: 285 [M－H]−。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 12.98 (1H, s, 5-OH), 7.43 (1H, dd, J = 2.0, 8.4 Hz, H-6′), 7.41 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2′), 6.90 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5′), 6.67 (1H, s, H-3), 6.45 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8), 6.20 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 94.3 (C-8), 99.3 (C-6), 103.3 (C-3), 104.2 (C-10), 113.8 (C-5′), 116.5 (C-2′), 119.5 (C-6′), 122.0 (C-1′), 146.2 (C-4′), 150.2 (C-2′), 157.8 (C-3′), 161.9 (C-9), 164.4 (C-5), 164.6 (C-7), 182.1 (C-4)。以上数据与文献报道基本一致[19]，故鉴定化合物12为木犀草素。

3.2 抗炎活性

在LPS刺激RAW264.7细胞的炎症反应中，与对照组比较，化合物1～8在50 μg/mL的质量浓度下对RAW264.7细胞生长均无明显影响。在筛选结果中，化合物1～8对LPS刺激RAW264.7细胞释放NO、TNF-α和IL-6均具有不同程度的抑制作用，显示了较好的体外抗炎活性，其中化合物7对炎症因子的抑制作用最强，结果见表 1。

表 1 化合物1～8对LPS刺激RAW264.7细胞产生NO、TNF-α和IL-6的影响 (x±s, n = 3) Table 1 Effects of different compounds 1—8 on production of NO, TNF-α, and IL-6 in LPS-stimulated RAW264.7 cells (x±s, n = 3)
4 讨论

炎症是人体对感染、体内抗原抗体结合以及机械损伤的一种自身反应，众多种类的细胞以及活性成分参与了这个过程。适度的炎症反应对人体是有益的，而过度的或持续的炎症反应却会引起组织损伤和诱发疾病。诱发炎症的因素有很多，如烧伤、化学刺激、物理损伤以及毒素等。其中，LPS是细菌感染性炎症反应中最主要的促炎因子，LPS可诱导单核巨噬细胞等炎症细胞合成并释放多种炎症因子，诸如NO、TNF-α、IL-6等炎症介质和炎症因子，导致机体出现一系列的病理生理反应，严重时可引起感染性休克、全身炎症反应综合征、多器官功能衰竭甚至死亡[20, 21, 22]。

金银花作为常用清热解毒中药，具有很好的抗炎作用[8]。本研究结果表明金银花中酚酸类成分对LPS诱导RAW264.7细胞释放NO、TNF-α和IL-6均具有不同程度的抑制作用，进一步证实了酚酸类成分是金银花抗炎作用的有效成分之一，其中，在50 μg/mL的质量浓度下，化合物7对LPS刺激的RAW264.7细胞释放NO、TNF-6和IL-6的抑制作用最强，其次是化合物8，说明游离的咖啡酸及其酯类化合物的抗炎活性最强；其次，二咖啡酰奎宁酸类化合物对IL-6的抑制作用强弱为化合物5＞化合物3＞化合物4，说明咖啡酰基取代位置和空间位阻对其活性有很大的影响。综上可知，咖啡酰基是金银花中酚酸类成分发挥抗炎活性的重要基团，而且取代基的位置及空间构型也会对其活性产生一定的影响，但是抗炎作用的强弱与剂量之间的关系还需要进一步的研究。

我国金银花植物资源丰富，金银花化学成分复杂、药理作用多样，临床上已有很多形式的金银花制剂[23]，另外，近年来金银花还被用于保健饮料、牙膏以及化妆品等[24]中，这些大都与其清热解毒、抗菌消炎等功效有关，而本实验结果也证实酚酸类成分是金银花发挥抗炎作用的有效成分。因此，加强对金银花化学成分及其各类成分的药理活性研究，为金银花的进一步开发及临床应用提供参考。

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