裂叶独活Heracleum millefolium Diels为伞形科（Umbelliferae）独活属，又名藏当归（青海）、千叶独活（秦岭植物志），产于我国西藏、青海、甘肃、四川、云南，属于高海拔药材。裂叶独活传承了藏药效果快、药力强、纯净、天然、无污染的特点，以干燥全草入药，味苦、辛，性平，消散肿胀、破除癥结痞块。饶高雄等^[1]从裂叶独活中分离鉴定了11个化学成分，其中香豆素类成分有4个。文献调研显示裂叶独活化学成分研究报道较少，因此，进一步阐明裂叶独活中的化学成分，对研究其药效物质基础、质量控制、现代藏药的开发等具有重要意义。查阅大量文献，未见关于裂叶独活活性成分的研究。据报道，香豆素成分广泛存在于独活属植物中，其中二氢欧山芹醇当归酸酯具有很好的抗炎、镇痛效果^[2]；蛇床子素在癌症和肝脏、脑部疾病等方面发挥重要作用^{[3, 4, 5]}；二氢欧山芹醇乙酸酯可以明显抑制大鼠体外血小板的聚集^[6]。

高速逆流色谱（high-speed countercurrent chromatography，HSCCC）是20世纪80年代发展起来的一种连续高效的液-液分配色谱分离技术，被广泛应用于中药、食品、抗生素、蛋白质和多肽等分离制备方面^{[7, 8, 9, 10, 11, 12, 13]}。传统的制备分离单体方法存在耗时、溶剂消耗量大，而且污染环境等缺点，HSCCC具有无污染、无吸附、一次制备量大、操作简单、耗材低廉、所用溶剂少、分离时间短、制备样品纯度高等优点，甚至可用于制备高质量分数的标准品^[14]。

本研究中采用溶剂提取法和液-液萃取法得到裂叶独活粗提物，以此粗提物为原料利用HSCCC进行化学成分的分离纯化，得到3种香豆素类化合物蛇床子素、二氢欧山芹醇乙酸酯和二氢欧山芹醇当归酸酯，质量分数均达到96.0%以上。该法简单、快速、高效，分离纯度高。目前还未见关于利用HSCCC法从裂叶独活中一次性分离纯化3种高质量分数的香豆素类成分的报道。该研究结果可为裂叶独活的药理药效、物质基础研究和临床应用研究提供有用参考和信息，同时也为香豆素类成分的制备分离提供一种快速、简单、高效的方法。

TBE-300C型高速逆流色谱仪，上海同田生物技术股份有限公司；Agilent1260型自动进样高效液相色谱仪、Agilent1260DAD检测器、Agilent C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），美国安捷伦公司；Bruke Avance 400型超导核磁共振仪、VERTEX70型红外光谱仪，瑞士布鲁克公司；X-4A数字熔点测定仪，北京福凯仪器有限公司；N7001型旋转蒸发仪，厦门精艺兴业科学仪器有限公司；Triple QUAD 5500，ABsciex公司；高速多功能粉碎机，永康市绿可食品有限公司；SZ-93A型自动双重纯水蒸馏器，上海亚荣生化仪器厂；Milli-Q超纯水制备系统，美国Millipore公司；真空干燥箱，上海恒科学仪器有限公司；万分之一电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司。

石油醚（AR），沸程60～90 ℃，天津市恒兴化学试剂制造有限公司；正己烷（AR）、醋酸乙酯（AR）、95%乙醇（AR），上海泰坦科技公司，甲醇（AR），上海试一化学试剂有限公司；HPLC流动相中所使用的水均为Milli-Q超纯水，其他用水为双蒸水；甲醇为色谱级，美国Tedia试剂公司。

裂叶独活根采集于拉萨市当雄县，经西藏藏医学院实验标本中心达瓦讲师鉴定为裂叶独活Heracleum millefolium Diels的根，晒干后用于实验。样品保存于江西中医药大学药学院实验标本中心。

将裂叶独活在45 ℃下真空干燥12 h，粉碎过60目筛，称取1 000 g，用5倍量95%乙醇常温浸泡24 h，重复3次，合并上清液。将上清液减压浓缩得浸膏，加适量水混悬，用3倍量石油醚萃取5次，合并萃取液，减压浓缩得到20.9 g浸膏，得率为2.1%，常温保存备用。

以试管法结合HPLC法，测定HSCCC溶剂系统的分配系数（K）。取1 mg裂叶独活粗提物溶于上、下相各1 mL的溶剂体系中，振摇，静置，重新分层后，取等量的上、下相溶液分别用HPLC检测I、II、III号峰，用上相峰面积除以下相峰面积即得到K值。HSCCC最佳的K值一般为0.5～2.0，如果K值＞2.0，则目标成分分离时间延长；当K值＜0.5时，目标成分与其他成分重叠而不能分开^[10]，以此为依据，共考察了5个不同体积比的溶剂体系，见表 1。根据K值，选择了第3种溶剂体系。

表 1(Table 1)

表 1 不同溶剂体系3个组分K值 Table 1 K values of three compounds in different solvent systems 溶剂体系 K值 组分I 组分II 组分III 正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水5∶5∶5∶5 0.89 3.72 4.58 正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水5∶5∶6∶4 0.57 0.67 0.81 正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水1.5∶2∶2.5∶1.5 0.68 1.17 1.36 石油醚-醋酸乙酯-甲醇-水5∶5∶5∶5 0.51 3.25 3.78 石油醚-醋酸乙酯-甲醇-水5∶5∶6∶4 0.32 2.47 3.45

表 1 不同溶剂体系3个组分K值 Table 1 K values of three compounds in different solvent systems

预实验结果表明，当流动相体积流量为2 mL/min时，III号峰完全出来共用了将近330 min，实验时间太长，尝试将体积流量改为3 mL/min，拟达到不影响分离效果的前提下缩短实验时间的目的，实验时间缩短为250 min；固定进样体积为20 mL，依次加大进样质量浓度为5、10、15、20、25、30 mg/mL，发现以大于15 mg/mL为进样质量浓度时会有固定相流失，所以实验选择进样质量浓度为15 mg/mL，尽量增加一次实验的制备量；升高温度有利于增加固定相的保留率，但是也会让两相的互渗性增加，而且主机里的管路容易老化，而降低仪器寿命，因此保持循环水温度为25 ℃；转速越快，分离效果越好，但是转速太快又会缩短主机里的皮带寿命，综合考虑选择转速为850 r/min。经优化后，实验能够达到最优的分离效果，且达到节省时间和保护仪器的目，固定相保留率达到73%。

以正己烷-醋酸乙酯-乙醇-水（1.5∶2∶2.5∶1.5）作为溶剂体系。将这4种溶剂按比例混合后，强烈震摇，静置分离上下相并超声脱气20 min。开启循环水泵恒温装置，使温度保持在25 ℃，紫外检测吸收波长为323 nm。将上相（固定相）以30 mL/min的体积流量泵入主机，泵满后，正转，调转速为850 r/min，以3 mL/min的体积流量把下相（流动相）泵入主机。当只有下相从检测器流出时，及体系达到流体动力学平衡时，计算保留率为73%。取上、下相各10 mL溶解300 mg裂叶独活粗提物浸膏溶液由进样阀注入分离管路。根据HSCCC色谱图手动收集各色谱峰馏份，得到裂叶独活粗提物的HSCCC色谱图见图 1。所接收馏份在50 ℃下减压浓缩、静置滤过得到晶体，待测。

I-二氢欧山芹醇乙酸酯 II-蛇床子素 III-二氢欧山芹醇当归酸酯 I-columbianetin acetate II-osthole III-columbianadin 图 1 裂叶独活粗提取物HSCCC图谱Fig.1 HSCCCof crude extract from H. millefolium

香豆素成分的2个最大紫外吸收区集中在280、350 nm附近^[14]，经HPLC-DAD检测可知，二氢欧山芹醇乙酸酯的最大吸收峰在330 nm附近，蛇床子素的最大吸收峰在320 nm附近，二氢欧山芹醇当归酸酯的最大吸收峰在325 nm附近，综合考虑，实验选择323 nm作为检测波长。将HSCCC所得的3种晶体用甲醇溶解，均制备成质量浓度为100 μg/mL，进样。流动相为甲醇-水（70∶30），体积流量为1.0 mL/min，柱温为20 ℃，检测波长为323 nm，进样量5 μL。用Agilent1260色谱工作站进行质量分数分析。按峰面积归一化法计算质量分数，测定结果为二氢欧山芹醇乙酸酯的质量分数为98.1%，称定质量为6.3 mg，得率为2.1%；蛇床子素质量分数为97.3%，称定质量为10.6 mg，得率为3.5%；二氢欧山芹醇当归酸酯质量分数为96.9%，称定质量为6.4 mg，得率为2.1%。3种晶体的HPLC图见图 2。

I-二氢欧山芹醇乙酸酯 II-蛇床子素 III-二氢欧山芹醇当归酸酯 I-columbianetin acetate II-osthole III-columbianadin 图 2 HSCCC分离的3种晶体的HPLC图Fig.2 HPLCof three crystals obtained by HSCCC

组分I：白色粒状结晶（甲醇-水70∶30），mp 133～134 ℃；IR_vmax^KBr(cm⁻¹): 1 728（内酯环）, 1 614, 1 580, 1 488, 1 453, 841；ESI-MS m/z: 288 [M]⁺ (甲醇), 228, 213, 203, 187, 176, 159, 131, 77, 59；¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 6.21 (1H, d, J = 18.0 Hz, H-3), 7.65 (1H, d, J = 9.6 Hz, H-4), 7.28 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5), 6.76 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-6), 3.30 (2H, dd, J = 7.6, 7.6 Hz, H-3′), 5.15 (1H, dd, J = 18.0, 16.4 Hz, H-2′), 1.58 (3H, s, H-4′), 1.52 (3H, s, H-5′),2.01 (3H, s, OAc-CH₃)；¹³C-NMR (100 MHz, CDCl₃) δ: 170.1 (OAc-C＝O),160.8 (C-2), 112.3 (C-3), 143.8 (C-4), 128.8 (C-5), 106.6 (C-6), 163.9 (C-7), 113.4 (C-8), 151.3 (C-9), 113.4 (C-10), 27.6 (C-1′), 88.7 (C-2′), 82.1 (C-3′), 22.1 (C-4′), 22.0 (C-5′), 20.9 (OAc-Me)。以上数据与文献报道基本一致^{[15, 16]}，故鉴定为二氢欧山芹醇乙酸酯。

组分II：无色块状结晶（甲醇-水70∶30），mp 83～84 ℃；IR_vmax^KBr(cm⁻¹): 1 720 (-C＝O), 1 604, 1 562, 1 499 (Ar), 1 251 (-C-O)；ESI-MS m/z: 244 [M]⁺ (甲醇), 229, 213, 201, 159, 131, 103, 89, 77, 63, 51；¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 1.67 (3H, s, H-5′), 1.84 (3H, s, H-4′), 3.52 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-1′), 3.92 (3H, s, OCH₃), 5.22 (1H, m, H-2′), 6.83 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-6), 7.28 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5), 7.61 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-4), 6.23 (1H, d, J = 6.2 Hz, H-3)；¹³C-NMR (100 MHz, CDCl₃) δ: 160.2 (C-2), 113.0 (C-3), 143.6 (C-4), 126.2 (C-5), 107.4 (C-6), 161.2 (C-7), 113.0 (C-8), 152.9 (C-9), 118.1 (C-10), 21.9 (C-1′), 121.2 (C-2′), 132.5 (C-3′), 25.7 (C-4′), 17.8 (C-5′), 56.1 (OCH₃)。以上数据与文献报道基本一致^[15]，鉴定为蛇床子素。

组分III：白色针形结晶（甲醇-水80∶20），mp 114～115 ℃；IR_vmax^KBr(cm⁻¹): 1 710 (内酯环), 1 616, 1 579, 1 491 (Ar), 1 455, 1 385；ESI-MS m/z: 328 [M]⁺ (甲醇), 228, 213, 187, 159, 131, 83, 55, 43；¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 6.21 (1H, d, J = 9.6 Hz, H-3), 7.63 (1H, d, J = 8.3 Hz, H-4), 7.26 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-5), 6.74 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-6), 3.38 (2H, m, H-3′), 5.13 (1H, t, J = 8.0 Hz, H-2′), 1.60 (3H, s, H-4′), 1.64 (3H, s, H-5′), 5.98 (1H, m, H-3″), 1.89 (3H, dd, J = 8.0, 2.0 Hz, 3″-CH₃), 1.67 (3H, s, 2″-CH₃)；¹³C-NMR (100 MHz, CDCl₃) δ: 160.9 (C-2), 113.0 (C-3), 143.8 (C-4), 128.8 (C-5), 106.6 (C-6), 164.0 (C-7), 112.2 (C-8), 151.3 (C-9), 113.5 (C-10), 89.2 (C-2′), 27.6 (C-3′), 82.0 (C-4′), 21.2 (4′-CH₃), 22.3 (4′-CH₃), 167.1 (C-1″), 128.7 (C-2″), 137.3 (C-3″), 15.5 (2″-CH₃), 20.4 (3″-CH₃)。以上数据与文献报道基本一致^{[15, 17]}，鉴定为二氢欧山芹醇当归酸酯。

本实验采用HSCCC法，以正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水（1.5∶2∶2.5∶1.5）作为溶剂体系，一次性从裂叶独活粗提物中分离制备到3种香豆素类化合物，质量分数均高于96%。裂叶独活作为一种藏药，相对研究比较少。二氢欧山芹醇乙酸酯、蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯具有多种药理活性，推断这些成分很有可能是裂叶独活的活性成分。本实验利用HSCCC一次制备这3种香豆素成分量大，这不仅为裂叶独活药性物质基础的研究提供依据，同样为其他香豆素类的分离制备提供参考。同时，本研究充分体现了HSCCC法的简单、高效、快速、制备量大和制备质量分数高等优点。HSCCC拥有众多优势，但其也存在一些缺点，如精密度不如分析性色谱仪器高，溶剂体系选择方法及理论远不如其他色谱成熟等。